姚玉昌，翟羽飛，宋旭婷，趙多維，陸 奇，徐利強(qiáng)，亓美玉，陸明海

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱 150086；3.黑龍江省農(nóng)墾科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，哈爾濱 150431）

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）所致急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]，流行快、傳播廣、發(fā)病急，是危害最嚴(yán)重的動(dòng)物疫病之一[2]?？谔阋卟《緦儆谖⒑颂呛怂岵《究瓶谔阋卟《緦?，可感染70多種偶蹄目動(dòng)物[3]，對(duì)年幼動(dòng)物致死率較高[4]，可在一段時(shí)間內(nèi)影響成年動(dòng)物生產(chǎn)力[5]，包括體重降低、奶產(chǎn)量減少等。研究表明，牛、山羊和綿羊在感染口蹄疫后會(huì)成為攜帶者，2～3年內(nèi)攜帶病毒[6]。目前，口蹄疫滅活疫苗是生產(chǎn)中防治口蹄疫主要手段。

Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）作為識(shí)別革蘭氏陰性菌模式識(shí)別受體，在激活機(jī)體先天性免疫過程中具有重要作用[7]，是最早發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物TLR蛋白。近年研究發(fā)現(xiàn)，TLR4也可與部分病毒蛋白（例如流感病毒[8]、呼吸道合胞病毒[9]等）互相作用，激活下游IFN-β，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[10]。TLR4通過以TRIF為主的非依賴性途徑，激活I(lǐng)RF-3，分泌IFN-β[11]，抑制口蹄疫病毒復(fù)制和傳播。Zhi等研究表明，F(xiàn)MDV刺激小鼠巨噬細(xì)胞后，TLR4的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，IL-6、IL-1β、IFN-β等細(xì)胞因子表達(dá)均顯著提高[12]。TLR4基因在機(jī)體對(duì)口蹄疫免疫應(yīng)答過程中的介導(dǎo)作用目前仍不清楚。

本研究在前期獲得過表達(dá)TLR4基因綿羊基礎(chǔ)上，建立口蹄疫滅活疫苗（O型）免疫模型，旨在闡明免疫后血液中免疫細(xì)胞組成和口蹄疫抗體水平動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，揭示細(xì)胞免疫和體液免疫狀態(tài)，為解析TLR4基因在口蹄疫免疫應(yīng)答過程中作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇體況良好、18～21月齡健康德國(guó)肉用美利奴公羊14頭，其中過表達(dá)TLR4基因公羊和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ展蚋?頭，均無口蹄疫感染史和口蹄疫疫苗接種史，由國(guó)家轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)課題組提供。試驗(yàn)羊飼養(yǎng)于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)綿羊新品種培育基地，每日提供全價(jià)精飼料0.5 kg，羊草自由采食，自由飲水。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物免疫及樣品采集

本研究選用O型口蹄疫滅活疫苗（OS株），由中農(nóng)威特生物科技股份有限公司生產(chǎn)。每頭試驗(yàn)羊肌肉注射口蹄疫疫苗2 mL，分別在第0、1、3、5、7、14、21、49天采集各組試驗(yàn)動(dòng)物頸靜脈全血，分離血清和淋巴細(xì)胞。

1.3 引物合成

根據(jù)GenBank中提供綿羊β-actin基因（NM_001009784.3）和TLR4基因序列（NM_001135930.1），利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子定量PCR引物，引物序列見表1，引物合成由金唯智生物科技（北京）有限公司完成。

表1 定量PCR引物序列Table 1 Primers sequence for real-time PCR

1.4 血常規(guī)檢測(cè)

采集頸靜脈血2 mL至EDTA抗凝管后，置于冰盒，4 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，利用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（ProCyte DX，美國(guó)Idexx公司）檢測(cè)血液中紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、血紅蛋白含量（HGB）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、白細(xì)胞（WBC）、中性粒細(xì)胞百分比（%NEU）、淋巴細(xì)胞百分比（%LYM）、單核細(xì)胞百分比（%MONO）、嗜酸性粒細(xì)胞百分比（%EOS）、嗜堿性粒細(xì)胞百分比（%BASO）、血小板（PLT）、平均血小板體積（MPV）。

