楊詩(shī)雯,李 軍,洪開文,王 歡,張勇民,董登祥*

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.安順職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用醫(yī)藥系，貴州 安順 561000；3.貴州威門藥業(yè)股份有限公司 研發(fā)部，貴州 貴陽(yáng) 550018；4.巴黎第六大學(xué) 法國(guó)國(guó)家科研中心，法國(guó) 巴黎 75005)

常春藤皂苷元(He)，化學(xué)名為(3β,4α)-3,23-二羥基-12-烯-28-酸(Chart 1)，是一種五環(huán)三萜類化合物，通?？蓮耐`仙、金銀花、中華常春藤等植物中提取。本研究所用He分離提取于貴州道地藥材山銀花(LoniceraeFlos)黃褐毛忍冬(Lonicerafulv)[1]。

Chart 1

常春藤皂苷元擁有著較佳的生物學(xué)活性，具有抗炎、保護(hù)肝臟、抗凝血、抗抑郁、抗腫瘤、抗菌、抗AS等藥理作用，具有優(yōu)越的未來(lái)開發(fā)應(yīng)用價(jià)值[2]。近年來(lái)值得注意的是體外藥理研究中常春藤皂苷元對(duì)于多種惡性腫瘤細(xì)胞株有著較好的抑制活性，如前列腺癌細(xì)胞DU145[3]、胃癌細(xì)胞MGC-8[4]、肝癌細(xì)胞HepG2[5]和腸癌細(xì)胞LoVo、SW480[6-7]等。常春藤皂苷元可以抑制癌細(xì)胞的增殖、黏附、遷移能力，通過(guò)線粒體途徑促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡自噬，并阻礙癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，以此實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤活性[4]。因此在惡性腫瘤治療領(lǐng)域，He具有潛在應(yīng)用價(jià)值。但在常見藥用溶劑中溶解度較差的性質(zhì)，決定了其生物利用度不高的重大缺陷，局限了其在進(jìn)行基礎(chǔ)藥理研究，限制了其未來(lái)臨床研究中的實(shí)際運(yùn)用。

本文擬對(duì)He進(jìn)行結(jié)構(gòu)改進(jìn)修飾，以增加糖片段的方式，改善其溶解度、生物利用度差的特性。作為構(gòu)成生命的基本物質(zhì)之一，多羥基的特性決定了糖具有良好的水溶性，同時(shí)糖類本身也具有抑制腫瘤表達(dá)的生物功能[8]。

常春藤皂苷元可通過(guò)常春藤皂苷水解后得到，對(duì)其的結(jié)構(gòu)修飾通常發(fā)生在C-23、C-28和C-3位置。在C-28位上有雜環(huán)酯的常春藤皂苷元衍生物表現(xiàn)出明顯優(yōu)于He的抗腫瘤活性[9]。使用1,3-偶極環(huán)加成在He的C-28位引入芳基-1H-1,2,3-三唑-4-甲酯，也可以表現(xiàn)出更高水平的抗腫瘤活性[10]。此外，在He的C-23位引入2,6-二甲基吡嗪結(jié)構(gòu)，也能提高該化合物的體外抗腫瘤效果[11]。而在He的C-3位衍生化方面，多種3,4,5-甲氧基苯甲?；４禾僭碥赵苌锉憩F(xiàn)出良好的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果[12]。

與苷元構(gòu)成的糖苷中的糖，一般采用的包括有葡萄糖、氨基葡萄糖、巖藻糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖等，與常春藤皂苷元的C3位的羥基連接成糖苷[5]。本文采用糖化學(xué)改性方法，以He為起始原料，酯化羧基進(jìn)行保護(hù)，得到化合物2；乙酰化保護(hù)C23位羥基得到化合物3；乙?；⒈郊柞；⒓谆确椒ūＷo(hù)糖片段的羥基部位，以及通過(guò)糖片段5-C上羥基的芐基化保護(hù)，將單糖連接合成二糖、四糖，得到化合物W、X、Y、Z；然后在He的C-3位的羥基位置連接糖片段，得到一系列常春藤皂苷元糖基化衍生物a～d，最后用對(duì)酸穩(wěn)定的NaOMe脫去保護(hù)基團(tuán)，得到終產(chǎn)物常春藤皂苷元衍生物(4～7，Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR 和13C NMR表征。采用MTT法檢測(cè)了化合物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞COLO205的抑制活性。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Heidolph-4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；INOVA-400/500 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；FINNIGANLACQ-DECA型質(zhì)譜儀。

