黃志等

摘 要 本研究發(fā)展了在線二維陣列式液相色譜系統(tǒng)，對血漿蛋白質(zhì)進(jìn)行分離分析。在線二維陣列式液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行血漿樣品的蛋白質(zhì)水平分離，整個分離過程僅需4 h，并能進(jìn)行高豐度蛋白質(zhì)的快速定位。相比于高豐度蛋白質(zhì)餾分的直接鑒定，經(jīng)蛋白質(zhì)均衡器材料富集后，鑒定得到的低豐度蛋白質(zhì)數(shù)量提高了10倍，低豐度蛋白質(zhì)的損失大幅度減少。本研究將二維陣列色譜分離系統(tǒng)對血漿樣品進(jìn)行完整的分離分析，共鑒定到了1474種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)濃度動態(tài)范圍達(dá)到了7個數(shù)量級。高豐度蛋白質(zhì)餾分中共鑒定到252種蛋白質(zhì)，其中有61種為高豐度蛋白質(zhì)。結(jié)果表明，在線二維陣列式液相色譜系統(tǒng)實現(xiàn)了血漿樣品中高豐度蛋白質(zhì)的快速去除和高豐度蛋白質(zhì)餾分中低豐度蛋白質(zhì)的富集，顯著提高了血漿蛋白質(zhì)的鑒定能力，在其它復(fù)雜樣品的分離分析中具有一定的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 多維色譜； 陣列色譜； 高豐度蛋白質(zhì)； 蛋白質(zhì)均衡器； 血漿

1 引 言

在人類基因組計劃完成后，生命科學(xué)研究領(lǐng)域進(jìn)入了功能基因組時代[1]。血漿是臨床醫(yī)學(xué)中最為常用的檢測樣本，因而成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的熱點對象。但在血漿樣品中，蛋白質(zhì)的濃度分布超過10個數(shù)量級，20種高豐度蛋白質(zhì)的含量占總蛋白質(zhì)的99%以上[2，3]。由于低豐度蛋白質(zhì)在質(zhì)譜鑒定中易受高豐度蛋白質(zhì)掩蓋效應(yīng)的影響，因此必須對血漿樣品中的高豐度蛋白質(zhì)進(jìn)行去除，以提高低豐度蛋白質(zhì)的鑒定能力[4，5]。

相較于免疫親和柱去除高豐度蛋白質(zhì)[6～9]，基于多維液相色譜去除高豐度蛋白質(zhì)是一種通用型的樣品預(yù)處理技術(shù)，一次運行可以去除數(shù)十種未知的高豐度蛋白質(zhì)[10，11]。采用基于該技術(shù)原理的強陽離子交換色譜-反相高效液相色譜（SCX-RPLC）二維分離系統(tǒng)，成功對鼠肝樣品進(jìn)行了蛋白質(zhì)水平的高效分離，一次性去除了58種高豐度蛋白質(zhì)，鑒定得到的中低豐度蛋白質(zhì)數(shù)提升了3倍[10]。本課題組最新構(gòu)建的在線陣列式二維常規(guī)柱液相色譜系統(tǒng)，已成功應(yīng)用于在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行血漿樣品完整蛋白質(zhì)的分離，大幅縮短了樣品的全二維分離時間，對血漿樣品中高豐度蛋白質(zhì)的去除以及血漿樣品的深入研究具有較高的應(yīng)用潛力[12]。

無論采用何種高豐度蛋白質(zhì)去除方法，在去除的高豐度蛋白質(zhì)餾分中都會夾帶一部分與高豐度蛋白質(zhì)有相互作用的低豐度蛋白質(zhì)。因此，從高豐度蛋白質(zhì)餾分中富集低豐度蛋白質(zhì)仍是一個難題[13]。蛋白質(zhì)均衡器技術(shù)[14]具有與各種蛋白質(zhì)相互作用的能力和機(jī)會均等的特點，從而可降低餾分中高低豐度蛋白質(zhì)的范圍，實現(xiàn)低豐度蛋白質(zhì)的富集。血漿樣品經(jīng)過蛋白質(zhì)均衡器材料Ampholine@PM處理后， 鑒定得到的蛋白質(zhì)數(shù)目提高了1倍[15]。

