劉靜 汪雨 黃勁松

摘要：為了進(jìn)一步開發(fā)我國(guó)傳統(tǒng)中草藥中的活性和保健成分，以池州山區(qū)野生靈芝為研究對(duì)象，通過(guò)水熱提取和乙醇沉淀，采用單因素和三水平三因素正交表L9（34）設(shè)計(jì)試驗(yàn)，經(jīng)分析計(jì)算確定靈芝多糖的最佳提取工藝條件為提取溫度80 ℃，浸提時(shí)間35 min，料液比1∶20，提取3次，靈芝多糖的提取率可達(dá)到5.45 mg/g;經(jīng)紅外光譜圖分析，多糖為β -吡喃葡聚糖。

關(guān)鍵詞：靈芝;多糖;提取;正交;池州;提取率

中圖分類號(hào)：TQ461? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.01.037

Abstract：In order to further develop traditional Chinese herbal medicine and health care ingredients，Chizhou Ganoderma lucidum as the research object in our study，by hot water extraction and ethanol precipitation，using the 3 factors of single factors and three levels orthogonal table L9（34） design of experiment，the analysis and calculation to determine the optimum ext-raction conditions of Ganoderma lucidum polysaccharide，temperature 80 ℃，the leaching time of 35 min，and solid-liquid ratio 1∶20，extracting 3 times，the yield of Ganoderma lucidum polysaccharide reached 5.45 mg/g. The polysaccharides were determined by IR spectra，shows that was β-pyran glucan.

Key words：Ganoderma atrum;polysaccharose;extract;orthogonality;Chizhou;extraction

靈芝是我國(guó)的寶貴中草藥文化遺產(chǎn)，含有多種活性成分，對(duì)靈芝活性成分研究不但可以提高我國(guó)中草藥利用價(jià)值，還可以發(fā)揚(yáng)傳統(tǒng)優(yōu)秀文化在當(dāng)代的價(jià)值[1-3]。靈芝多糖具有抗腫瘤作用，靈芝多糖可以通過(guò)促進(jìn)白細(xì)胞介素Ⅱ的生成，通過(guò)促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能，通過(guò)提升人體的造血能力尤其是白細(xì)胞的指標(biāo)水平，以及通過(guò)其中某些有效成分對(duì)癌細(xì)胞起到抑制作用，成為抗腫瘤及癌癥輔助治療的優(yōu)選藥物[4-6]。研究結(jié)果表明，靈芝多糖的抗腫瘤活性可能與其對(duì)宿主機(jī)能的影響有關(guān)，且水溶性多糖也可能起著很重要的作用，并且靈芝多糖有其合適的分子量范圍，它的分子量越大，抗腫瘤活性越強(qiáng)[7-9]。此外，靈芝多糖具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，經(jīng)腹腔注射或經(jīng)口服靈芝多糖，能增強(qiáng)對(duì)蛋白質(zhì)抗原延遲超過(guò)敏化[10]。靈芝多糖能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化而增強(qiáng)細(xì)胞免疫力;促進(jìn)淋巴細(xì)胞的形成反應(yīng)，從而增強(qiáng)體液免疫力;增強(qiáng)淋巴細(xì)胞內(nèi)DNA聚合酶的活性，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分裂，導(dǎo)致白細(xì)胞介素的合成和分泌，從而恢復(fù)因衰老而導(dǎo)致的免疫力下降。再次，靈芝多糖有保護(hù)心腦血管的功能[11-12]。研究結(jié)果表明，靈芝多糖有明顯的強(qiáng)心降壓作用，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有預(yù)防和治療作用;其降低血糖原理可能是由于血漿胰島素水平被提高，使葡萄糖的代謝速度加快，外周組織和肝的葡萄糖利用也加快，從而達(dá)到血糖降低的作用。還有研究表明，靈芝多糖可有效地?cái)U(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加冠脈血的流量，改善心肌微循環(huán)，加強(qiáng)心肌氧和能量的供給，可明顯使血膽固醇、甘油三酯和脂蛋白降低，可以防止動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[13-16]。

靈芝多糖能促進(jìn)血清、肝臟和骨髓的核酸及蛋白質(zhì)的生物合成，因此可以有效地抗病毒;靈芝多糖可顯著提高SOD活性，有效清除機(jī)體產(chǎn)生的自由基，從而阻止自由基對(duì)機(jī)體的損傷，防止機(jī)體的過(guò)氧化，保護(hù)了細(xì)胞組織，延緩了細(xì)胞衰老。靈芝多糖能顯著促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)DNA合成能力，并可增加細(xì)胞的分裂代數(shù)[17-19]。這些作用都能延緩機(jī)體的衰老，所以，靈芝多糖的抗衰老功能十分強(qiáng)大。除了具有上述保健功能外，還有其他的藥用效果，如平緩咳嗽、化痰止咳，緩解支氣管哮喘癥狀、慢性支氣管炎?？墒惯^(guò)敏反應(yīng)介質(zhì)的釋放被阻斷，使過(guò)敏反應(yīng)減輕;對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用，可以安神補(bǔ)腦，保證良好的睡眠質(zhì)量;可以使其他降壓藥物的效果更延長(zhǎng)和穩(wěn)定。靈芝多糖還可以保持和調(diào)節(jié)皮膚水分，恢復(fù)和保持皮膚彈性，使皮膚中黑色素的形成和沉淀的速度延緩[20]。