He，貴州中醫(yī)藥大學(xué)賈憲生課題組提供；1-甲氧基-(2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-6-O-芐基-2-去氧-2-鄰苯二甲酰亞胺基-β-D-吡喃葡萄糖苷即化合物(X),甲基-苯基-S-(3,4,6-三-O-乙?；?2-去氧-2-鄰苯二甲酰亞胺基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-6-O-芐基-3-O-乙?；?2-去氧-2-鄰苯二甲酰亞胺基-β-D-吡喃葡萄糖苷(Y),對(duì)甲基-苯基-S-(2,6-二-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-D-吡喃葡萄糖苷(W)，實(shí)驗(yàn)室自制；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 常春藤皂苷-28-羧甲酯(2)的合成

稱取化合物1100 mg(0.21mmol)置于100 mL圓底燒瓶中，于瓶中加入四丁基氟化銨(TBAF)33.4 mg(0.128 mmol)，CH3I 0.8 mL(1.28 mmol)，5%NaHCO38 mL和DCM 4 mL，氮?dú)獗Ｗo(hù)，攪拌下反應(yīng)24 h[TLC檢測(cè),展開劑：V(環(huán)己烷)/V(乙酸乙酯)=1/1，Rf=0.52]。 DCM萃取，有機(jī)相真空干燥，過(guò)濾，濾液濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：A=V(環(huán)己烷)/V(乙酸乙酯)=2/1]純化得白色固體粉末297 mg，收率94.8%，m.p.144～145 ℃;1H NMRδ:5.28(m,1H,12-H),3.73(d,J=10.4 Hz,2H,23-H),3.64(m,1H,3-H),3.62(s,3H,OCH3),3.42(dd,J=13.2 Hz,3.6 Hz,1H,18-H),1.97(brs,1H,OH),1.96(brs,1H,OH),1.90(m,2H,11-H),1.87(m,2H,2-H),1,68(m,2H,11-H),1.53(m,2H,16-H),1.42(m,2H,5,9-H),1.39(m,6H,1,6,7-H),1.34(m,4H,19-H,21-H),1.25(m,2H,15-H),1.12(s,3H,27-H),0.97(s,3H,26-H),0.95(s,3H,30-H),0.89(s,3H,24-H),0.85(s,3H,29-H),0.72(s,3H,25-H);MS(ESI)m/z:509.2{[M+Na]+}。

(2)常春藤皂苷元-3-O-乙酰基-28-羧甲酯(3)的合成

在反應(yīng)瓶中加入化合物2200 mg(0.42 mmol)，Py 4 mL(0.04 mol)和Ac2O 2 mL(21.02 mmol)，攪拌下反應(yīng)2 h(TLC檢測(cè))。用稀鹽酸調(diào)至pH中性，DCM萃取，有機(jī)相真空干燥，濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=5/1)純化得白色粉末369.7 mg，收率32.1%，m.p.153～155 ℃;1H NMRδ:5.28(m,1H,12-H),4.13(d,J=11.2 Hz,2H,23-H),3.62(s,3H,OCH3),3.10(m,1H,3-H),2.88(dd,J=14.0 Hz,4.4 Hz,1H,18-H),2.10(s,3H,COCH3),2.08(m,2H,11-H),1.89(m,2H,2-H),1.65(m,2H,22-H),1.61(m,2H,16-H),1.43(m,2H,5-H,9-H),1.36(m,6H,1-H,6-H,7-H),1.33(m,4H,19-H,21-H),1.24(m,2H,15-H),1.16(s,3H,27-H),0.97(s,3H,26-H),0.94(s,3H,30-H),0.88(s,3H,24-H),0.78(s,3H,29-H),0.72(s,3H,25-H);MS(ESI)m/z:552.3{[M+Na]+}

