易春蝶,李文君,婁嘉豪,呂 典,馬燕華,尹俊林,曾廣智

(云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650500)

癌癥危害人類生命,已成為人類健康的主要?dú)⑹种?傳統(tǒng)的癌癥治療方法主要有手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療.臨床上,通過手術(shù)切除癌變的腫瘤,配合化療和放療,對(duì)部分惡性腫瘤具有較好的治療效果,但同時(shí)也存在一定的不足.手術(shù)治療主要適用于早期實(shí)體腫瘤,對(duì)于血液系統(tǒng)和晚期腫瘤無效；放射治療主要針對(duì)相對(duì)比較局限的實(shí)體腫瘤；化學(xué)治療主要通過細(xì)胞毒性化學(xué)藥物殺滅腫瘤,存在靶向性差、毒副作用大等缺點(diǎn)[1].所以對(duì)于靶向性新型抗腫瘤藥物的研究一直是藥學(xué)研究人員關(guān)注的重點(diǎn).

腫瘤免疫療法是通過激活機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗腫瘤作用的一種治療方式, 近些年來已成為繼放療、化療、手術(shù)之后第4種有效的癌癥治療方法,為腫瘤治療開拓了新途徑[2].免疫檢查點(diǎn)(immune checkpoint)是指免疫系統(tǒng)中存在的一些抑制性信號(hào)通路.正常情況下,免疫檢查點(diǎn)可以通過調(diào)節(jié)自身免疫反應(yīng)的強(qiáng)度來維持免疫耐受,然而,機(jī)體在受到腫瘤侵襲時(shí),免疫檢查點(diǎn)的激活可抑制自身免疫,有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和逃逸[3].以免疫檢查點(diǎn)阻斷療法為代表的腫瘤免疫治療在腫瘤臨床治療中取得了突破性進(jìn)展,表明操縱免疫負(fù)性調(diào)控途徑可以創(chuàng)建有效的免疫治療方法,同時(shí)也提示腫瘤微環(huán)境在抑制或增強(qiáng)免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用.

PD-1(programmed cell death protein 1,程序性死亡受體1)是免疫檢測(cè)點(diǎn)蛋白之一,是1種重要的免疫抑制分子,表達(dá)于T細(xì)胞和初級(jí)B細(xì)胞表面,在其分化和凋亡過程中發(fā)揮作用[4].PD-1有2個(gè)配體,PD-L1(programmed cell death Ligand 1,程序性死亡配體 1 )和PD-L2(programmed cell death Ligand 2,程序性死亡配體 2)[5].PD-L1蛋白表達(dá)于多種細(xì)胞表面[6],通過與T細(xì)胞上的PD-1受體相互作用,從而抑制T細(xì)胞的活化,引起T細(xì)胞凋亡,在免疫應(yīng)答的負(fù)性調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用.在許多人類腫瘤組織中均可檢測(cè)到PD-L1蛋白的表達(dá),腫瘤部位的微環(huán)境也可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1蛋白[6],當(dāng)腫瘤細(xì)胞上的PD-L1與T細(xì)胞上的PD-1結(jié)合時(shí),T細(xì)胞活化受抑制而不能識(shí)別腫瘤細(xì)胞,從而導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸.在該免疫抑制環(huán)境下,癌細(xì)胞能夠無限制地增殖,從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生及發(fā)展.通過阻斷負(fù)性免疫調(diào)節(jié)因子與癌細(xì)胞的相互作用,或阻斷其受體對(duì)免疫效應(yīng)細(xì)胞的抑制作用來逆轉(zhuǎn)這些效應(yīng),原則上有助于消除癌癥.

PD-1/PD-L1是目前腫瘤免疫治療中最具潛力的治療靶點(diǎn).以PD-1/PD-L1為代表的免疫檢查點(diǎn)抗體抑制劑已經(jīng)應(yīng)用到臨床,在改善各種晚期癌癥的臨床治療中取得了顯著的效果,如PD-1抗體抑制劑Pembrolizumab和Nivolumab已被FDA批準(zhǔn)用于治療晚期黑色素瘤、非小細(xì)胞性肺癌、霍奇金淋巴瘤和頭頸鱗癌等[7-10].除此之外,其他多種PD-1/PD-L1單克隆抗體抑制劑也進(jìn)入臨床研究,如Atezolizumab和Durvalumab等已進(jìn)入Ⅲ期臨床研究,治療范圍覆蓋非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、膀胱癌等多個(gè)瘤種[11-13].目前上市和進(jìn)入臨床研究的PD-1/PD-L1抑制劑皆為抗體類藥物,其小分子藥物的研究較為滯后,僅有PD-1/PD-L1小分子抑制劑的少量報(bào)道[14-15],這也給PD-1/PD-L1小分子抑制劑藥物的研發(fā)留下了很大的空間.為了能快速發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1小分子抑制劑,采用酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme Linked Immuno sorbnent Assay, ELISA)方法,建立了PD-1/PD-L1抑制劑體外篩選模型,并對(duì)其篩選條件進(jìn)行了優(yōu)化,對(duì)篩選模型的有效性進(jìn)行了驗(yàn)證.最后利用該篩選模型,對(duì)一些具有抗炎活性的植物提取物進(jìn)行了活性篩選.

