徐帥 郝琴 代艷發(fā) 陳宏波

摘 要：目的：探討和對(duì)比食品動(dòng)物源性成分檢測(cè)中環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）與實(shí)時(shí)熒光定量法（PCR）的應(yīng)用價(jià)值。方法：于湖南省汨羅市各大超市抽取樣品并將其作為試驗(yàn)材料，共抽檢13份。抽檢樣品分別采用LAMP法與PCR法進(jìn)行檢測(cè)，觀察并對(duì)比兩種檢測(cè)方法各樣品提取DNA濃度的測(cè)定結(jié)果。結(jié)果：3種已知?jiǎng)游镌葱猿煞謽悠方?jīng)LAMP檢測(cè)顯示陽(yáng)性，且PCR檢測(cè)也為陽(yáng)性;LAMP法檢測(cè)時(shí)13份樣品中與標(biāo)簽明示肉源不符的樣品共3份，而PCR法檢測(cè)時(shí)有4份。兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果顯示1份樣品檢測(cè)結(jié)果不同。結(jié)論：LAMP法與PCR法在食品動(dòng)物源性成分檢測(cè)中均表現(xiàn)出顯著的應(yīng)用價(jià)值，準(zhǔn)確性高，并且具備較好特異性，但本研究中LAMP總用時(shí)80 min，較PCR總用時(shí)140 min少，更方便進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速抽檢。

關(guān)鍵詞：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法;實(shí)時(shí)熒光定量法;食品;動(dòng)物源性;成分檢測(cè)

目前市場(chǎng)上檢測(cè)食品動(dòng)物源性成分的常見(jiàn)方法以環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）、實(shí)時(shí)熒光定量法（PCR）為主[1] 。本研究于湖南省汨羅市各大超市抽取13份標(biāo)簽明示含有雞、豬、牛成分的樣品進(jìn)行分析，探討和對(duì)比LAMP法與PCR法在食品動(dòng)物源性成分檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

于湖南省汨羅市各大超市抽取樣品并將其作為試驗(yàn)材料，共抽檢13份，其中，混合肉制品共5份，標(biāo)簽明示僅含豬成分的5份，標(biāo)簽明示僅含牛成分的3份（表1）。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 （1）廣譜型基因組DNA小量純化試劑盒，Primerdesign生物公司;雞源性、豬源性、牛源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，Primerdesign生物公司。（2）動(dòng)物組織基因組DNA快速提取試劑盒，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司;雞源性、豬源性、牛源性檢測(cè)試劑盒（恒溫?zé)晒夥ǎ?，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。（3）1379型生物安全柜，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司;5417R型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司;MS3基本型圓周振蕩器，萊貝（上海）科學(xué)儀器有限公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)ABI StepOne;308C型恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀，廣州迪澳生物科技有限公司;微量紫外分光光度計(jì)，德國(guó)Becman公司。

1.2.2 LAMP檢測(cè)方法 （1）DNA提取方法：首先取0.5 g樣品并加入磁珠以及1 mL的Buffer A試劑（深圳欣博盛生物科技有限公司）進(jìn)行破碎處理，65 ℃下熱浴30 min，以5 000 r/min的速度進(jìn)行離心處理約5 min，取10 μL上清液加至新離心管中并加入1 mL的Buffer B試劑（上海玉博生物科技有限公司）混勻后得到DNA溶液[2] 。（2）鑒定雞源性成分：依據(jù)說(shuō)明書要求進(jìn)行，其中，擴(kuò)增條件：63 ℃ 45 min;擴(kuò)增體系25 μL：1 μL Bst聚合酶，2 μL模板DNA，20 μL密封液，22 μL反應(yīng)液[3] 。（3）鑒定豬源性成分：依據(jù)說(shuō)明書要求進(jìn)行，其中，擴(kuò)增條件：63 ℃ 45 min;擴(kuò)增體系25 μL：1 μL Bst聚合酶，2 μL模板DNA，20 μL密封液，22 μL反應(yīng)液。（4）鑒定牛源性成分：依據(jù)說(shuō)明書要求進(jìn)行，其中，擴(kuò)增條件：63 ℃ 45 min;擴(kuò)增體系25 μL：1 μL Bst聚合酶，2 μL模板DNA，20 μL密封液，22 μL反應(yīng)液。