(3) 常春藤皂苷元-3-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷酯(4)的合成

稱取D-乳糖5 g(14.6 mmol)加入250 mL反應(yīng)瓶中，加入攪拌子，真空除水0.5 h。加入Py 50 mL(0.62 mol)和Ac2O 25 mL(0.27 mol)，攪拌下反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC監(jiān)測(cè),展開劑:環(huán)己烷/乙酸乙酯=1/1)。旋蒸除去Py，加入飽和NaHCO3溶液，分液，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鎂除水，濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:A=2/1)純化，真空干燥得化合物9.19 g。

取所得產(chǎn)物5 g(7.37 mol)置于150 mL圓底燒瓶，加入DCM 50 mL溶解化合物，在0 ℃下加入芐胺 2.4 mL(33.68 mmol)，反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測(cè)，展開劑：環(huán)己烷/乙酸乙酯=2/1,V/V)。加酸中和反應(yīng)，分液，有機(jī)相濃縮后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:A=3/1)純化得淡黃色固體4.15 g。

將所得產(chǎn)物淡黃固體5 g(7.86 mmol)、無(wú)水K2CO31.95 g(19mmol)和分子篩200 mg加入250 mL圓底燒瓶，抽真空，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入DCM溶解50 mL，0 ℃平衡10 min，加三氯乙腈3.25 mL，反應(yīng)至終點(diǎn)[TLC檢測(cè)，展開劑：V(環(huán)己烷)/V(乙酸乙酯)=1/1]。分液，有機(jī)相濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=3/1)純化，真空干燥得黃色油狀液體W4.65 g，收率76%。

在50 mL圓底燒瓶加入化合物W200 mg(0.26 mmol)、化合物3180 mg(0.36 mmol)和分子篩150 mg，抽真空20 min，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加DCM溶解20 mL，于0 ℃平衡10 min，加入BF3·Et2O 15 μL(0.12 mmol)，反應(yīng)至終點(diǎn)[TLC檢測(cè)，展開劑V(環(huán)己烷)/V(乙酸乙酯)=1/1]，加入適量DCM，分液，有機(jī)相濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=2/1)純化得白色粉末a196 mg，收率40%。

在50 mL圓底燒瓶中加入a50 mg(0.05 mmol)，甲醇溶解5 mL，用新制NaOMe調(diào)至pH 11～13，反應(yīng)30 min(TLC檢測(cè))。用陽(yáng)離子交換樹脂調(diào)至pH中性。過(guò)濾，濾液濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑:V(甲醇)/V(二氯甲烷)=1/8]純化得白色粉末435mg，收率94.1%，m.p.243～247 ℃;1H NMRδ:5.23(brt,J=3.4 Hz,1H,12-H),5.25(d,J=7.6 Hz,1H,1″-H Lac),5.23(d,J=7.9 Hz,1H,1′-H Lac),3.81(s,1H,2′-H),3.76(s,1H,2″-H),3.70(s,3H,3′-H,5′-H,5″-H),3.69(s,1H,28-H),3.61(d,4H,6′-H,6″-H),3.53(s,1H,3″-H),3.48(s,2H,23-H),3.40(s,1H,4″-H),3.30(s,1H,4′-H),3.00(s,1H,3-H),2.90(dd,J=13.7 Hz,4.3 Hz,1H,18-H),2.10(s,2H,11-H),1.96(s,2H,22-H),1.61(s,2H,16-H),1.60(s,2H,2-H),1.58(s,2H,9-H),1.46(s,2H,6-H),1.28(s,2H,5-H),1.14(s,8H,21-H,19-H,1-H,7-H),0.95(s,3H,27-H),0.93(s,2H,15-H),0.72(s,9H,26-H,25-H,24-H),0.69(s,6H,29-H,30-H);13C NMRδ:180.00(C28),145.06(C13),123.79(C12),105.13(C1′Lac),104.55(C1″Lac),80.99(C3),76.66(C6″Lac),76.43(C6′Lac),74.80(C4″Lac),74.02(C2″Lac),72.74(C3″Lac),72.54(C2′Lac),70.29(C23),62.91(C5′Lac),62.50(C5″Lac),62.43(C3′Lac),62.18(C4′Lac),52.20(OMe),49.51(C9),48.49(C5),48.07(C17),47.07(C19),43.40(C4),42.81(C14),42.71(C18),40.48(C8),39.44(C1),37.94(C10),34.75(C21),33.60(C29),33.52(C22),33.44(C7),31.57(C20),28.78(C15),27.17(C27),26.58(C2),24.49(C11),24.05(C30),23.96(C16),18.93(C6),17.57(C26),16.38(C25),12.92(C24);MS(ESI)m/z:833.3{[M+Na]+}。