池州黑靈芝產(chǎn)于皖南山區(qū)，應(yīng)用為保健食品已有2 000多年的傳統(tǒng)，但是目前利用現(xiàn)代科學(xué)研究方法對(duì)其進(jìn)行研究較少，從提取、結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行初步研究。

1? ?材料與方法

1.1? ?試劑和儀器

乙醇、苯酚、硫酸、葡萄糖、乙醚、石油醚、正丁醇、氯仿，以上試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)上海試劑公司提供。

R201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海廣英儀器有限公司產(chǎn)品;WD750B型微波爐，順德市格蘭仕電器實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品;Delta-320型pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品;BSZ-100A型分部收集器、HL-1B型恒流泵，上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品;SYC-15型恒溫水浴鍋，河北潤(rùn)聯(lián)科技有限公司產(chǎn)品;WK-150A型超微粉碎機(jī)，濟(jì)南達(dá)威機(jī)械有限公司產(chǎn)品;FTIR 8700型傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Thermo Nicolet公司產(chǎn)品。

1.2? ?試驗(yàn)步驟

1.2.1? ?靈芝多糖的脫蛋白

采用Sevage法脫除蛋白。稱取少量靈芝粉樣品加少量水溶液（大約有10 mL），取樣品液10 mL，加入氯仿-正丁醇（預(yù)先配成一定體積比的混合液比例為1∶4）2.5 mL，置于萃取裝置中，充分振蕩，取上層清液。反復(fù)脫蛋白3次效果最佳。

1.2.2? ?靈芝多糖的透析

（1）透析袋的處理。將透析袋放在裝有50%的乙醇的熱水中煮1 h，在蒸餾水中潤(rùn)洗。

（2）透析處理。將脫蛋白后的多糖液裝入透析袋內(nèi)，用夾子封口，然后將透析袋放入裝有大量蒸餾水的大容器中，透析2～3 d，乙醇沉淀、離心、低溫干燥，得到靈芝多糖。

1.2.3? ?靈芝多糖提取率的測(cè)定

采用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。多糖類成分在硫酸作用下，首先水解成單糖，同時(shí)迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚縮合成有色化合物，490 nm處有最大吸收波長(zhǎng)[12]。

精密稱取葡萄糖20 mg，定容于400 mL容量瓶中，配置成50 μg/mL。取上述溶液0.2，0.4，0.6， 0.8，1.0，1.2 mL分別于6支試管中，加蒸餾水至2.0 mL，加入1.0 mL，15%苯酚溶液（苯酚與蒸餾水的比例為15∶85），搖勻后迅速加入5.0 mL濃硫酸，搖勻后靜置10 min，置沸水浴中加熱15 min，迅速冷卻至室溫，以蒸餾水的反應(yīng)液作空白，于波長(zhǎng)490 nm處比色測(cè)定A值。以A490為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的糖量值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用最小乘法做線性回歸，得到吸光度（A）與葡萄糖質(zhì)量濃度（C）的曲線。靈芝多糖提取率按以下公式計(jì)算：

稱取靈芝多糖5.0 mg，加熱水溶解后定容至100.0 mL，取2.0 mL按上述方法測(cè)定A490，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算結(jié)果。

1.2.4? ?靈芝多糖的測(cè)定

粉碎50 g靈芝，由于靈芝多糖易溶于熱水中，因此采用熱水提取法。對(duì)于靈芝多糖的提取工藝，主要從以下4個(gè)因素來(lái)考慮對(duì)提取率的影響，為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的水平提供有意義的取值范圍。

（1）溫度對(duì)靈芝多糖提取率的影響。稱取1 g靈芝粉5份，加入30 mL水，置于溫度不同的水浴鍋中，控制溫度分別為50，60，70，80，90 ℃，浸提30 min，過(guò)濾，濾液離心，苯酚-硫酸法測(cè)定靈芝多糖質(zhì)量濃度，計(jì)算提取率。

（2）料液比對(duì)靈芝多糖提取率的影響。稱取1 g靈芝粉5份，分別加入水15，20，25，30，35 mL置于80 ℃的水浴中，浸提30 min，過(guò)濾，濾液離心，計(jì)算提取率。利用苯酚-硫酸法測(cè)定靈芝多糖質(zhì)量濃度。

（3）提取時(shí)間對(duì)靈芝多糖提取率的影響。稱取? 1 g靈芝粉5份，加入30 mL水，控制溫度80 ℃，分別浸提20，25，30，35，40 min，抽濾，濾液經(jīng)離心后用苯酚-硫酸法測(cè)定靈芝多糖質(zhì)量濃度，計(jì)算提取率。

（4）提取次數(shù)對(duì)靈芝多糖提取率的影響。稱取? 1 g靈芝粉5份，加入30 mL水，控制溫度80 ℃，分別提取1，2，3，4，5次，每次30 min，合并提取液，濾液離心，計(jì)算提取率。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?提取溫度對(duì)靈芝多糖提取率的影響