1 材料

1.1 試劑與耗材

BMS202(PD-1/PD-L1 inhibitor)購(gòu)自Selleck公司；Human PD-L1 Protein和Biotinylated Human PD-1 Protein購(gòu)自北京義翹神州科技有限公司；HRP-conjugated Avidin和TMB顯色液購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；NaCl購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司； Hepes購(gòu)自Biological Industries公司；α-Dithiothreitol購(gòu)自Sigma公司；Tris購(gòu)自上海生工生物公司；牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自Biosharp生物科技有限公司；其他常用試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?高吸附ELISA 96孔板購(gòu)自Corning公司.

1.2 儀器

SpectraMax i3x型微孔板檢測(cè)器(Molecular devices,美國(guó))；QB-9006型恒溫加熱搖床(其林貝爾,中國(guó)).

2 方法與結(jié)果2.1 實(shí)驗(yàn)原理

將PD-1蛋白包被于96孔板,加入待測(cè)化合物和Biotinylated PD-L1蛋白,PD-1特異性地結(jié)合PD-L1,去除未結(jié)合的PD-L1蛋白后,加入HRP-conjugated Avidin,利用Biotin與 Avidin的高度特異性結(jié)合作用,將HRP間接標(biāo)記于PD-1蛋白,最后利用HRP特異性底物 TMB顯色(圖1).在此過程中若待測(cè)物能抑制PD-1/PD-L1的結(jié)合,則最終生成的有色產(chǎn)物量減少,吸光度值降低.

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

PD-1蛋白用Coating Buffer(20 mmol/L Hepes, pH 7.4；50 mmol/L NaCl；1 mmol/Lα-Dithiothreitol)稀釋后,加入96孔板內(nèi),每孔100 μL,4 ℃ 包被15～18 h后,棄上清,每孔加入100 μL Blocking Buffer(含2% BSA 的 Coating Buffer),室溫封閉1 h.棄封閉液之后加入 Biotinylated PD-L1,室溫反應(yīng)2 h.棄上清,每孔加入200 μL Washing Buffer(200 mmol/L Tris, pH 7.4；1.5 mmol/L NaCl；0.1% BSA；0.05% Tween 20)去除未結(jié)合的蛋白與雜質(zhì).每孔加入 100 μL用Coating Buffer稀釋的過量HRP-conjugated Avidin,室溫?fù)u床反應(yīng)1 h,隨后每孔加入200 μL Washing Buffer 徹底洗滌未結(jié)合的Avidin. 最后,每孔加入100 μL TMB顯色液,室溫?fù)u床反應(yīng)30 min后,每孔加入50 μL 1N H2SO4溶液終止反應(yīng),于450 nm處檢測(cè)其吸光度.

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

分別對(duì)PD-1和PD-L1的質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化.取PD-1儲(chǔ)備液,用Coating Buffer分別稀釋為 0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 μg/mL的工作液,并將其加入96孔板中進(jìn)行包被,每個(gè)質(zhì)量濃度組均設(shè)至少3個(gè)平行復(fù)孔.之后每孔加入0.40 μg/mL PD-L1溶液孵育并按照2.2的實(shí)驗(yàn)方法最終檢測(cè)吸光度.結(jié)果如圖2紅色曲線所示,隨著PD-1質(zhì)量濃度的升高,PD-1與其配體PD-L1的結(jié)合逐漸增多,表現(xiàn)為光吸收值也逐漸增大.從實(shí)驗(yàn)經(jīng)濟(jì)性及檢測(cè)靈敏度考慮,選取光吸收值為1～2之間的PD-1質(zhì)量濃度為試驗(yàn)中底物的包被濃度,即PD-1質(zhì)量濃度確認(rèn)為0.50 μg/mL.

確定PD-1質(zhì)量濃度之后,用0.50 μg/mL的PD-1溶液包被96孔板,再用Binding Buffer(0.05% Tween 20的Coating Buffer)分別稀釋至 0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 μg/mL的PD-L1溶液加入已包被PD-1的96孔板中,每個(gè)質(zhì)量濃度組至少設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔,按照2.2的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)光吸收值.如圖2所示,隨著PD-L1質(zhì)量濃度的升高,光吸收值也逐漸升高,且數(shù)值增加幅度在PD-L1質(zhì)量濃度達(dá)到0.4 μg/mL后呈現(xiàn)減弱趨勢(shì).從實(shí)驗(yàn)經(jīng)濟(jì)性及檢測(cè)靈敏度考慮,最終確定PD-L1的反應(yīng)質(zhì)量濃度為0.30 μg/mL.