(4)常春藤皂苷元-3-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-6-O-芐基-2-去氧-2-N-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖苷酯(5)的合成

取X45 mg(0.09 mmol)，化合物360 mg(0.07 mmol)，N-碘代丁二酰亞胺20 mg(0.16 mmol)，活化分子篩30 mg加入25 mL燒瓶中，DCM為溶劑，于0 ℃平衡10 min，加入TfOH 5 μL，反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測(cè))。經(jīng)硅膠柱層析純化得化合物b，用NaOMe去保護(hù)基團(tuán)后得白色粉末524.0 mg，收率36.9%，m.p.271～274 ℃;1H NMRδ:7.24～7.35(m,5H,Ar-H),5.44(d,J=8.0 Hz,1H,1′-H Glu-N),5.23(brt,J=2.8 Hz,1H,12-H),4.67(m,2H,Bn-CH2),4.59(s,1H,1″-H),4.29(s,1H,2′-H),4.28(s,1H,3′-H),3.87(s,1H,2″-H),3.85(s,1H,5″-H),3.78(s,3H,28-H),3.62(s,2H,6″-H),3.48～3.57(m,6H,3″-H,23-H,4″-H,4′-H,5′-H),2.83(d,J=14 Hz,4.8 Hz,1H,18-H),2.81(s,1H,3-H),2.01(s,3H,NHCOCH3),1.97(s,7H,OH),1.90(s,2H,11-H),1.85(s,2H,22-H),1.71(s,2H,16-H),1.67(s,2H,2-H),1.64(s,1H,9-H),1.59(s,2H,6-H),1.57(s,1H,5-H),1.52(s,8H,1-H,7-H,19-H,21-H),1.33(s,3H,27-H),0.86～0.95(s,9H,24-H,25-H,26-H),0.71～0.73(s,6H,29-H,30-H);13C NMRδ:180.19(C28),173.65(NHCOCH3),145.23(C13),128.75～129.57(5C,Ar),123.95(C12),105.62(C1′Glu-N),104.62(C1″Gal),83.00(C3),77.25(C2″),75.67(C3″),74.43(C2′),72.72(Bn-CH2),70.45(C3′),62.05～62.71(5C,C4′,C5′,C6″,C5″,C4″)52.43(C23),49.63(OMe),49.10(C9),48.78(C5),48.26(C17),47.67(C19),44.00(C4),43.86(C14),43.04(C18),42.92(C8),40.68(C1),39.57(C10),37.74(C21),34.96(C29),33.4(C22),31.9(C7),31.78(C20),30.97(C15),28.95(C27),26.75(C2),24.74(C11),24.23(NHCOCH3),24.18(C30),23.82(C16),20.62(C6),17.84(C26),16.65(C25),13.80(C24);MS(ESI)m/z:964.5{[M+Na]+}。

(5)6和7的合成(以6為例)