1.5 外周血淋巴細(xì)胞分離

頸靜脈采集羊全血10 mL加入肝素抗凝管中，反復(fù)顛倒若干次使管內(nèi)肝素與血液混勻?？鼓屑尤胂嗤w積生理鹽水稀釋并混勻，取稀釋后血液置于淋巴細(xì)胞分離液（購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰荆┮好妫ㄏ♂尯笱号c淋巴細(xì)胞分離液比例為1∶1），2 500 r·min-1（×500 g）離心20 min，此時(shí)離心管中由上至下細(xì)胞分為4層，收集第2層絮狀乳白色淋巴細(xì)胞至離心管中，2 300 r·min-1（×500 g）離心7 min，棄上清，沉淀分為3部分，第1部分沉淀加入Buffer RLT裂解，待提取RNA；第2部分加入1 mL PBS輕輕吹打重懸，所得細(xì)胞用于流式細(xì)胞分析。

1.6 淋巴細(xì)胞亞群分析

用1×PBS緩沖液重懸淋巴細(xì)胞，2 300 r·min-1（×500 g）離心7 min后加入1 mL紅細(xì)胞裂解液吹打均勻，冰上孵育15 min，期間顛倒1次；2 300 r·min-1（×500 g）離心7 min，取沉淀加入1 mL含1%FBS的PBS重懸，2 300 r·min-1（×500 g）離心7 min；100倍稀釋單克隆抗體CD4-RPE與CD8-FITC雙染避光孵育30 min，2 300 r·min-1（×500 g）離心7 min，棄上清，加入1 mL 1%多聚甲醛固定細(xì)胞，吹打均勻，2 300 r·min-1（×500 g）離心7 min；沉淀用0.6 mL滅菌1×PBS緩沖液重懸，每組樣品收集10 000個(gè)細(xì)胞，流式細(xì)胞儀（FACS Calibur，美國(guó)BD公司）上機(jī)檢測(cè)。

1.7 血清中特異性抗體水平檢測(cè)

利用中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所O型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA試劑盒，分別在免疫后0、3、5、7、14、21、49 d檢測(cè)血清中特異性抗體水平，具體操作步驟和判定標(biāo)準(zhǔn)依照說明書，若臨界值＞1∶1024，則將樣品血清稀釋后重新測(cè)定。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

提取淋巴細(xì)胞并用Buffer RLT裂解后，按照AXYGEN細(xì)胞總RNA小量制備試劑盒（貨號(hào)：AXK-AP-MN-MS-RNA-250G）說明書操作。將提取1 μL RNA樣品在1.5%瓊脂糖凝膠上120 V電壓電泳10 min，檢測(cè)提取RNA完整度。取1 μL RNA樣品滴入微量檢測(cè)儀檢測(cè)總RNA純度和濃度，并將RNA濃度調(diào)整至同一數(shù)值。按照TakaraPrime-Script? RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA。利用Roche公司SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒和ABI 7500 Fast Real Time PCR儀實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系為cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.4 μL，SYBR?Premix Ex TaqⅡ 5 μL，加入ddH2O至10 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃終延伸7 min。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物詳見表1，試驗(yàn)每個(gè)基因設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照。檢測(cè)免疫疫苗后淋巴細(xì)胞中TLR4基因表達(dá)情況，以β-actin為內(nèi)參基因，采用相對(duì)定量法計(jì)算目的基因表達(dá)量。

1.9 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，“*”和P＜0.05為差異顯著，“**”和P＜0.01為差異極顯著，所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±S.E.M）。

2 結(jié)果與分析

2.1 淋巴細(xì)胞中TLR4基因表達(dá)變化

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TLR4基因表達(dá)水平變化，結(jié)果如圖1所示。在口蹄疫疫苗免疫后兩組TLR4基因表達(dá)趨勢(shì)一致，mRNA水平首先降低，再持續(xù)升高；轉(zhuǎn)基因組TLR4基因表達(dá)水平高于非轉(zhuǎn)基因組，但未達(dá)差異顯著（P＞0.05）。

2.2 血常規(guī)分析

利用全血自動(dòng)分析儀檢測(cè)口蹄疫疫苗免疫后血液中各類型細(xì)胞數(shù)量變化，結(jié)果見表2、3及圖2，指標(biāo)均在綿羊正常參數(shù)范圍。

由表2可知，免疫后0～21 d，試驗(yàn)羊紅細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)均無顯著變化（P＞0.05），包括紅細(xì)胞、紅細(xì)胞比容、血紅蛋白、平均紅細(xì)胞體積、平均血紅蛋白量、平均血紅蛋白濃度、網(wǎng)織紅細(xì)胞。白細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)變化見表3。

