李瑜 馬俊 高海娜 孫瑩瑩 唐曉東 成群 徐聰

摘?要：使用水、氯化鈉、乙醇和氫氧化鈉等不同提取液分別提取堇葉碎米薺中的蛋白質、多糖、核酸等有機硒大分子及無機硒，并采用氫化物發(fā)生-原子熒光法（HG-AFS）測定其硒含量，研究硒在堇葉碎米薺中的賦存形態(tài)及分布規(guī)律。結果表明：堇葉碎米薺不同部位硒含量分布規(guī)律為莖葉>根;葉片中有機硒的含量不僅高于無機硒，且有機硒轉化率達到60%以上，硒多糖是堇葉碎米薺有機硒賦存形態(tài)的主要組成部分，占樣品總硒的28.74%，其次為硒蛋白，硒蛋白組分中水溶性蛋白結合硒含量最高，占總蛋白含硒量的 24.04% 。

關鍵詞：堇葉碎米薺;硒;賦存形態(tài);分布規(guī)律

全世界約2/3的地區(qū)屬缺硒地區(qū)，中國約有 72% 的土壤處于缺硒地帶[1-6]。目前，利用食品途徑強化硒元素成為功能性食品的研究熱點，但無機硒的亞硒酸鈉毒性高，吸收利用率低，而經(jīng)過植物轉化的硒蛋白、硒代氨基酸、硒多肽、硒多糖等有機形態(tài)硒生物活性強，安全無副作用，更有利于人體的吸收[7-9]。安康是目前發(fā)現(xiàn)全國面積最大天然富硒土壤區(qū)域，中硒以上水平的土壤達52%[10]。堇葉碎米薺是一種具有超富集硒能力的植物[11-12]，其嫩莖葉含有豐富的蛋白質、可溶性糖、氨基酸、纖維素等營養(yǎng)成分[13]。對堇葉碎米薺中的硒賦存形態(tài)的研究有利于從堇葉碎米薺中提取硒蛋白和硒多糖等大分子生物有機硒，開發(fā)補硒強化劑系列產(chǎn)品。本試驗初步研究了堇葉碎米薺中硒的分布和賦存形態(tài)，旨在為高聚硒植物堇葉碎米薺硒產(chǎn)品的開發(fā)提供科學依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

選擇安康市農(nóng)業(yè)科學研究院栽培高硒堇葉碎米薺，并將根部和葉部分別經(jīng)過60 ℃烘箱中烘干后用粉碎機進行粉碎，過 80 目篩備用。

1.2?試劑

硼氫化鉀、氫氧化鉀、氯仿、正丁醇、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G250等試劑均為分析純;硝酸、高氯酸、鹽酸為優(yōu)級純，水為超純水。

1.3?主要設備

AFS-830原子熒光分光光度計（配有氫化物發(fā)生器和硒空心陰極燈）、恒溫磁力攪拌器、凱氏定氮儀、紫外可見分光光度計、離心機、電子天平等。

1.4?方法

1.4.1?無機硒的提取?準確稱取1.00g高硒堇葉碎米薺干粉置于250mL錐形瓶中，加30mL去離子水超聲抽提30min后小火微沸20min，再離心15min（5 000r/min）。然后取上清液用1/3提取液體積的環(huán)己烷進行萃取，分出水相后定容至25mL后測定硒含量。

1.4.2?總可溶性蛋白的提取?準確稱取5.00g高硒堇葉碎米薺干粉置于250mL三角瓶中，加50mL KH2PO4-Na2HPO4 （pH 8.5）在磁力攪拌器上提取4h，再離心15min（5 000r/min）后取上清液待用;殘渣分別用40mL和30mL浸提液重復提取、離心后合并上清液定容至200mL待用;然后吸取20mL上清液緩慢加入磨細的硫酸銨固體至飽和，于 4℃下靜置過夜后取出離心15min（5 000r/min），取沉淀用浸提液復溶后定容至25mL待測。

1.4.3 硒多糖的提取?準確稱取5.00脫脂高硒堇葉碎米薺干粉放在燒杯中，加入100mL去離子水在磁力攪拌器上于80℃恒溫條件提取2h，再離心15min（50 000r/min）后取上清液。殘渣用100mL去離子水重復提取后合并上清液倒入分液漏斗中，加1/3提取液體積的 Sevag試劑劇烈振蕩靜置5min，分出水相后再加入1/3體積的 Sevag試劑，重復2次得到粗多糖溶液。在粗多糖溶液中加入4倍體積的95%乙醇于4℃下靜置過夜后，離心15min（5 000r/min）后取沉淀重復醇析2次，將沉淀復溶定容至50mL待測。

1.4.4?硒核酸的提取?準確稱取5.00g脫脂高硒堇葉碎米薺置于250mL燒杯中，加入100mL 12%NaCl溶液于90℃水浴提取2h后離心15min（50 000r/min），取上清液，濾渣用相同方法重提1次，合并上清液后用Sevag法去蛋白，再用6 mol HCl將上清液調(diào)pH至2.5后4℃下靜置12h，使用冷凍離心機離心10min（3 000r/min）后得到核酸沉淀，將沉淀用95%乙醇淋洗3次后用12% 的NaCL溶液復溶并定容至25mL待用。