取化合物Y136 mg(0.14 mmol)、化合物386 mg(0.18 mmol)、N-碘代丁二酰亞胺30 mg(0.12mmol)以及活化分子篩30 mg于50 mL燒瓶中，DCM溶解，冰水浴平衡20 min，加入TfOH 5 μL，反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測(cè))。用飽和硫代硫酸鈉調(diào)至pH中性，分液，有機(jī)相濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化得化合物c28 mg，收率32%。

稱取化合物c104 mg(0.08 mmol)加入25 mL燒瓶中，加入85% NH2-NH2溶液4 mL和無(wú)水乙醇5 mL，于80 ℃反應(yīng)6 h(TLC檢測(cè))。分液，有機(jī)相濃縮，殘余物用HL-20純化得產(chǎn)物31 mg；取80 mg該產(chǎn)物再與4 mL甲醇、4 mL乙酸酐反應(yīng)24 h得白色固體常春藤皂苷元-3-O-(2-去氧-2-N-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-6-O-芐基-2-去氧-2-N-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷酯636 mg，收率85%,m.p.290～293 ℃;1H NMRδ:7.22-7.29(m,5H,Ar-H),7.21(s,2H,NH′ Glu-N,NH″ Glu-N′),5.12(brt,J=2.8 Hz,1H,12-H),5.10(d,J=8.0 Hz,2H,1′-H,1″-H),4.68(s,2H,Bn-CH2),4.62～4.66(s,3H,2′-H,2″-H,3′-H),4.59(s,1H,5″-H),4.57(s,1H,5′-H),4.51(s,1H,3″-H),4.47(s,1H,28-H),4.44(s,1H,4″-H),4.41(s,2H,6′-H),3.83(s,2H,6″-H),3.75(d,J=9.5 Hz,2H,23-H),3.60(s,1H,4′-H),3.51(s,1H,3-H),3.36(s,1H,18-H),3.22(s,3H,OCH3″),3.19(s,3H,OCH3′),1.91～2.07(s,5H,OH),1.88(s,2H,11-H),1.78(s,2H,22-H),1.62(s,2H,2-H),1.56(s,2H,16-H),1.54(s,2H,6-H),1.42～1.51(s,9H,7-H,5-H,19-H,21-H,1-H),1.39(s,3H,27-H),1.32(s,2H,15-H),1.24～1.28(s,6H,24-H,25-H),0.93(s,3H,30-H),0.70(s,3H,29-H);13C-NMRδ:180.66(C28),172.74(2C,NHCOCH3),145.74(C13),140.26(C1Ar),129.4～130.18(5C,C2-6Ar),124.26(C12),103.77(C1′Glu-N),100.76(C1″Glu-N′),80.91(Bn-CH2),79.35(C3),78.28(C2″),77.30(C3″),76.52(C2′),75.76(C4′),74.38(C4″),73.73(C3′),73.10(C6′),72.42(C6″),72.13(C23),70.48(2C,C5″,C5′),63.59(C9),62.61(OMe),58.02(C17),52.82(C14),50.1(C5),48.72(C19),48.66(C4),48.54(C21),43.31(C18),41.10(C8),34.19(C10),32.52(C22),32.18(C1),31.62(C7),29.04(C15),28.73(C27),27.01(C2),25.1(C11),24.57(C20),23.80(C2),21.27(2C,NHCOCH3),18.19(C22),17.11(C16),17.05(C30),15.21(C6),13.42～13.54(4C,C29,C24,C25,C26);MS(ESI)m/z:1005.5{[M+Na]+}。