本研究采用在線二維陣列式液相色譜系統(tǒng)對血漿樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)水平的分離，大幅縮短降低二維分離時間，實現(xiàn)高通量快速分離。針對低豐度蛋白質(zhì)在質(zhì)譜鑒定中易被高豐度蛋白質(zhì)掩蓋的問題，血漿樣品在在線二維陣列式色譜分離時，對高豐度蛋白質(zhì)進(jìn)行了快速定位并將高豐度蛋白質(zhì)餾分和低豐度蛋白質(zhì)餾分分別進(jìn)行后續(xù)處理。為了進(jìn)一步提高低豐度蛋白質(zhì)的鑒定效果，采用均衡器材料進(jìn)行高豐度蛋白質(zhì)餾分中低豐度蛋白質(zhì)的富集，為發(fā)現(xiàn)血漿蛋白質(zhì)組中新的疾病診斷標(biāo)志物和藥物靶標(biāo)蛋白質(zhì)提供更為簡便和有潛力的技術(shù)方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

二維陣列液相色譜系統(tǒng)（圖1）在島津2010A色譜系統(tǒng)（日本島津科技公司）基礎(chǔ)上進(jìn)行構(gòu)建。六通切換閥、十通電動順序切換閥、三通、八通分流器均購于美國Valco Instruments公司。第一維SAX柱ProPacTM SAX-10 柱（250 mm × 4.0 mm，10 μm）與保護(hù)柱（10 mm × 4.0 mm， 10 μm）均購自美國Thermo公司； 第二維陣列分離柱XtimateTM C8柱（250 mm × 2.1 mm，5 μm， 30 nm，）與保護(hù)柱（10 mm × 2.1 mm， 5 μm， 30 nm）均購于上海月旭材料科技有限公司。餾分收集采用Probot LC Packing餾分收集裝置（美國Dionex公司），BCA染色測定儀為Epoch超微量微孔板酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）。

三氟乙酸（TFA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、二硫蘇糖醇（DTT）、碘代乙酸鈉（IAA）、經(jīng)TPCK處理過的胰蛋白酶（Trypsin）購于美國Sigma公司； 乙腈（ACN， 德國Merck公司）； BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）； 其它試劑為國產(chǎn)分析純試劑。實驗用高純水經(jīng)Millipore純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備。

人血漿取自上海華山醫(yī)院檢驗科的正常人血漿。血漿經(jīng)2000 g、 4℃離心15 min，取上清液，分裝，于-80℃保存待用。血漿通過BCA濃度測定法所得濃度為61.2 mg/mL。

2.2 血漿的陣列式二維色譜分離

2.2.1 血漿樣品SAX分離 流動相A：10 mmol/L Tris-HCl， pH 8.0； 流動相B：10 mmol/L Tris-HCl， 0.5 mol/L NaCl， pH 8.0。血漿用A相稀釋6倍后進(jìn)樣100 μL。流速為0.5 mL/min，紫外檢測波長為215 nm。第一維SAX分離梯度為：0 min， 0% B； 5 min， 0% B； 15 min， 10% B； 45 min， 26% B； 70 min， 40% B； 90 min， 67% B； 90.1 min， 100% B； 100 min， 100% B； 100.1 min， 0 %B； 150 min， 0% B。SAX分離得到的餾分通過十通閥轉(zhuǎn)移到第二維反相預(yù)柱上，閥切換程序為：0～19 min，反相柱1（Col. 1）； 19～35 min，反相柱5（Col. 5）； 35～68 min，反相柱2（Col. 2）； 68～73 min，反相柱6（Col. 6）； 73～78 min，反相柱7（Col. 7）； 78～83 min，反相柱8（Col. 8）； 83～100 min，反相柱3（Col. 3）； 100～130 min，反相柱4（Col. 4）。

2.2.2 SAX餾分RP分離 流動相A：5% ACN，95% H2O，0.1% TFA； 流動相B：95% ACN，5% H2O，0.1% TFA。流速為1.6.mL/min。第二維RP分離梯度為：0 min， 0% B； 5 min， 0% B； 15 min， 25% B； 25 min， 33% B； 60 min， 40% B； 80 min， 54% B； 85 min， 67% B； 85.1 min， 100% B； 95 min， 100% B； 95.1 min， 0% B； 110 min， 0% B。餾分收集于96孔板上，間隔為1 min。

2.3 餾分的BCA蛋白質(zhì)定量分析

按照BCA定量試劑盒說明配制BCA染色液，向第二維餾分中加入100 μL BCA染色液/孔，37℃下反應(yīng)30 min后用酶標(biāo)儀進(jìn)行定量檢測。