2.4 模型驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)條件確定后,采用目前已知的抑制劑來驗(yàn)證模型的可靠性.實(shí)驗(yàn)結(jié)果來自至少6次獨(dú)立實(shí)驗(yàn).BMS202是2015年Bristol-Myers Squibb(BMS)公司首次公開報(bào)道的合成類PD-1/PD-L1小分子抑制劑[15].將 BMS202溶解于DMSO中,之后用Coating Buffe將其分別稀釋至0、25、50、100、400、1 000 nmol/L,加入已包被PD-1蛋白的96孔板中,之后按2.2所述步驟開展實(shí)驗(yàn),最后于450 nm下檢測(cè)OD值.結(jié)果如圖3所示,BMS202能夠劑量依賴性地抑制PD-1和PD-L1的相互作用,其IC50為123.42±1.52 nmol/L,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已知報(bào)道相符,說明了PD-1/PD-L1抑制劑篩選模型的有效性,后續(xù)可用于靶向PD-1/PD-L1抑制劑的篩選研究.

2.5 活性篩選

利用已建立的PD-1/PD-L1篩選模型對(duì)32個(gè)植物來源的天然產(chǎn)物樣品進(jìn)行了活性篩選,包括24個(gè)單體化合物和8個(gè)植物提取物樣品.提取物樣品分別來自菊科植物蒼耳和落葵科植物落葵薯,在200 μg/mL 質(zhì)量濃度下其部分樣品對(duì)PD-1/PD-L1顯示一定抑制作用(表1).蒼耳子為植物蒼耳的干燥成熟果實(shí),為臨床常用中藥,具有宣肺通鼻、祛濕散寒的功效,臨床用于鼻炎、關(guān)節(jié)炎等的治療[16].落葵薯是落葵科落葵薯屬纏繞藤本植物,其珠芽、葉及根可供藥用,具有滋補(bǔ)、消腫散瘀等功效[17].樣品溶解于DMSO中,用Binding Buffer稀釋到相應(yīng)濃度后加入已包被PD-1蛋白的96孔板中室溫孵育10 min,之后按照2.2的實(shí)驗(yàn)方法操作并檢測(cè)吸光度并計(jì)算百分抑制率(I%).結(jié)果顯示,在100 μmol/L摩爾濃度下,所有化合物對(duì)PD-1/PD-L1沒有明顯的抑制作用(I% < 50%).在200 μg/mL質(zhì)量濃度下,植物提取物對(duì)PD-1/PD-L1的抑制率及植物來源見表1.

表1 植物提取物在200 μg/mL質(zhì)量濃度下對(duì)PD-1/PD-L1的抑制作用及其來源

3 討論

免疫治療近年來取得的成績(jī)給治愈腫瘤帶來了新的希望.隨著人們對(duì)腫瘤的認(rèn)識(shí)越來越深刻,腫瘤治愈的種種困難也昭然若揭,深入探討腫瘤微環(huán)境是解決腫瘤問題的關(guān)鍵. PD-1/PD-L1作為腫瘤微環(huán)境中重要的免疫檢查點(diǎn),其靶向性抗體藥物的陸續(xù)上市,給許多“無藥可治”的晚期黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等患者帶來了希望[4],因此,開發(fā)PD-1/PD-L1 藥物逐漸成為熱點(diǎn).體外分子靶向篩選模型是目前藥物篩領(lǐng)選領(lǐng)域的重要研究?jī)?nèi)容,相對(duì)于傳統(tǒng)整體和器官水平的篩選模式,分子水平的篩選模型具有反應(yīng)體積小、靈敏快速、特異性強(qiáng)、高效簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),適宜開展高通量藥物篩選.采用ELISA方法建立分子水平的PD-1/PD-L1抑制劑篩選模型,在微孔板上進(jìn)行反應(yīng)檢測(cè),樣品消耗量少,特別適用于微量天然產(chǎn)物的活性篩選.

4 結(jié)語

通過PD-1/PD-L1抑制劑篩選模型,對(duì)32個(gè)植物來源的天然產(chǎn)物樣品進(jìn)行了活性篩選,包括24個(gè)化合物和8個(gè)提取物.在篩選濃度下,化合物都沒有顯示明顯抑制作用.其功效表明2種植物都具有免疫調(diào)節(jié)的作用,在進(jìn)行植物化學(xué)研究的同時(shí),結(jié)合PD-1/PD-L1篩選模型進(jìn)行活性篩選,可以對(duì)其進(jìn)行活性成分的追蹤分離,提高發(fā)現(xiàn)活性化合物的效率.