表2 免疫后紅細(xì)胞指標(biāo)變化Table 2 Effect on RBC after immunization

表3 免疫后白細(xì)胞指標(biāo)變化Table 3 Effect on WBC after immunization

由表3可知，免疫后3～21 d，非轉(zhuǎn)基因組白細(xì)胞數(shù)量隨免疫時(shí)間延續(xù)逐漸減少，轉(zhuǎn)基因組白細(xì)胞數(shù)量呈波動(dòng)變化，但兩組間差異不顯著（P＞0.05）；免疫后淋巴細(xì)胞占比略降低，隨后趨于穩(wěn)定，轉(zhuǎn)基因組略高于非轉(zhuǎn)基因組，但未達(dá)差異顯著（P＞0.05）；免疫后第3天單核細(xì)胞占比升高，后趨于穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)基因組與非轉(zhuǎn)基因組間差異不顯著（P＞0.05）；中性粒細(xì)胞占比在免疫后第3天開始升高，隨后波動(dòng)降低，轉(zhuǎn)基因組和非轉(zhuǎn)基因組間差異不顯著（P＞0.05）；嗜酸性粒細(xì)胞占比和嗜堿性粒細(xì)胞占比在轉(zhuǎn)基因組與非轉(zhuǎn)基因組間差異不顯著（P＞0.05）。由圖2可知，血小板、平均血小板體積，過表達(dá)TLR4基因綿羊（轉(zhuǎn)基因組）與非轉(zhuǎn)基因綿羊（非轉(zhuǎn)基因組）間無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 T淋巴細(xì)胞亞群變化

利用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)口蹄疫疫苗（O型）免疫后血液中T淋巴細(xì)胞亞群變化（見圖3～4）?？芍?，CD4+T細(xì)胞亞群在免疫后第7天出現(xiàn)高峰，第14天時(shí)短暫降低，第21天再次升高，轉(zhuǎn)基因組總體水平略高于非轉(zhuǎn)基因組，差異不顯著（P＞0.05）；CD8+T細(xì)胞亞群在免疫后7 d達(dá)到高峰期，隨時(shí)間延續(xù)逐漸趨于穩(wěn)定，轉(zhuǎn)基因組與非轉(zhuǎn)基因組間差異不顯著（P＞0.05）。隨免疫后時(shí)間延續(xù)CD4+與CD8+比值（CD4+/CD8+）總體呈上升趨勢(shì)，第14天轉(zhuǎn)基因組CD4+/CD8+比值顯著高于非轉(zhuǎn)基因組（P＜0.05）。

2.4 血液中O型口蹄疫抗體水平消長(zhǎng)規(guī)律

口蹄疫疫苗免疫0～49 d檢測(cè)血清中特異性抗體水平變化，如圖5所示。由圖5可知，轉(zhuǎn)基因組與非轉(zhuǎn)基因組抗體消長(zhǎng)趨勢(shì)一致，免疫后3～7 d，抗體水平持續(xù)升高；免疫后7～14 d，抗體水平達(dá)到高峰，進(jìn)入平臺(tái)期。轉(zhuǎn)基因組抗體水平略高于非轉(zhuǎn)基因組，但未達(dá)到差異顯著水平（P＞0.05）。

3 討論與結(jié)論

先天性免疫反應(yīng)為宿主抵御病毒感染第一道防線，可通過活化T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和產(chǎn)生特異性抗體等方式，激活細(xì)胞免疫和體液免疫，發(fā)揮清除病原體的作用[13]。TLR4基因作為先天免疫系統(tǒng)重要組成，被視為機(jī)體識(shí)別革蘭氏陰性菌特異性受體。近年研究表明，TLR4基因還參與病毒感染性疾病發(fā)生和病毒免疫逃逸過程，一些病毒識(shí)別和抗病毒通路激活也與Toll樣受體關(guān)系密切[14]。埃博拉病毒糖蛋白（GP）可與TLR4基因互作進(jìn)而活化NF-κB途徑，介導(dǎo)細(xì)胞因子生成，有助于緩解埃博拉病毒感染中循環(huán)休克[15]。水皰性口炎病毒（VSV）可經(jīng)TLR4/CD14活化PI3K/AKT途徑介導(dǎo)I型干擾素生成，具有抗病毒作用[16]。Zhi等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV是激活小鼠和豬巨噬細(xì)胞重要先天免疫信號(hào)，TLR4 mRNA表達(dá)水平在口蹄疫病毒感染后顯著上調(diào)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，TLR4基因表達(dá)水平在免疫3 d后降低，7～21 d持續(xù)升高，與Zhi等研究結(jié)果有一定差異，可能由于前人采用口蹄疫病毒活毒株直接作用于巨噬細(xì)胞，本文利用口蹄疫滅活疫苗注射，于綿羊體內(nèi)不同時(shí)期分離巨噬細(xì)胞檢測(cè)TLR4水平，體內(nèi)、外試驗(yàn)存在差距，相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

