[摘 要] 嘗試應(yīng)用鼻腔灌注法及頸背部注射法建立樹鼩神經(jīng)性布氏桿菌病模型，通過(guò)臨床觀察，以期探索建立一個(gè)病理過(guò)程、臨床表現(xiàn)與人類疾病相類似的布氏桿菌病動(dòng)物模型的方法，用于該病的致病機(jī)理、藥物篩選評(píng)價(jià)等實(shí)驗(yàn)研究，為神經(jīng)性布氏桿菌病的發(fā)病機(jī)制研究及藥物研發(fā)工作提供新的思路。

[關(guān)鍵詞] 神經(jīng)性布氏桿菌病;樹鼩;間充質(zhì)干細(xì)胞;實(shí)驗(yàn)教學(xué)

[課題項(xiàng)目] 2019年度河套學(xué)院科學(xué)研究項(xiàng)目“神經(jīng)性布氏桿菌病樹鼩模型建立及間充質(zhì)干細(xì)胞治療的實(shí)驗(yàn)研究”（HYZY201940）

[作者簡(jiǎn)介] 劉立飛（1986—），內(nèi)蒙古通遼人，河套學(xué)院醫(yī)學(xué)系講師，主要從事外科護(hù)理學(xué)、急救醫(yī)學(xué)、護(hù)理管理研究。

[中圖分類號(hào)] G642.0 ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ?[文章編號(hào)] 1674-9324（2020）34-0259-02 ? ?[收稿日期] 2020-02-24

一、神經(jīng)性布氏桿菌病樹鼩模型建立及間充質(zhì)干細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)教學(xué)概述

布氏桿菌?。˙rucellosis）又稱為布魯氏菌病，是布氏桿菌感染引起的人畜共患傳染性疾病。布氏桿菌屬的細(xì)菌是一組微小的革蘭陰性菌，它可經(jīng)多種傳播途徑感染人類，隨血液帶至全身，造成菌血癥、毒血癥和敗血癥。在我國(guó)，布氏桿菌病和流行性腦膜炎、肺結(jié)核、登革熱等傳染病一同列入乙類傳染病。內(nèi)蒙古自治區(qū)作為全國(guó)畜牧區(qū)，是我國(guó)人畜布氏桿菌病疫情最為嚴(yán)重的地區(qū)之一。

布氏桿菌病臨床表現(xiàn)十分復(fù)雜，神經(jīng)系統(tǒng)病變是其局限性損害的表現(xiàn)。已報(bào)道的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變有腦膜腦炎、腦膜炎、脊髓炎、腦脊髓膜炎、硬腦膜外膿腫、腦膿腫（包括垂體膿腫）、腦梗死、短暫性腦缺血發(fā)作、蛛網(wǎng)膜下腔出血、白質(zhì)腦病、顱內(nèi)靜脈系統(tǒng)血栓形成及精神異常等。

由于脊柱脊髓損傷的高致殘率，給家庭和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)，傳統(tǒng)的治療主要依靠藥物和外科手術(shù)，雖然可在一定程度上緩解，但療效有限，多局限在病癥的緩解，無(wú)法從根本上解決病患的問題，因此其治療至今仍然是一個(gè)世界性難題。干細(xì)胞移植治療脊髓損傷，使損傷軸突再生、突觸重建和恢復(fù)脊髓部分功能成為可能，而間充質(zhì)干細(xì)胞，特別是骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）除了具有干細(xì)胞的一般特性外，相比其他類型的干細(xì)胞，還具有取材方便、不涉及倫理問題、易于外源基因轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定表達(dá)、免疫原性弱、可進(jìn)行自體移植、尚未發(fā)現(xiàn)致瘤性等諸多優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)上被認(rèn)為是一種細(xì)胞替代治療及基因治療的理想靶細(xì)胞，尤其是在神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)領(lǐng)域，有著良好的應(yīng)用前景。

二、神經(jīng)性布氏桿菌病樹鼩模型建立及間充質(zhì)干細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)教學(xué)方法

（一）建立樹鼩神經(jīng)性布氏桿菌病模型

1.布魯氏桿菌培養(yǎng)及菌液制作。實(shí)驗(yàn)分組和模型制備。

2.檢測(cè)指標(biāo)。（1）行為學(xué)檢查;（2）磁共振成像檢查;（3）病原學(xué)檢查;（4）組織病理學(xué)檢查。

3.統(tǒng)計(jì)分析和模型評(píng)價(jià)。

（二）樹鼩星形細(xì)胞與少突膠質(zhì)細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)及其在布氏桿菌感染作用下炎癥因子早期的變化研究

細(xì)胞培養(yǎng)：體外分離培養(yǎng)樹鼩角膜星形細(xì)胞與少突膠質(zhì)細(xì)胞。（1）初步感染：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別接受107、108和109CFU/ml三種濃度的菌懸液感染，分別吸取不同濃度的菌懸液20ul，滴加于實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)液中;對(duì)照組滴入20ul磷酸鹽緩沖液（PBS）。（2）檢測(cè)指標(biāo)：在感染操作后12h、1、3、5分批使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中TNF-α、IL-12、IL-8、IL-1β、IL-6的蛋白表達(dá)。