提取溫度對(duì)靈芝多糖提取率的影響見圖1。

由圖1可知，伴隨提取溫度的升高，多糖的提取率漸漸升高，這表明溫度越高對(duì)靈芝細(xì)胞的破壞作用越大，有利于多糖的浸出。由圖1可知，提取溫度為80 ℃時(shí)，靈芝多糖的提取率最高，因此最適宜提取溫度為80 ℃。

2.2? ?料液比對(duì)靈芝多糖提取率的影響

料液比對(duì)靈芝多糖提取率的影響見圖2。

隨著料液比的增加，多糖提取率逐漸降低，料液比為1∶20，1∶25時(shí)，多糖提取率都為最大。而容積體積的增加會(huì)延長(zhǎng)濃縮時(shí)間，能量消耗較大，生產(chǎn)成本增加，所以料液比為1∶20較好。

2.3? ?提取次數(shù)對(duì)靈芝多糖提取率的影響

提取次數(shù)對(duì)靈芝多糖提取率的影響見圖3。

由圖3可知，提取次數(shù)對(duì)靈芝多糖提取率的影響也較為突顯。當(dāng)提取次數(shù)1～3次時(shí)，多糖提取率增加較快;3～5次時(shí)，多糖提取率上升相當(dāng)遲緩。此外，提取次數(shù)較多時(shí)，提取液較稀，濃縮過(guò)程能耗大。所以，提取次數(shù)選3次為宜，是從節(jié)約成本和提高效率的方面考慮的結(jié)果。

2.4? ?提取時(shí)間對(duì)靈芝多糖提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)靈芝多糖提取率的影響見圖4。

由圖4可知，靈芝多糖提取率隨著浸提時(shí)間的增加而逐漸增加，30 min后，提取率減少，而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，生產(chǎn)時(shí)間也相應(yīng)延長(zhǎng)，生產(chǎn)成本會(huì)增加，因此浸提時(shí)間為30 min。

2.5? ?水提法提取靈芝多糖的正交優(yōu)化

因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

通過(guò)單因素試驗(yàn)，利用三水平三因素正交L9（34）試驗(yàn)對(duì)工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

靈芝多糖提取正交設(shè)計(jì)見表2。

按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共進(jìn)行9次提取，各個(gè)因素影響靈芝多糖提取率的排列順序?yàn)镃>B>A，最佳的提取條件為C2B3A2，即提取溫度80 ℃，提取時(shí)間35 min，料液比1∶20，靈芝多糖的提取率可達(dá)到5.45 mg/g。提取溫度為80 ℃時(shí)，水分子運(yùn)動(dòng)劇烈，使靈芝多糖運(yùn)動(dòng)加快，靈芝細(xì)胞膨脹，細(xì)胞壁對(duì)多糖的束縛力減弱，多糖在胞內(nèi)和胞外的滲透壓差變大，溶液內(nèi)外濃度平衡較快。提取時(shí)間低于35 min時(shí)，胞內(nèi)外多糖沒(méi)達(dá)到平衡;提取時(shí)間大于35 min時(shí)，較高的溫度將破壞多糖，引起多糖降解。料液比大于1∶20時(shí)，溶液過(guò)稀，給后續(xù)濃縮帶來(lái)困難;料液比小于1∶20時(shí)，胞內(nèi)多糖浸出較困難。

2.6? ?紅外光譜圖鑒定

靈芝多糖的紅外光譜圖見圖5。

由圖5可知，在波長(zhǎng)3 000～3 800 cm-1處出現(xiàn)一個(gè)較寬的糖分子內(nèi)部或分子之間氫鍵O-H伸縮振動(dòng)引起的峰[13]，2 950 cm-1處的吸收是亞甲基（-CH2）的C-H伸縮振動(dòng)峰，1 637cm-1處應(yīng)為-CHO的C=O伸縮振動(dòng)引起的吸收峰，而1 390 cm-1處的尖銳峰可能為C-H變角振動(dòng)，與2 950 cm-1處的吸收振動(dòng)峰構(gòu)成了糖類的特征吸收峰[14]。1 130 cm-1處的吸收峰可能為糖環(huán)的特征吸收峰，是由多糖中鏈接單糖的C-O糖苷鍵振動(dòng)引起[15]。此光譜圖表明所得產(chǎn)品是多糖。

3? ?結(jié)論

通過(guò)正交優(yōu)化試驗(yàn)確定靈芝多糖的最佳工藝提取條件為提取溫度80 ℃，提取時(shí)間35 min，料液比1∶20，提取次數(shù)3次，靈芝多糖產(chǎn)率可達(dá)到5.45 mg/g。在這些條件之中溫度的改變對(duì)多糖提取率的影響相對(duì)較大，其次是提取時(shí)間、料液比。目前，此方法僅限于實(shí)驗(yàn)室提取靈芝多糖，對(duì)其在體內(nèi)的代謝及對(duì)細(xì)胞修復(fù)方面需進(jìn)一步深入研究。

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