1.4.5?硒在蛋白質中的分布?使用 Osborne分級分離方法，依次以去離子水、稀鹽、乙醇、稀堿作為提取試劑從高硒堇葉碎米薺中分離提取不同種類的蛋白質，得到水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、醇溶性蛋白和堿溶性蛋白四種蛋白質組分。

1.4.6?蛋白質含量測定?按照考馬斯亮藍 G-250染色法測定高硒堇葉碎米薺中蛋白質含量。

1.4.7?樣品多糖含量測定?采用蒽酮-硫酸比色法測定高硒堇葉碎米薺中多糖含量。

1.4.8?硒含量的測定?按照《食品安全國家標準食品中硒的測定》（GB 5009.93—2017），采用雙道原子熒光光度計檢測硒含量指標。。

1.4.9?數(shù)據(jù)處理?利用 Excel 2003進行數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計分析。

2?結果與分析

2.1?堇葉碎米薺不同部位硒含量分布

由表1可知，經(jīng)富硒培育的堇葉碎米薺可食部位莖葉部總硒含量高于根部，達到110.194 mg/kg，通過對堇葉碎米薺進行無機硒和有機硒檢測分析發(fā)現(xiàn)，莖葉部有機硒含量也比根部高，從對有機硒的轉化能力來看，莖葉部有機硒轉化率為64.10%，大于根部的53.20%，說明堇葉碎米薺莖葉部位對土壤中硒的吸收和轉化能力較強。

2.2?堇葉碎米薺中蛋白質和多糖的含量測定

根據(jù)三次檢測結果，按回歸方程求得多糖含量為486mg/g，占干重的9.72%，總可溶性蛋白質含量為115.365mg/g，占干重的2.3%，在堇葉碎米薺不同種類蛋白質中，以水溶性蛋白質含量最高，堿溶性次之，醇溶性最低（表2）。

2.3?硒在堇葉碎米薺中的賦存形態(tài)研究

從圖1可以看出，高硒堇葉碎米薺中有機硒的含量占總硒含量的64.10%，大于無機硒所占比例。有機硒組分中，多糖硒的硒含量為66.124mg/kg，占總硒的 28.74%，是堇葉碎米薺中硒的主要存在形態(tài)，其次是蛋白硒，硒含量為85.805mg/kg，占總硒的19.72%，核酸硒占總硒的8.04%，其他形態(tài)的硒占7.6%，以非蛋白硒形式存在也占有一定的比例，可能有單質硒、小分子硒或其他大分子硒等形式存在，還有待進一步研究。說明堇葉碎米薺中的硒主要分布在多糖中，其賦存狀態(tài)主要是與多糖結合形式存在，其次是與蛋白質結合形式，但也有部分硒與核酸或其他形式存在。

2.4?硒在堇葉碎米薺不同蛋白組分中硒含量分析

堇葉碎米薺中蛋白質含量雖然較多糖少，但是硒含量較高，隨著近年來蛋白硒產(chǎn)品越來越受到人們的關注和歡迎，有必要進一步研究弄清硒在蛋白質中的分布情況，試驗利用不同提取液將蛋白質分成4種組分，研究硒在蛋白質中的分布情況。從圖2可以看出，不同種類蛋白質結合硒量的含量為水溶性蛋白硒>堿溶性硒>鹽溶性硒>醇溶性，這說明，在利用堇葉碎米薺進行硒蛋白產(chǎn)品開發(fā)時要多以水溶性和堿溶性蛋白的提取為主。

3?結論

堇葉碎米薺不僅營養(yǎng)豐富，還是一種富集硒能力非常強的植物，研究發(fā)現(xiàn)，堇葉碎米薺的莖葉部比根部更利于吸收、轉化土壤中硒元素，可以作為有機硒的載體進行有機硒產(chǎn)品的開發(fā);同時，從本實驗結果也能看到，多糖硒是堇葉碎米薺最主要的有機硒形態(tài)，其次是蛋白硒，水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、醇溶性蛋白以及堿溶性蛋白都能結合堇葉碎米薺中一定量的硒元素，但是以水溶性、堿溶性蛋白硒形式存在的硒組分最多。

多糖具有多種藥用生理活性，除了比較廣泛的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤生物活性外，還具有降血糖、防癌治癌、抗衰老等作用。因此，將硒與多糖的有機結合得到的有機硒化合物硒多糖，可使硒和多糖的生理和藥理功能得到充分優(yōu)化。本試驗結果表明，堇葉碎米薺的有機硒轉化能力并不是很高，這可能與培育高硒堇葉碎米薺時選擇的硒源、栽培時間短等有關，還需要進一步研究證實?！?/p>

參考文獻

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