（三）樹鼩間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)

（四）間充質(zhì)干細(xì)胞治療樹鼩神經(jīng)性布氏桿菌病脊髓損傷的神經(jīng)系統(tǒng)變化研究

1.實(shí)驗(yàn)分組：選取樹鼩20只，隨機(jī)分為模型組、生理鹽水組。

2.實(shí)驗(yàn)方法：選取行為學(xué)表現(xiàn)較差、且磁共振成像脊柱損傷的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，經(jīng)靜脈途徑將體外分離培養(yǎng)后的BMSCs注射入體內(nèi)，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)觀察并評(píng)估，且注射后定期對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊柱進(jìn)行磁共振成像檢查。

3.檢測(cè)指標(biāo)：在手術(shù)操作后定期分批處死動(dòng)物。采集腦組織、脊髓標(biāo)本，用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦組織及脊髓中的炎癥因子表達(dá)變化TNF-α、IL-12、IL-8、IL-1β、IL-6的表達(dá)變化情況。接種后5、10、15、20和30d應(yīng)用過(guò)量麻醉法分批處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦組織及脊柱進(jìn)行HE染色觀察病理改變，PAS染色觀察神經(jīng)系統(tǒng)組織間的細(xì)菌菌灶，透射電鏡觀察角膜超微結(jié)構(gòu)改變。對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞治療結(jié)果做簡(jiǎn)單評(píng)估。

三、研究與討論

由于神經(jīng)性布氏桿菌病是一種嚴(yán)重致癱性疾病，我國(guó)神經(jīng)性布氏桿菌病患者中綿羊和山羊種（B.melitensis），是最常見的致病病原菌，臨床早期正確診斷和治療存在一定困難，治療后存在感染復(fù)發(fā)的可能性。我區(qū)農(nóng)牧業(yè)人口居多，牧區(qū)面積大，布氏桿菌病患者很常見。對(duì)于布氏桿菌病來(lái)說(shuō)，尋找一種低成本、再現(xiàn)性好、復(fù)制率高的理想動(dòng)物模型有利于推動(dòng)該疾病的相關(guān)研究。

目前常用作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的小鼠和兔神經(jīng)系統(tǒng)與人類神經(jīng)系統(tǒng)存在差異，不利于重現(xiàn)人類神經(jīng)性布病的臨床表現(xiàn)。樹鼩隸屬于攀鼩目樹鼩科樹鼩屬，為外形類似于松鼠的一類小型哺乳類動(dòng)物，體型較小，體重≤320g，廣泛分布于東南亞、南亞及我國(guó)南部。樹鼩比較容易飼養(yǎng)管理，繁殖快，價(jià)格低廉，其新陳代謝較鼠類和犬類等動(dòng)物更接近于人，大體解剖也近似于人。最近，昆明動(dòng)物研究所組織了中緬樹鼩全基因組測(cè)定和解析工作，得到了高覆蓋度（79X）的基因組序列。通過(guò)基因組分析，發(fā)現(xiàn)樹鼩在神經(jīng)及免疫系統(tǒng)等方面與人類具有較為高度的同源性，在很多方面具有可用來(lái)替代獼猴等大型靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳基礎(chǔ)，可能還適合于更多的免疫學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)及代謝等生物學(xué)問題和疾病機(jī)理研究（Fan et al，2012）。

本研究通過(guò)臨床觀察、磁共振成像檢查、組織病理學(xué)檢查、病原學(xué)檢查、透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察等對(duì)造模的成功率、與人類疾病的相似程度進(jìn)行評(píng)價(jià)，檢測(cè)感染過(guò)程中相關(guān)的炎性因子的變化，探索建立一個(gè)病理過(guò)程、臨床表現(xiàn)與人類疾病相類似、價(jià)格低廉、技術(shù)簡(jiǎn)單、成功率較高的布氏桿菌病動(dòng)物模型的方法，用于該病的致病機(jī)理、藥物篩選評(píng)價(jià)等實(shí)驗(yàn)研究，在感染后期進(jìn)行初步探討甘露糖受體（MR）和Dectin-1在神經(jīng)性布病的發(fā)生發(fā)展中的作用，為神經(jīng)性布病的發(fā)病機(jī)制研究及藥物研發(fā)工作提供新的思路。

參考文獻(xiàn)

[1]李振宇，陳玲霞，尹博文，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的研究進(jìn)展[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2015，32（3）：56-61.

[2]黃霞，潘興華，龐榮清，等.樹鼩2型糖尿病模型的構(gòu)建及其相關(guān)因素分析[J].西南國(guó)防醫(yī)藥，2015，25（8）：834-837.