1.2.3 PCR檢測(cè)方法 （1）DNA提取及濃度測(cè)定：依據(jù)廣譜型基因組DNA小量純化試劑盒說(shuō)明書中的步驟和要求提取，測(cè)定DNA濃度，記錄測(cè)定結(jié)果[4] 。（2）鑒定雞源性成分：依據(jù)試劑盒說(shuō)明書中的步驟和要求進(jìn)行，其中，擴(kuò)增體系25 μL：12.5 μL Premix，1 μL Primer Mix，1 μL Probe Mix，l μL模板DNA（10 ng/μL），補(bǔ)足25 μL ddH2O;擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)并于退火時(shí)收集熒光[5] 。（3）鑒定豬源性成分：依據(jù)試劑盒說(shuō)明書中的步驟和要求進(jìn)行，其中，擴(kuò)增體系25 μL：12.5 μL Premix，1 μL Primer Mix，1 μL Probe Mix，l μL模板DNA（10 ng/μL），補(bǔ)足25 μL ddH2O;擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)并于退火時(shí)收集熒光。（4）鑒定牛源性成分：依據(jù)試劑盒說(shuō)明書中的步驟和要求進(jìn)行，其中，擴(kuò)增體系25 μL：12.5 μL Premix，1 μL Primer Mix，1 μL Probe Mix，l μL模板DNA（10 ng/μL），補(bǔ)足25 μL ddH2O;擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)并于退火時(shí)收集熒光。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）分析兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果，在兩種檢測(cè)方法中，均將滅菌水作為空白對(duì)照，并且陰性對(duì)照為非目標(biāo)肉中所提取的DNA，陽(yáng)性對(duì)照為雞肉、豬肉、牛肉所提取的DNA[6] 。（2）觀察本研究所選13份樣品提取DNA濃度的測(cè)定結(jié)果，在檢測(cè)過(guò)程中取3 μL待測(cè)DNA溶液置于核酸蛋白測(cè)定儀，測(cè)定其濃度并進(jìn)行對(duì)照，其中空白對(duì)照仍為滅菌水[7] 。（3）對(duì)比兩種檢測(cè)方法測(cè)定結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各項(xiàng)基線資料及研究數(shù)據(jù)均由SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析。樣本率、計(jì)量資料分別采用χ2、t檢驗(yàn)，并分別采用百分率（%）、均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)（±s）表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP檢測(cè)結(jié)果分析

表2數(shù)據(jù)顯示，3種已知?jiǎng)游镌葱猿煞謽悠窓z測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。

2.2 PCR檢測(cè)結(jié)果分析

表3數(shù)據(jù)顯示，3種已知?jiǎng)游镌葱猿煞謽悠窓z測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。

2.3 各樣品提取DNA濃度測(cè)定結(jié)果

各樣品提取DNA的濃度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4 LAMP法與PCR法測(cè)定結(jié)果對(duì)比

表5數(shù)據(jù)顯示，13份檢測(cè)樣品中，LAMP法檢測(cè)時(shí)13份樣品中與標(biāo)簽明示肉源不符的樣品共3份，而PCR法檢測(cè)時(shí)有4份，有1份樣品檢測(cè)結(jié)果不同。

3 討論

劉娜等[8]研究中曾提出，食品藥品檢驗(yàn)所等監(jiān)管部門工作的落實(shí)是有效打擊肉制品不法摻雜、摻假行為的基礎(chǔ)，并認(rèn)為食品動(dòng)物源性成分檢測(cè)具有準(zhǔn)確的指導(dǎo)和判斷價(jià)值。近年來(lái)，我國(guó)生物技術(shù)及現(xiàn)代儀器分析技術(shù)不斷發(fā)展，在很大程度上指導(dǎo)了食品動(dòng)物源性成分檢測(cè)的方向。目前，食品動(dòng)物源性成分檢測(cè)主要是采用基于核酸的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，取得了較為理想的效果[9] 。LAMP與PCR技術(shù)近年來(lái)應(yīng)用廣泛，劉艷艷等[10]在研究中建立了驢、馬、驢騾和馬騾皮張四重?zé)晒釶CR檢測(cè)體系，為羊肉及牛肉的源性成分檢測(cè)提供了參考。PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物源性成分檢測(cè)中[11] 。但PCR技術(shù)對(duì)DNA模板的質(zhì)量要求較高，并且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、需要昂貴的儀器設(shè)備，因此使用存在一定局限性。

