韓英鵬，卜凡珊，田利崢，姜海鵬，趙 雪

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所，大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北大豆生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

大豆胞囊線蟲?。⊿oybean cyst nematode，SCN，Heterodera glycines Ichinohe）是世界范圍大豆寄生性病害[1-2]，因其不同種群存在致病力差異而被分為不同生理小種，我國(guó)以致病小種1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)為主，其中3號(hào)生理小種是東北大豆產(chǎn)區(qū)優(yōu)勢(shì)生理小種[3]。目前選育優(yōu)良抗性品種是控制SCN發(fā)生最經(jīng)濟(jì)、有效方法，因此篩選抗病候選基因分子輔助育種具有重要意義[4]。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq）已在大豆胞囊線蟲基因資源挖掘方面得到廣泛應(yīng)用[5]。吳書峰等以抗SCN 4號(hào)生理小種黑豆為研究對(duì)象，在大豆胞囊線蟲侵染后兩個(gè)發(fā)育時(shí)期作轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分別獲得2 180個(gè)和4 210個(gè)差異表達(dá)基因[6]。Li等通過轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)感染SCN 3號(hào)生理小種后大豆根系基因表達(dá)量顯著上調(diào)或下調(diào)[7]。

AP2/EREBP為參與植物生長(zhǎng)發(fā)育，調(diào)控細(xì)胞周期及應(yīng)對(duì)逆境脅迫的一類植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子超家族[8]，Shigyo等將其又劃分為AP2、DREB、RAV、ERF和Soloist等5個(gè)亞家族，AP2亞家族（APETALA2）含有兩個(gè)重復(fù)的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域[9]。RAV亞家族（ABI3/VP1）包含一個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域和一個(gè)B3結(jié)構(gòu)域，可識(shí)別CAACA和CACCTG序列[10-11]。DREB亞家族（脫水反應(yīng)元件結(jié)合蛋白）和ERF亞家族（乙烯反應(yīng)因子）包含一個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)亞家族主要區(qū)別為ERF亞家族AP2結(jié)構(gòu)域第14位和第19位氨基酸殘基為丙氨酸和天冬氨酸，而DREB亞家族為纈氨酸和谷氨酸，其中纈氨酸在DNA結(jié)合特異性中發(fā)揮重要作用[12]。

隨著大豆抗病遺傳育種研究不斷深入，相關(guān)AP2/EREBP基因家族研究也逐漸深化。AP2/ERF家族中GmERF057與大豆耐鹽性和抗病性相關(guān)[13]，GmRAV可能作為一種負(fù)調(diào)節(jié)因子作用于光合作用和植物生長(zhǎng)[14]。Mazarei等在大豆中依次分離出4個(gè)CBF/DREB同源基因[15]，但其與SCN作用機(jī)制尚不清楚，有待驗(yàn)證。

本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)篩選大豆胞囊線蟲病3號(hào)生理小種抗性相關(guān)AP2/EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子，并對(duì)其作生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究大豆胞囊線蟲病相關(guān)AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為選育抗SCN品種提供基因資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆材料“東農(nóng)L-10”來源于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大豆胞囊線蟲病3號(hào)生理小種采集自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所試驗(yàn)田，已鑒定其抗病性。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序材料準(zhǔn)備

將東農(nóng)L-10材料種植于蛭石中，每行10株，設(shè)置對(duì)照，3次重復(fù)，在室溫24℃，光照16 h，黑暗8 h條件下培養(yǎng)。待大豆種子長(zhǎng)成幼苗后，轉(zhuǎn)移至病土中培養(yǎng)。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

線蟲侵染0和8 d后，取大豆根組織，迅速液氮處理，然后利用Trizol Reagene（Invitrogen,Carlsbad）提取總RNA，保存于-80℃冰箱備用。利用Illumina TruSeq RNA樣品制備試劑盒構(gòu)建cDNA文庫，Illumina HiSeqTM2500 cDNA測(cè)序。在測(cè)序結(jié)果中篩選大豆胞囊線蟲病3號(hào)生理小種在東農(nóng)L-10大豆脅迫條件下差異表達(dá)的AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子。

