李鵬 郭燕 矯勝田

摘要：應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)，通過對(duì)標(biāo)記抗體的pH值、抗體濃度和重懸液的條件優(yōu)化進(jìn)行斑布特羅膠體金快速檢測(cè)卡的研制。結(jié)果表明，其靈敏度達(dá)到0.1 ppb。該檢測(cè)卡簡單、快速、靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，與鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等常見的瘦肉精均無交叉反應(yīng)。檢測(cè)70份豬組織樣品與ELISA結(jié)果符合率為91%。結(jié)果表明，研制的班布特羅膠體金快速檢測(cè)卡可應(yīng)用于基層養(yǎng)殖、屠宰、市場環(huán)節(jié)動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品的現(xiàn)場快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：膠體金技術(shù);班布特羅;pH值;抗體濃度;重懸液

中圖分類號(hào)：TS201.2? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.01.052

Abstract： The development of the Bambuterlol colloidal gold rapid detection card was optimized by the colloidal gold immunochromatography technique by optimizing the pH，antibody concentration and resuspension conditions of the labeled antibody. The results showed that the sensitivity reached 0.1 ppb. The test card was simple，rapid，sensitive，specific，stable，and reproducible，and has no cross-reaction with common clenbuterol such as clenbuterol，salbutamol and ractopamine. The coincidence rate of 70 pig tissue samples with ELISA results was 91%. The results showed that the developed bambuterol colloidal gold rapid test card could be applied to the on-site rapid detection of grassroots aquaculture，slaughtering，market segment animals and animal products.

Key words：colloidal gold technology;bambuterol;pH;antibody cocentration;resuspension

0? ?引言

班布特羅（Bambuterol）是由Astra公司開發(fā)，1987年上市，是繼萊克多巴胺、克倫特羅和沙丁胺醇之后的新一代β -腎上腺素受體類激動(dòng)劑。最初被用于治療阻塞性呼吸道疾病，如支氣管性哮喘、慢性支氣管炎和肺氣腫[1]。20世紀(jì)80年代有研究表明，β -腎上腺素受體類激動(dòng)劑能影響營養(yǎng)物質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)的流向和重新分配，使動(dòng)物體內(nèi)脂肪代謝增強(qiáng)，蛋白質(zhì)合成增加，可以明顯減少胴體的脂肪含量，提高胴體瘦肉率和飼料利用率[2-3]，達(dá)到促進(jìn)家畜生長、改善肉質(zhì)的效果，但是如果人體過多攝入班布特羅等β -腎上腺素受體類激動(dòng)劑可導(dǎo)致急慢性中毒、心率失常等疾病，長期攝入甚至可致染色體畸變，引發(fā)惡性疾病[4-5]。因此，被禁止作為飼料添加劑用于動(dòng)物源性食品生產(chǎn)中，但仍有不法商家為謀求利益鋌而走險(xiǎn)。

目前檢測(cè)瘦肉精的檢測(cè)方法眾多，主要包括色譜技術(shù)[6]和免疫分析技術(shù)[7-8]。高效液相色譜法靈敏度高、選擇性好，但技術(shù)要求高、儀器昂貴，且不適合現(xiàn)場快速測(cè)定。膠體金免疫層析技術(shù)可快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出食品中有害有毒物質(zhì)殘留，操作簡單、便于現(xiàn)場操作，已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。研究對(duì)新型瘦肉精班布特羅膠體金檢測(cè)的工藝流程進(jìn)行優(yōu)化，探索膠體金檢測(cè)卡制備的最適條件，提高班布特羅快速檢測(cè)卡質(zhì)量，并實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確現(xiàn)場檢測(cè)班布特羅，同時(shí)也為基于膠體金技術(shù)的其他檢測(cè)產(chǎn)品的研究與探索提供參考。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料和儀器

1.1.1? ?材料

氯金酸，國藥集團(tuán)提供;班布特羅單抗，自行研制;班布特羅抗原，上海金標(biāo)提供;班布特羅標(biāo)準(zhǔn)品，北京中科質(zhì)檢生物提供;膠體金耗材套裝，上海杰一生物提供;羊肉、牛、豬肌肉組織樣品、尿樣，采自當(dāng)?shù)赝涝讏觥?/p>

1.1.2? ?試驗(yàn)儀器

XYZ HM3030型噴金劃膜儀、WM-100型切條機(jī)，上海金標(biāo)產(chǎn)品;SIGMA型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器產(chǎn)品。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1? ?金標(biāo)墊的制備

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.35%的紅色金顆粒標(biāo)記取1 mL膠體金溶液于2 mL試管中，加入濃度為0.2 mol/L的K2CO3添加2.0 μL/mL，混勻;加入抗體原液1.0 μL，混勻后靜置5 min;加入封閉液10 μL/mL（10%BSA），混勻后靜置5 min;在4 ℃下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心? ? ? 5 min;1/20體積的復(fù)溶液復(fù)溶，噴涂于已封閉好的玻璃纖維素膜上，迅速轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行冷凍干燥，制成金標(biāo)墊。