LAMP是一門新興的基因擴(kuò)增技術(shù)，余艷玲等[12]研究中曾采用LAMP技術(shù)對(duì)羅非魚無(wú)乳鏈球菌（GBS）進(jìn)行快速檢測(cè)，結(jié)果表明，LAMP技術(shù)具有較高的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性，應(yīng)用效果較為理想。此外，時(shí)建立等[13]也建立了豬源性成分LAMP檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)LAMP技術(shù)靈敏度較PCR方法來(lái)說(shuō)高出接近2～5個(gè)數(shù)量級(jí)，雖然該技術(shù)較qPCR方法來(lái)說(shuō)低10倍，達(dá)到5.928×10-3 μg/μL，但其反應(yīng)時(shí)間短，最快10 min即可完成反應(yīng)，成本低，不需專門的儀器，因此更適合食品安全監(jiān)管部門進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速監(jiān)督抽檢。需要注意的是，LAMP技術(shù)雖然操作簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確性高，但由于該技術(shù)采用粗提方式提取DNA，而且易受樣品基質(zhì)及加工工藝對(duì)所提取的核酸質(zhì)量的影響，因此針對(duì)部分步驟還需進(jìn)一步完善，最大程度降低檢測(cè)誤差[14] 。本研究?jī)煞N檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果顯示1份樣品檢測(cè)結(jié)果不同。這一研究與唐善虎等[15]為研究快速鑒別熟制牦牛肉餅中豬肉和雞肉的成分所建立的LAMP檢測(cè)體系基本一致。

綜上所述，LAMP法與PCR法均可在食品動(dòng)物源性成分檢測(cè)中使用，但考慮到市場(chǎng)抽檢的特殊性，一般選擇耗時(shí)短且操作更簡(jiǎn)單的PCR法進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)用價(jià)值更高?！?/p>

參考文獻(xiàn)

[1]麗牧.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)新城疫病毒的方法建立[J].食品安全導(dǎo)刊，2017（3）：136-138.

[2]劉娜，楊滴，韓東.食品中鵝源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立[J].肉類工業(yè)，2016（10）：37-39.

[3]Mohon A N，Lee D Y，Bayih A G，et al.NINA-LAMP compared to microscopy，RDT，and nested PCR for the detection of imported malaria[J].Diagnostic Microbiology & Infectious Disease，2016，85（2）：149-153.

[4]齊春萌，楊昕霆，薛晨玉.實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)食品中梅花鹿成分[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2016，35（10）：1088-1092.

[5]黃夢(mèng)詩(shī)，等.海水中副溶血弧菌的可視化LAMP快速檢測(cè)方法[J].中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2017，7（6）：58-65.

[6]馬芳，張慶利，萬(wàn)曉媛.基于LAMP技術(shù)的對(duì)蝦白斑綜合征病毒現(xiàn)場(chǎng)快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒的評(píng)價(jià)[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，38（4）：316-321.

[7]霍勝楠，等.3種食源性致病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2016，37（16）：143-147.

[8]劉娜，趙新，陳銳.動(dòng)物肌肉組織DNA的提取方法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)[J].食品工業(yè)科技，2016，37（18）：74-80.

[9]楊艷，等.PCR技術(shù)在肉類成分定量分析中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2016，37（17）：360-365.

[10]劉艷艷，張全芳，卞如如.利用多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)阿膠原料驢、馬、驢騾和馬騾皮張的源性[J].藥學(xué)研究，2016，35（10）：569-574.

[11]錢云開(kāi)，等.實(shí)時(shí)熒光PCR法快速檢測(cè)肉類中貉源性成分[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2016，28（5）：602-605.

[12]余艷玲，彭昊，馮世文.羅非魚無(wú)乳鏈球菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（13）：200-203.

[13]時(shí)建立，等.豬流行性腹瀉病毒LAMP檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2016，33（7）：82-85.

[14]夏雪娟，鄭炯，葉秀娟.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)監(jiān)測(cè)腌制麻竹筍中乳酸乳球菌動(dòng)態(tài)變化[J].食品科學(xué)，2016，37（4）：88-92.

[15]唐善虎，李雪，王柳.用LAMP法快速鑒別熟制牦牛肉餅中的豬肉和雞肉成分[J].西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2018，44（3）：237-242.

Abstract：Objective ? To explore and compare the application and value of Loop Mediated Isothermal Amplification（LAMP）and Real-time Fluorescence Quantification（PCR）in the detection of food animal derived ingredients.Method ? A total of 13 samples were collected from supermarkets in Miluo city in Hunan province.Sampling samples were detected by LAMP method and PCR method respectively.The detection results of DNA concentration extracted from each sample were observed and compared.Result ? The samples of three known animal origin components were positive by LAMP test，and PCR test was also positive.Among 13 LAMP test，there were 3 samples inconsistent with the meat source indicated by the label，while 4 samples were detected by PCR.The results of the two methods showed that the results of one sample were different.Conclusion ? Both LAMP method and PCR method have significant application value，high accuracy and good specificity in the detection of food animal derived ingredients，but the total time of LAMP is 80 min less than that of PCR 140 min，which is more convenient for spot rapid sampling.

Keywords：Loop Mediated Isothermal Amplification（LAMP）;Real-time Fluorescence Quantitative Method（PCR）;food;animal origin;component detection