1.2.3 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

大豆胞囊線蟲病3號(hào)生理小種相關(guān)AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子信息下載于NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）。通過在線軟件ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）分析大豆胞囊線蟲病AP2/EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子氨基酸殘基數(shù)、分子質(zhì)量、脂肪系數(shù)、等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)疏水性等理化性質(zhì)。

1.2.4 AP2/EREBP保守結(jié)構(gòu)域分析

通過在線軟件TAIR（https://www.arabidopsis.org/browse/genefamily/index.jsp）下載擬南芥全基因組AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子信息。利用MEGA 5.05軟件將候選大豆胞囊線蟲與擬南芥AP2/EREBP家族蛋白作多序列比對(duì)，通過GeneDoc軟件分析大豆胞囊線蟲AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子蛋白保守域和結(jié)構(gòu)元件。

1.2.5 構(gòu)建系譜進(jìn)化樹

利用上述氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，通過MEGA 5.05軟件繪制系譜進(jìn)化樹。

1.2.6 亞細(xì)胞定位

利用WoLF PSORT:Protein Subcellular Localization Prediction（https://wolf psort.hgc.jp/）在線工具對(duì)14個(gè)AP2/EREBP作蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.2.7 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利 用 SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/npsa_sopma.html）分析AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，且通過SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.expasy.org）預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達(dá)AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子分析

通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果篩選出14個(gè)差異表達(dá)AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子，利用NCBI鑒定AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)，確定有無AP2結(jié)構(gòu)域，再根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，初步篩選并分類AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果見表1。

2.2 AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

通過在線軟件Protparam分析大豆胞囊線蟲AP2/EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)理化性質(zhì)。結(jié)果表明，AP2亞族蛋白質(zhì)氨基酸殘基數(shù)195～488，ERF亞族為122～408，DREB亞族為333～352；AP2亞族中AP2-1和AP2-3蛋白質(zhì)等電點(diǎn)呈堿性，AP2-2和AP2-4蛋白質(zhì)等電點(diǎn)呈酸性；ERF亞族中除ERF-4和ERF-6蛋白中等電點(diǎn)呈堿性，其余均呈酸性；DREB亞族中DREB-1和DREB-2蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分別為8.23和5.71，分別呈酸性和堿性。總體上看，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)在酸性范圍內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量多于堿性范圍，大豆胞囊線蟲AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白富含酸性氨基酸，且全部家族蛋白質(zhì)總平均親水性GRAVY均為負(fù)值，表明均屬于親水性蛋白，且熱穩(wěn)定性較高（見表1）。

表1 AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of AP2/EREBP transcription factor family

2.3 AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域分析

通過在線軟件MEGA 5.05和GeneDoc對(duì)大豆胞囊線蟲14個(gè)AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子和擬南芥結(jié)構(gòu)域作序列比對(duì)。結(jié)果表明，兩者存在差異，但以YRG元件、RAYD元件、WLG基序?yàn)楹诵牡谋Ｊ亟Y(jié)構(gòu)域保守性高（見圖1）。序列ERF-2和DREB-1含有FIG元件，序列ERF-8和DREB-2含有FRG元件，除此之外大部分序列均含有YRG元件；序列AP2-3、ERF-2、ERF-4、ERF-6和DREB-2均含有LAYD元件，序列AP2-2和AP2-4均含有TAYD元件，序列ERF-1、ERF-3和ERF-8分別含有MAYD、AAYD、IVYD元件，僅序列AP2-1、ERF-5、ERF-7和DREB-1含有RAYD元件；ERF-6序列保守結(jié)構(gòu)域與擬南芥ERF-B3-AT3G32400、ERF-B6-AT4G27960序列保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)第14位及第19位分別為丙氨酸和天冬氨酸，可推測(cè)上述序列屬于ERF亞族。其中DREB-1保守結(jié)構(gòu)域14位為纈氨酸，第19位為天冬氨酸，而擬南芥DREBA2-AT3G11020第19位為谷氨酸，兩者存在顯著差異（見圖1）。