用類似的方法合成白色粉末常春藤皂苷元-3-O-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,6-二-O-芐基-β-D-吡喃半乳糖基]-(1→4)-2,3,6-三-O-芐基-β-D-吡喃葡萄糖苷酯(7) 42 mg，收率92%，m.p.310～312 ℃;1H NMRδ:7.20～7.41(m,20H,Ar-H),5.26(brt,J=2.8 Hz,1H,12-H),5.08(d,J=8.0 Hz,2H,1′-H,1″-H),5.04(d,J=7.8 Hz,2H,1″″-H,1″′-H),4.85(s,8H,Bn-CH2),4.73(s,1H,2″-H),4.71(s,1H,2′-H),4.66(s,1H,2″′-H),4.65(s,1H,3″-H),4.64(s,1H,3′-H),4.53(s,1H,2″″-H),4.50(s,1H,5″′-H),4.48(s,1H,5″″-H),4.45(s,3H,OCH3),4.39(s,1H,3″′-H),4.32(s,2H,6″′-H),4.31(s,2H,6″″-H),4.29(s,2H,6″-H,6′-H),4.04(s,1H,23-H),3.89(s,1H,3″″-H),3.85(s,1H,4″″-H),3.79(s,1H,5′-H),3.73(s,1H,5″-H),3.61(s,1H,4″′-H),3.60(s,1H,4″-H),3.58(s,1H,4′-H),3.49(s,1H,3-H),3.31(d,J=14Hz,4.8 Hz,1H,18-H),1.89～1.94(s,9H,OH),1.70(s,2H,11-H),1.64(s,2H,22-H),1.62(s,2H,16-H),1.52(s,2H,2-H),1.49(s,2H,6-H),1.45(s,1H,9-H),1.32(s,1H,5-H),1.29(s,2H,19-H),1.27(s,2H,21-H),1.25(s,2H,1-H),1.24(s,2H,7-H),1.18(s,3H,27-H),1.17(s,2H,15-H),0.98(s,3H,26-H),0.97((s,3H,25-H),0.96(s,3H,24-H),0.73(s,3H,30-H),0.70(s,3H,29-H);13C NMRδ:179.85(C28),144.97(C13),128.65～129.65(24C,Ar),105.78(C12),105.10(C1′),104.95(C1″),104.14(C1″′),95.60(C1″″),80.12(C3),77.00(C5′),76.30(C5″),76.16(C5″′),74.68(C5″″),74.40～74.50(4C,C2″″,C2″′,C2″,C2′),74.00～74.10(4C,Bn-CH2),72.10～72.45(4C,C3″″,C3″′,C3″,C3′),70.20～70.59(4C,C4″″,C4″′,C4″,C4′),62.40 ～62.45(2C,C6″′,C6″″),61.53(C23),52.20(OMe),49.58(C9),49.16(C5),48.95(C17),48.31(C19),47.98(C4),47.75(C14),43.81(C18),43.70(C8),42.80(C1),42.65(C10),40.44(C21),40.41(C29),37.71(C22),37.47(C7),34.70(C20),33.54(C15),31.52(C27),26.57(C2),23.97(C11),23.40(C30),17.63(C16),17.59(C6),16.36(C26),13.92(C25),13.87(C24);MS(ESI)m/z:1607.7{[M+Na]+}。

1.3 抗腫瘤活性測(cè)試

以人結(jié)腸癌細(xì)胞COLO205為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，He為陽(yáng)性對(duì)照,用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽比色法評(píng)價(jià)化合物的腫瘤細(xì)胞抑制率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)腸癌細(xì)胞COLO205，以細(xì)胞濃度3000個(gè)/孔接種于96孔板中，設(shè)定陽(yáng)性藥組(He)、空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。24 h后分別更換為含藥培養(yǎng)基(濃度為1.00×10-4、1.00×10-5、1.00×10-6mmol·L-1)。給藥后24 h，在各孔中加入MTT 溶液(5 mg·mL-1)20 μL，置于37 ℃，5% CO2環(huán)境中培育4 h。孵育完畢的96孔板放入酶標(biāo)儀中，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定各孔OD值。腫瘤活性實(shí)驗(yàn)委托貴州省中國(guó)科學(xué)院天然藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藥理與活性篩選中心完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 He衍生物合成