2.4 均衡器材料處理高豐度蛋白質(zhì)餾分

根據(jù)BCA染色液顯色結(jié)果，選取3個高豐度蛋白質(zhì)區(qū)域分別合并后進(jìn)行ampholine@PM材料實驗。ampholine@PM材料處理餾分的方法在文獻(xiàn)＼[14＼]基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。3 mg ampholine@PM材料加入到溶液中，室溫振蕩2 h。離心除去上清液，用1 mL 10 mmol/L PBS清洗材料3次，每次振蕩5 min，離心5 min。先加入1 mL 2 mol/L NaCl，再加入1 mL 100 mmol/L Gly-HCl（pH=3.0），最后加入1 mL 0.1% TFA/80 %乙腈溶液，每次振蕩20 min，離心5 min，重復(fù)3次，收集合并上清液，即為洗脫液。

2.5 餾分酶解鑒定

第二維剩余餾分根據(jù)染色結(jié)果合并為20個餾分，與均衡器材料所得洗脫液分別凍干后用25 mmol/L NH4HCO3溶解，加入1 mg/mL DTT，60℃下反應(yīng)90 min，冷卻至室溫后加入IAA使其濃度為 20 mmol/L，在室溫下避光反應(yīng)30 min，最后加入1 μg/μL Trypsin，37℃過夜酶解。

Nano-LC-MS/MS分析的色譜分離為微納Acquity UPLC系統(tǒng)（美國Waters 公司），質(zhì)譜儀為LTQ Orbitrap XL質(zhì)譜儀（德國Thermo Scientific公司）。流動相A：0.1% 甲酸（H2O）； B：0.1% 甲酸（ACN）。樣品首在Acclaim PepMap C18柱（75 μm × 15 cm，Thermo Scientific公司）上進(jìn)行梯度分離。線性梯度： 0～90 min，5%～45% B，流速為300 nL/min。噴霧電壓為1.9 kV。質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴型采樣模式，選取最強的10個峰進(jìn)行MS/MS分析。每次掃描的MS范圍為385～2000 Da，Orbitrap的質(zhì)量分辨率為100000。肽段碎裂碰撞能量為35%，動態(tài)排阻范圍為90 s。Xcalibur （version 2.0.7）軟件進(jìn)行質(zhì)譜圖的采集。

2.6 數(shù)據(jù)庫檢索

肽段的數(shù)據(jù)庫搜索用Mascot Daemon軟件（Version 2.3.0，英國Matrix Science公司）對UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫（Taxonomy： Homo sapiens； Released 2014.04.10， with 20264 entries）進(jìn)行搜索。選取包含反向序列的Decoy數(shù)據(jù)庫以降低假陽性的鑒定結(jié)果。肽段電荷數(shù)為+2，+3，+4。酶解方式為Full trypsin （KR） cleavage，漏切位點為至多兩個。氨基酸的固定修飾為半胱氨酸的脲甲基化（Carbamidomethylation）可變修飾為甲硫氨酸的氧化（Oxidation）。碎片離子的偏差設(shè)為0.8 Da，母離子偏差設(shè)為10 ppm。錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）低于1%。蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果為紅色加粗方采信， 以提高鑒定的可靠性。對于肽段鑒定，可信度大于95%可認(rèn)為成功鑒定； 對于蛋白質(zhì)鑒定，可信度大于95%以及得分超過20可認(rèn)為成功鑒定。

3 結(jié)果與討論

3.1 在線二維陣列式液相色譜系統(tǒng)

如圖1所示， 在本研究中，針對血漿蛋白質(zhì)組組成復(fù)雜的特點，在線二維陣列式常規(guī)柱液相色譜系統(tǒng)采用了蛋白質(zhì)負(fù)載量更大的ProPacTM SAX-10常規(guī)色譜柱作為第一維分離柱，以提高血漿樣品的上樣量，從而增加了單次分析中低豐度蛋白質(zhì)的含量，使其更容易被鑒定發(fā)現(xiàn)。為了能將第二維分離得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行后續(xù)更深入的研究，第二維分離柱采用8根2.1 mm內(nèi)徑的XtimateTM C8反相常規(guī)柱，不僅可以提高第二維的分離效率，實現(xiàn)了高通量快速分離，同時也可以與后續(xù)的餾分收集相匹配，更有利于第二維分離得到的餾分進(jìn)行后續(xù)更深入的研究。經(jīng)過二維色譜分離后，高豐度蛋白質(zhì)被分離到有限的組分中，其它餾分中高豐度蛋白質(zhì)的濃度相對大大降低，從而降低了高豐度蛋白質(zhì)對低豐度蛋白質(zhì)產(chǎn)生的質(zhì)譜抑制效應(yīng)，提高了低豐度蛋白質(zhì)得到鑒定的可能性。