2.4 AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族系譜進(jìn)化分析

利用擬南芥數(shù)據(jù)庫篩選45個(gè)擬南芥AP2/EREBP序列，包括AP2、ERF、DREB、RVA以及Soloist 5個(gè)亞族，其中ERF亞族又可分為B1、B2、B3、B4、B5和B6共6個(gè)亞組，DREB分為A1、A2、A3、A4、A5和A6共6個(gè)亞組。利用MAGA 5.05軟件構(gòu)建系譜進(jìn)化樹（見圖2）。結(jié)果表明，大豆胞囊線蟲AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子分別分布在AP2、ERF和DREB亞族中。AP2亞族包含4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子分別為AP2-1、AP2-2、AP2-3和AP2-4；ERF亞家族轉(zhuǎn)錄因子分別與ERF-B5-AT4G23750、ERF-B3-AT4G34410和ERF-B3-AT3G23240處于同一分支，表明大豆胞囊線蟲ERF亞族分屬于B3、B5亞類；DREB亞族中DREB-1和DREB-2均與DREB-A2-AT3G11020和DREB-A5-AT1G46768距離較近，說明其同源性高，進(jìn)一步驗(yàn)證上述初步分類結(jié)果。大豆胞囊線蟲與擬南芥AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列之間存在差異，但其家族蛋白分類與擬南芥AP2/EREBP各亞族分類相似，遺傳路徑相同。

2.5 亞細(xì)胞定位

通過對(duì)AP2/EREBP蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)（見表2），結(jié)果顯示AP2-1和ERF-2定位于線粒體中，DREB-1定位于葉綠體中，其余11個(gè)AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子均定位于細(xì)胞核中，說明植物在受到逆境脅迫，尤其是遭遇大豆胞囊線蟲病時(shí)，AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族發(fā)揮重要作用的位置可能為細(xì)胞核，其次為線粒體，最后為葉綠體。

表2 AP2/EREBP基因家族亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Table 2 Prediction of subcellular location of AP2/EREBP gene family

2.6 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.6.1 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用SOPMA分析大豆胞囊線蟲AP2/EREBP蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（見圖3），結(jié)果顯示氨基酸序列以無規(guī)則卷曲為主要組成成分，α-螺旋次之，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角則散布于蛋白序列中。

2.6.2 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

在3個(gè)亞家族中選取代表性序列，利用SWISSMODEL預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，AP2、ERF和DREB分別以AP2-3、ERF-1和DREB-1為代表，與擬南芥蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型比對(duì)，AP2亞族有兩個(gè)相同AP2結(jié)構(gòu)域，而ERF和DREB亞族含1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域。結(jié)果表明，大豆胞囊線蟲AP2/EREBP家族蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型與擬南芥接近（見圖4）。

3 討 論

轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成、次生代謝、抗逆性等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用。自Paz-Ares首次克隆玉米轉(zhuǎn)錄因子以來，相繼分離出數(shù)百種與植物生物脅迫和非生物脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子[16]。其中AP2/EREBP家族作為植物最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其轉(zhuǎn)錄因子家族成員全基因組發(fā)掘及鑒定已在擬南芥[17]、煙草[18]、水稻[19]等多種植物中開展，但在大豆（Glycine max L.）中缺少相關(guān)報(bào)道。本文通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在大豆品種東農(nóng)L-10中鑒定出14個(gè)與大豆胞囊線蟲病3號(hào)生理小種抗性相關(guān)的AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子，并分析其相關(guān)生物信息學(xué)。