共合成4個(gè)常春藤皂苷元衍生物(4～7)，其中6和7為新化合物。在兩個(gè)二糖片段連接形成四糖的β-1,4位連接中，因?yàn)槭荏w分子帶有空間位阻大的芐基，糖化反應(yīng)因而發(fā)生在位阻較小的4-位。當(dāng)受體分子一號(hào)位連接有對(duì)甲基苯硫酚的大基團(tuán)時(shí)，對(duì)4-位的區(qū)域選擇性會(huì)更好。而供體分子異頭碳中離去基團(tuán)選擇三氯乙酰亞胺酯，能夠提高兩片段成功連接的收率。供體采用三氯乙酰亞胺酯作離去基團(tuán)，收率提高約15%[13]。

合成He與糖片段時(shí)，在25 ℃、30 ℃、0 ℃、-40 ℃條件下進(jìn)行反應(yīng)。25 ℃和30 ℃時(shí)反應(yīng)失敗，無(wú)法獲得產(chǎn)物。而在-40 ℃中反應(yīng)進(jìn)行過(guò)慢，乙酰亞胺酯基團(tuán)的活性碳正離子的易于變性破壞。同時(shí)低溫時(shí)乙酰亞胺酯形成碳正離子速度減慢，與He的羥基結(jié)合機(jī)會(huì)會(huì)明顯增加。因此選擇在冰水浴條件下進(jìn)行反應(yīng)，只需0.5～1 h就可得到所需產(chǎn)物[14-15]。

2.2 抗腫瘤活性

表1為不同濃度化合物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞COLO205的抑制活性。由表1可知，4和5濃度為1.00×10-4mmol·L-1、1.00×10-5mmol·L-1和1.00×10-6mmol·L-1時(shí)，對(duì)COLO205細(xì)胞均存在抑制作用，與濃度呈正相關(guān)；6在高濃度(1.00×10-4mmol·L-1)對(duì)COLO205有較好的抑制活性；7只在中等濃度(1.00×10-5mmol·L-1)對(duì)COLO205有微弱抑制作用。

表1 目標(biāo)化合物對(duì)COLO205細(xì)胞的抑制活性Table 1 Inhibitory activities of the target compounds against COLO205

皂苷類化合物的苷元相同,但糖片段的不同就能造成其生物活性的巨大差異[16]。本課題組前期工作將He與單糖片段合成的衍生物進(jìn)行抗腫瘤活性試驗(yàn)，證明常春藤皂苷元糖苷化衍生物的確具有一定腫瘤抑制活性，如王歡[17]合成的常春藤皂苷元-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷酯對(duì)人膀胱癌細(xì)胞T-24在1.00×10-4mmol·L-1濃度時(shí)抑制率可達(dá)到92.36±10.65%，顯示出優(yōu)于He的抑制作用；以及常春藤皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷酯對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823在高濃度1.00×10-4mmol·L-1時(shí)抑制率可達(dá)98.03±2.16%[18]。除抗癌作用以外，常春藤皂苷元糖苷化衍生物還表現(xiàn)出抑制小鼠TG升高的作用[19]。糖苷化可以提高水溶性，有研究表明在He的C-28位的-COOH進(jìn)行?；?、甲基化等修飾后，可以提高He脂溶性[20]，這也對(duì)提高He的生物利用度提供了另一條思路，有待進(jìn)一步進(jìn)行研究。

合成了4個(gè)常春藤皂苷元衍生物(4～7,其中6和7為新化合物)，并用MTT法檢測(cè)了化合物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞COLO205的抑制活性。結(jié)果表明：4和5對(duì)COLO205細(xì)胞有部分抑制作用，與濃度正相關(guān)；6對(duì)COLO205只在高濃度(1.00×10-4mmol/L)有較好抑制作用(98.36±0.43%)；7只在中等濃度(1.00×10-5mmol/L)對(duì)COLO205有微弱抑制作用(2.75±1.22%)。本研究針對(duì)水溶性結(jié)構(gòu)的修飾，對(duì)未來(lái)抗腫瘤藥物的開發(fā)有一定借鑒作用。