相對于scFv@M13@MM材料[16]， Ampholine@PM均衡器材料具有較大的蛋白質(zhì)負(fù)載量，保存使用也更為簡便。而相比于免疫親和柱， Ampholine@PM均衡器材料不僅可以去除最高的9種高豐度蛋白質(zhì)，同時也可以從高豐度蛋白質(zhì)餾分中富集得到低豐度蛋白質(zhì)。因而，將二維陣列式液相色譜系統(tǒng)分離得到的高豐度蛋白質(zhì)餾分，用Ampholine@PM均衡器材料進(jìn)行處理，以富集餾分中的低豐度蛋白質(zhì)，從而進(jìn)一步增加低豐度蛋白質(zhì)被鑒定得到的可能性。

3.2 二維陣列式液相色譜系統(tǒng)重現(xiàn)性

二維陣列式液相色譜系統(tǒng)良好的重現(xiàn)性是進(jìn)行分離分析的首要基礎(chǔ)。對第一維SAX和第二維RP分別選用血漿樣品進(jìn)行3次重復(fù)實驗，并對所得譜圖的保留時間和峰面積進(jìn)行分析。從SAX色譜圖（圖2）中選取7個色譜峰進(jìn)行重現(xiàn)性考察，計算得到的色譜峰保留時間RSD=0.59%，峰面積RSD=6.4%。從RP色譜圖（圖3）選取7個色譜峰進(jìn)行重現(xiàn)性考察，計算得到的色譜峰保留時間RSD=0.14%，色譜峰面積RSD=1.7%。這些結(jié)果表明，第一維和第二維色譜分離具有優(yōu)良的重現(xiàn)性，為后續(xù)實際血漿樣品的分離鑒定奠定了良好的基礎(chǔ)。

3.3 在線二維陣列色譜分離去除血漿樣品中的高豐度蛋白質(zhì)

用二維陣列色譜對血漿樣品進(jìn)行了二維分離，圖2為血漿樣品的第一維分離色譜圖。為了降低高豐度蛋白質(zhì)在第二維分離過程中對低豐度蛋白質(zhì)的干擾，對第一維餾分切割程序進(jìn)行了優(yōu)化，以保證高豐度蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)盡可能轉(zhuǎn)移到不同的預(yù)柱上。圖4為血漿樣品第一維餾分的陣列RPLC色譜圖。相對于單一度的分離，血漿蛋白質(zhì)經(jīng)過二維分離后可以得到更多的色譜峰，具有更高的分辨率。與此同時，陣列式色譜分離亦可以顯著降低第二維分離所需的時間，大大提高系統(tǒng)的通量。高豐度蛋白質(zhì)在第二維反相色譜分離中具有較為集中的出峰位置，因而可以運用二維陣列色譜進(jìn)行血漿樣品中高豐度蛋白質(zhì)的去除。

3.4 均衡器材料對高豐度蛋白質(zhì)餾分中低豐度蛋白質(zhì)的富集

血漿樣品經(jīng)過陣列式二維色譜分離，一共收集得到880個餾分點。選取了圖5中3個強度存在明顯差異的高豐度蛋白質(zhì)區(qū)域（分別記為區(qū)域A、B、C）進(jìn)行Ampholine@PM均衡器材料實驗。采用LC-MS分別對3個高豐度蛋白質(zhì)區(qū)域進(jìn)行了對比鑒定，結(jié)果列于表1。區(qū)域A未經(jīng)過Ampholine@PM均衡器材料處理共鑒定到5個低豐度蛋白質(zhì)，而經(jīng)過Ampholine@PM材料處理后鑒定得到的低豐度蛋白質(zhì)數(shù)量為59個，為未經(jīng)處理的11.8倍。區(qū)域B未經(jīng)過Ampholine@PM均衡器材料處理共鑒定得到5個低豐度蛋白質(zhì)，而經(jīng)過Ampholine@PM材料處理后鑒定得到的低豐度蛋白質(zhì)數(shù)量為34個，為未經(jīng)處理的6.8倍。區(qū)域C未經(jīng)過Ampholine@PM均衡器材料處理共鑒定得到3個低豐度蛋白質(zhì)，而經(jīng)過Ampholine@PM材料處理后鑒定得到的低豐度蛋白質(zhì)數(shù)量為50個，為未經(jīng)處理的16.7倍。經(jīng)過Ampholine@PM均衡器材料處理后，3個高豐度蛋白質(zhì)區(qū)域一共鑒定到148個非冗余蛋白質(zhì)，其中48個為高豐度蛋白質(zhì)，100個為低豐度蛋白質(zhì)。與未經(jīng)處理的結(jié)果對比，采用Ampholine@PM均衡器材料處理后，所富集得到的低豐度蛋白質(zhì)數(shù)量提高了10倍，大幅度減少了高豐度蛋白質(zhì)餾分中低豐度蛋白質(zhì)的損失。