目前轉(zhuǎn)錄因子研究?jī)A向于亞族及亞類分析。AP2亞家族具有調(diào)控花、胚珠和種子發(fā)育的功能，在擬南芥花分生組織建立和花同源性基因表達(dá)調(diào)控中，AP2結(jié)構(gòu)發(fā)揮核心作用[20]。ERF和DREB兩類亞家族可調(diào)節(jié)乙烯、ABA等植物激素，干旱、高鹽、低溫等非生物逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)[21]。位于同一亞族基因可能具有相同或相似功能，小麥bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族AtbZIP44基因受低溫誘導(dǎo)表達(dá)，與其所屬S家族功能一致[22]。構(gòu)建系譜進(jìn)化樹結(jié)果表明，AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族聚集在AP2、ERF和DREB亞族附近，ERF和DREB亞族轉(zhuǎn)錄因子又分布在B3、B5、A2和A5亞類分支上，位于同一分支上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)及功能雖有差異但存在高度保守性，可推測(cè)上述轉(zhuǎn)錄因子不僅參與花形態(tài)構(gòu)建，且與植物非生物逆境脅迫密切相關(guān)。其中AP2-3處于擬南芥AP2亞族一個(gè)分支，但未與任何轉(zhuǎn)錄因子聚于一簇，Giri等發(fā)現(xiàn)擬南芥AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子家族At4g13040基因與其他成員親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但可增強(qiáng)對(duì)病原菌抗性，所以AP2-3可能是AP2亞族特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，且可提高SCN抗性[23]。

多序列比對(duì)結(jié)果表明，大豆胞囊線蟲病3號(hào)生理小種AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域與擬南芥高度保守，均含有YRG元件、RAYD元件和WLG基序，相較于擬南芥，個(gè)別SCN轉(zhuǎn)錄因子堿基發(fā)生變化，Zhang等在紅豆杉AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn)同樣高度保守的元件[24]。DREB-1序列第14位為纈氨酸，第19位為天冬氨酸，與擬南芥不同，Qin等發(fā)現(xiàn)玉米maDREB1蛋白第19位谷氨酸突變?yōu)樘於彼岷筠D(zhuǎn)錄功能受到影響[25]，由此推測(cè)DREB-1可能參與DNA合成，且轉(zhuǎn)錄激活能力發(fā)生改變。

AP2/EREBP亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，11個(gè)AP2/EREBP蛋白定位于細(xì)胞核中，表明AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控大豆胞囊線蟲3號(hào)生理小種抗性的主要位置是細(xì)胞核；理化性質(zhì)分析表明該家族蛋白質(zhì)均為親水性蛋白，且多數(shù)為酸性蛋白。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，氨基酸序列以無規(guī)則卷曲為主要組成成分，α-螺旋次之，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角則散布于蛋白序列中。選取代表性AP2/EREBP 3個(gè)亞族序列構(gòu)建三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型，且與擬南芥蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不同亞族之間蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)具有較大差異，而同一亞族之間無差異或者差異可忽略，與查英等對(duì)艾納香AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致[26]，蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)越接近，其生理功能越相似。

綜上所述，親緣關(guān)系相近蛋白質(zhì)，其轉(zhuǎn)錄因子可能具有相同或相似結(jié)構(gòu)域，發(fā)揮相同或相似生物學(xué)功能。因此本研究參考擬南芥AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族，對(duì)大豆胞囊線蟲3號(hào)生理小種AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子作結(jié)構(gòu)分析及功能預(yù)測(cè)，為AP2/EREBP基因家族挖掘和功能研究及培育大豆胞囊線蟲抗性品種提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

利用抗線品種東農(nóng)L-10在大豆胞囊線蟲病3號(hào)生理小種脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出14個(gè)與大豆胞囊線蟲病3號(hào)生理小種相關(guān)AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子，14個(gè)轉(zhuǎn)錄因子之間理化性質(zhì)存在差異，但均為親水性蛋白；14個(gè)轉(zhuǎn)錄因子聚集在AP2、ERF和DREB亞族附近，且屬于B3、B5、A2、A5亞類，其中AP2-3是AP2亞族特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，功能有待驗(yàn)證；14個(gè)轉(zhuǎn)錄蛋白均具有高度保守YRG元件、RAYD元件和WLG基序，DREB-1氨基酸序列第14位和第19位分別為纈氨酸和天冬氨酸，與擬南芥不同；11個(gè)AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核，2個(gè)定位于線粒體，1個(gè)定位于葉綠體；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含有無規(guī)則卷曲，α-螺旋，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角等4種成分，但以無規(guī)則卷曲為主；同一亞族AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與擬南芥相似，預(yù)示其功能相似性。