1.2.2? ?樣品墊和吸水墊的制備

樣品墊為玻璃纖維素膜浸沒入封閉液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%～3%牛血清白蛋白的濃度為0.01 mol/L磷酸緩沖液）進(jìn)行封閉，于37 ℃下干燥備用。吸水墊為吸水性能較好的吸水濾紙材料。

1.2.3? ?硝酸纖維素膜（NC膜）的包被

用包被液將制備的人工班布特羅抗體稀釋50倍為作為T液，PC-2羊抗鼠單克隆抗體稀釋250倍作為C液。將制備的C液、T液分別在NC膜上劃線，從左至右順序依次為T液和C液，置于37 ℃下干燥20～40 min，干燥后浸沒至封閉液中封閉，置于37 ℃恒溫箱中干燥備用。

1.2.4? ?檢測(cè)卡的組裝

將制備好的樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸水墊裁剪為寬度相同的長方形，把人工抗原用包被液50倍稀釋后用移液器點(diǎn)1 μL于空白NC膜上，背板一端貼上吸水紙，另一端貼上處理后的金標(biāo)墊與樣品墊，輔料之間相互連接，兩端均壓NC膜1～2 mm，切成寬3.5 mm的條子，組裝成檢測(cè)班布特羅含量的檢測(cè)卡。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?膠體金快速檢測(cè)卡pH值的優(yōu)化

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.35%的紅色金顆粒標(biāo)記，濃度為? 0.2 mol/L的K2CO3分別添加1.5，2.0，2.5，3.0 μL/mL，抗體標(biāo)記量為5 μL/mL，每個(gè)條件標(biāo)記1 mL，10%BSA封閉，復(fù)溶液復(fù)溶至100 μL，備用。

膠體金快速檢測(cè)卡pH值見圖1。

由圖1可知，添加1.5 μL/mL K2CO3時(shí)效價(jià)最好。

2.2? ?抗體標(biāo)記量的優(yōu)化

在上述標(biāo)記條件下，抗體標(biāo)記量調(diào)整為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 μL/mL。

抗體標(biāo)記量顯色圖見圖2。

由圖2可知，抗體標(biāo)記量在1.5 μL/mL時(shí)顯色最好。

2.3? ?班布特羅膠體金快速檢測(cè)卡靈敏度測(cè)試

通過使用研制的班布特羅膠體金快速檢測(cè)卡對(duì)含有班布特羅的樣品進(jìn)行檢測(cè)。

班布特羅膠體金快速檢測(cè)卡靈敏度見圖3。

由圖3可知，獲得的班布特羅膠體金快速檢測(cè)卡靈敏度達(dá)到0.1 ppb，通過調(diào)試產(chǎn)品達(dá)到檢測(cè)需求。

2.4? ?班布特羅瘦肉精檢測(cè)卡性能驗(yàn)證

2.4.1? ?靈敏度和重復(fù)性檢測(cè)

班布特羅檢測(cè)卡靈敏度檢測(cè)的T、C 線顯色結(jié)果見表1，試紙條重復(fù)性的檢測(cè)見表2。

由表1可知，當(dāng)班布特羅標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 ng/mL時(shí)T線不顯色，為陽性;隨著標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度的增加T線不顯色，C線顏色增深，表明班布特羅瘦肉精檢測(cè)卡的最低檢測(cè)限為0.1 ng/mL。班布特羅試紙條加入陰性PBS后，T、C 顯色清晰。由 表2可知，檢測(cè)卡的批內(nèi)和批間重復(fù)性為100%，假陽性率和假陰性率均為0%。

2.4.2? ?特異性檢測(cè)

為了驗(yàn)證研發(fā)的班布特羅檢測(cè)卡的特異性，通過滴加不同質(zhì)量濃度的常見的3種瘦肉精鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺，結(jié)果表明試紙條與上述3種瘦肉精均未有交叉反應(yīng)出現(xiàn)，表現(xiàn)出良好的特異性。

試紙條的特異性檢測(cè)見表3。

2.5? ?班布特羅檢測(cè)卡檢測(cè)應(yīng)用

分別使用班布特羅檢測(cè)卡和ELISA試劑盒對(duì)70份豬組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果ELISA檢測(cè)出33份陽性，班布特羅檢測(cè)卡檢測(cè)出30份陽性，二者的符合率為91%。

3? ?結(jié)論

養(yǎng)殖環(huán)節(jié)非法添加瘦肉精已經(jīng)是普遍現(xiàn)象，目前新型瘦肉精的不斷出現(xiàn)給監(jiān)管部門執(zhí)法監(jiān)管帶來很大障礙，尤其是缺乏現(xiàn)場快速檢測(cè)技術(shù)。膠體金免疫層析技術(shù)近年來發(fā)展迅速，因其操作簡便、快捷、特異性強(qiáng)、靈敏度高且便于現(xiàn)場操作，已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。研究制備的新型瘦肉精班布特羅膠體金檢測(cè)卡的靈敏度為0.1 ng/mL，且特異性好，與鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等常見的瘦肉精均無交叉反應(yīng)。而且使用方便、快速準(zhǔn)確、成本低，可用于班布特羅的快速檢測(cè)，適合基層獸醫(yī)站、養(yǎng)殖企業(yè)、屠宰企業(yè)、市場監(jiān)管部門等使用。

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