3.5 血漿樣品的高豐度蛋白質(zhì)去除及低豐度蛋白質(zhì)富集

離線二維液相色譜在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行高豐度蛋白質(zhì)的大規(guī)模高效分離和去除，整個過程離線處理操作多，通量小，所需時間超過了179 h，大大降低了其在復(fù)雜樣品中應(yīng)用的可能性[10]。血漿樣品經(jīng)過在線陣列式二維色譜分離，整個過程僅需要4 h，大幅縮短了復(fù)雜樣品的分離時間，實現(xiàn)了血漿樣品的高通量快速分離，并實現(xiàn)了高豐度蛋白質(zhì)的快速定位。分離得到的55種高豐度蛋白質(zhì)餾分，經(jīng)過均衡器材料處理后，一共鑒定出252種非冗余蛋白質(zhì)，其中61種為高豐度蛋白質(zhì)，191種為低豐度蛋白質(zhì)，進(jìn)一步提高了血漿蛋白質(zhì)組中低豐度蛋白質(zhì)的鑒定效果。其它中低豐度蛋白質(zhì)餾分一共鑒定得到了1376種蛋白質(zhì)，其中有25種高豐度蛋白質(zhì)在高豐度蛋白質(zhì)餾分中亦有存在。Ueda等[17]曾對血漿樣品進(jìn)行了RP-RP分離，經(jīng)過24 h二維色譜分離以及12天的LC-MS分析，一共鑒定得到了1126種蛋白質(zhì)。與之相比，血漿樣品經(jīng)過二維色譜分離及ampholine@PM均衡器材料處理后，一共鑒定得到了1474種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)濃度動態(tài)范圍達(dá)到了7種數(shù)量級，蛋白質(zhì)豐度最低的蛋白質(zhì)為prothrombin （1.2 ng/mL） [18]。由此可見，二維陣列式色譜進(jìn)行血漿樣品的分離分析，不僅可以大幅縮短分離鑒定的時間，同時也能得到更好的蛋白質(zhì)鑒定效果，展現(xiàn)了其在復(fù)雜樣品分析中巨大的應(yīng)用前景。

4 結(jié) 論

綜上所述，在線二維陣列式液相色譜系統(tǒng)可以對血漿樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)水平的分離，整個分離時間由179 h大幅縮短為4 h，并實現(xiàn)了高豐度蛋白質(zhì)的快速定位。相比于高豐度蛋白質(zhì)餾分直接鑒定，經(jīng)蛋白質(zhì)均衡器材料處理后，富集得到的低豐度蛋白質(zhì)數(shù)量提高了10倍，從而大幅度減少了低豐度蛋白質(zhì)的損失。將這種方法對血漿樣品進(jìn)行完整的分析，共鑒定到1474種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)濃度動態(tài)范圍達(dá)到了7種數(shù)量級。結(jié)果表明，血漿樣品的二維陣列色譜分離可以實現(xiàn)高豐度蛋白質(zhì)的快速定位和去除。高豐度蛋白質(zhì)餾分運用蛋白質(zhì)均衡器材料處理，可以實現(xiàn)低豐度蛋白質(zhì)的富集。二維陣列式液相色譜系統(tǒng)展現(xiàn)了較高的分離通量和較強的低豐度蛋白質(zhì)富集能力，從而顯著提高了血漿蛋白質(zhì)組的鑒定能力，可以應(yīng)用于其它復(fù)雜樣品的分離分析中。

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