血常規(guī)指標(biāo)可直觀反映疾病變化，在人類和動(dòng)物健康檢測(cè)、臨床診斷和預(yù)后中廣泛應(yīng)用[17]。本研究口蹄疫疫苗免疫21 d后，白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞占比均有不同程度降低。賀凱麗研究也表明，荷斯坦奶牛免疫口蹄疫疫苗后，白細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)下降，說明疫苗激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)[18]，與本研究結(jié)果一致。疫苗免疫后，淋巴細(xì)胞中部分B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生口蹄疫抗體，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率提高，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞總量減少[19]，與本研究結(jié)果中淋巴細(xì)胞含量降低后趨于穩(wěn)定一致。嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞與過敏反應(yīng)和抗敏反應(yīng)密切相關(guān)，本試驗(yàn)嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞值均在正常范圍且不涉及過敏反應(yīng)。轉(zhuǎn)基因組與非轉(zhuǎn)基因組免疫細(xì)胞變化趨勢(shì)一致，結(jié)果表明口蹄疫疫苗免疫后機(jī)體免疫應(yīng)答系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)作用。

T淋巴細(xì)胞亞群負(fù)責(zé)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞免疫，具有抵抗病原侵入和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能。CD4+T細(xì)胞在擴(kuò)大和建立免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，特異性CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可幫助抵抗FMDV[20]。CD8+T細(xì)胞參與識(shí)別病毒和消除病毒引起的感染[21]。在機(jī)體正常狀態(tài)下，機(jī)體中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量處于相對(duì)平衡狀態(tài)，二者失衡時(shí)T淋巴細(xì)胞無法有效輔助或抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞，影響B(tài)淋巴細(xì)胞發(fā)育和IgG合成，出現(xiàn)體液免疫功能紊亂。因此，CD4+、CD8+T細(xì)胞分群檢測(cè)可作為免疫功能分析及判斷免疫水平重要方法[7,22]。本研究中，免疫后各時(shí)期CD4+和CD8+細(xì)胞數(shù)量均在正常范圍內(nèi)。轉(zhuǎn)基因組中CD4+T細(xì)胞數(shù)量略高于非轉(zhuǎn)基因組，變化規(guī)律與其生物學(xué)功能一致，即CD4+提高時(shí)機(jī)體免疫反應(yīng)增強(qiáng)。蔡虎等研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)注射口蹄疫疫苗免疫28 d的豬強(qiáng)毒攻毒，外周血淋巴細(xì)胞中CD4+細(xì)胞數(shù)量顯著升高[23]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。CD4+/CD8+比值越高，抵抗FMDV感染能力越強(qiáng)[24]，本研究中羊在免疫口蹄疫疫苗后第3天，CD4+/CD8+比值較高，表明機(jī)體免疫機(jī)能增強(qiáng)。第14天，轉(zhuǎn)基因羊CD4+/CD8+比值顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ昭?，代表轉(zhuǎn)基因羊細(xì)胞免疫反應(yīng)更強(qiáng)。

注射免疫口蹄疫（O型）疫苗后可有效誘發(fā)機(jī)體抗體水平提升，綿羊注射口蹄疫疫苗后第7天即產(chǎn)生抗體[25]，11～14 d時(shí)，抗體陽性率達(dá)到最高值；免疫后50 d，抗體水平開始逐漸下降，失去保護(hù)力[27]。本研究中，血清中抗體水平在14 d達(dá)到峰值，抗體消長(zhǎng)規(guī)律與前人報(bào)道結(jié)果一致[27]。過表達(dá)TLR4基因羊的抗體水平略高于非轉(zhuǎn)基因羊，盡管未達(dá)差異顯著（P＞0.05），但口蹄疫抗體水平與保護(hù)效果呈正相關(guān)，因此過表達(dá)TLR4基因羊較高的抗體水平可提供更有效保護(hù)。