鄒佳成,諸葛祥雪,習(xí) 鶴,李業(yè)新,袁春雪*

(1.同濟(jì)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201804；2.西安電子科技大學(xué) 先進(jìn)材料與納米科技學(xué)院，陜西 西安 710071；3.濟(jì)南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東 濟(jì)南 250022)

pH檢測(cè)在化學(xué)反應(yīng)過程控制、環(huán)境分析、食品批量生產(chǎn)、醫(yī)學(xué)診斷和生命科學(xué)分析中起著重要作用[1-5]。在眾多pH檢測(cè)方式中，pH熒光探針由于具有高靈敏度(亞分子水平)、亞納米空間分辨率、高抗干擾能力、操作方便和實(shí)時(shí)檢測(cè)的特性吸引了越來越多的關(guān)注[6]。近年來已經(jīng)報(bào)道了眾多pH熒光探針，例如熒光素、香豆素、羅丹明[7-9]和眾多含氮雜環(huán)衍生物[10-11]，然而它們大多具有一定的局限，例如一些探針僅適用于接近中性的pH范圍或因較短的斯托克斯位移而受到嚴(yán)重的激發(fā)干擾。因此，設(shè)計(jì)一種用于檢測(cè)酸性pH變化，并具有優(yōu)良性能的pH熒光探針具有較好的實(shí)際意義。

朝格爾堿(Tr?ger’s base,TB)由于其具有C2對(duì)稱性、手性和剛性凸形的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，已被應(yīng)用于諸如分子開關(guān)或液晶摻雜劑等廣泛的領(lǐng)域[12-15]。此外，吡啶基團(tuán)具有高靈敏度和高酸堿質(zhì)子交換速率[16]，這兩者的獨(dú)特性質(zhì)引發(fā)了我們強(qiáng)烈的興趣。本課題組在前期工作中報(bào)道了多種基于TB骨架的熒光探針，它們都展現(xiàn)了出色的pH檢測(cè)特性[17-21]。通常，熒光探針的光物理性質(zhì)可以通過設(shè)計(jì)不同的末端基團(tuán)有效地調(diào)控；不僅如此，改變?nèi)〈稽c(diǎn)也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于熒光探針光物理特性的調(diào)控，因此進(jìn)一步探索取代位置效應(yīng)對(duì)熒光探針光物理性質(zhì)的影響具有重要的意義。對(duì)于使用間位取代吡啶端基的熒光探針研究較少，并且氮原子在吡啶上的取代位置對(duì)于基于TB的熒光探針光物理性質(zhì)的影響尚未見報(bào)道。

本文設(shè)計(jì)并合成了含間位取代吡啶端基的熒光探針2,8-雙((E)-2-(吡啶-3-基)乙烯基)-6H,12H-5,11-甲二苯并[b,f] [1,5]重氮(TBMP,Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR、13C NMR、HR-MS(ESI)表征。并通過pH滴定實(shí)驗(yàn)和DFT理論計(jì)算驗(yàn)證了其對(duì)pH值變化的檢測(cè)機(jī)理[17-18]。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker AVANCE 400 MHz型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo))；Agilent 6210 ESI/TOF型高分辨質(zhì)譜儀；DU-730型紫外-可見光分光光度計(jì)；Agilent Cary Eclipse型熒光分光光度計(jì)；INESA PHS-2S型臺(tái)式pH計(jì)。

1,2按文獻(xiàn)[22-23]方法合成；其余所用試劑均為化學(xué)純或分析純。

1.2 TBMP的合成

在100 mL三口瓶中加入11.9 g(5.0 mmol)，22.2 mL(20.0 mmol)、碳酸鉀2.8 g(20.0 mmol)、三(2-甲基苯基)磷0.076 g(0.25 mmol)和醋酸鈀0.056 g(0.25 mmol)，通入氮?dú)?，滴加N-甲基吡咯烷酮(NMP)10 mL，于130 ℃反應(yīng)24 h(TLC檢測(cè))。冷卻至室溫，用二氯甲烷(3×50 mL)萃取，合并有機(jī)相，依次用水洗滌，無水硫酸鎂干燥，經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：二氯甲烷/乙醇=50/1,V/V)純化得淡黃色粉末TBMP0.84 g,收率39.4%;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:4.18(d,J=16.7 Hz,2H),4.26(s,2H),4.67(d,J=16.7 Hz,2H),7.10(d,J=16.5 Hz,2H),7.15(d,J=8.4 Hz,2H),7.21(s,2H),7.25(d,J=16.5 Hz,2H),7.36(d,J=8.0 Hz,2H),7.41(d,J=9.6 Hz,2H),7.97(d,J=8.0 Hz,2H),8.41(d,J=4.0 Hz,2H),8.69(s,2H);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)δ:58.21,66.26,123.57,123.81,125.07,125.19,125.54,128.38,130.07,132.02,132.51,132.95,148.07,148.14,148.24;HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C29H24N4{[M+H]+}429.2074,found 429.2078。

1.2 性能測(cè)試

將TBMP溶解于DMSO中，配制為10.0 μM儲(chǔ)備液，在測(cè)試前稀釋儲(chǔ)備溶液至1.0 mM。實(shí)驗(yàn)中探針TBMP濃度始終為1.0 mM。金屬離子分別由KCl,NaCl,CaCl2,MgCl2,FeCl3,ZnCl2,CuCl2·6H2O,MnCl2,CoCl2·6H2O,Cr(NO3)3·9H2O,Cd(NO3)2·4H2O,Ni(NO3)2·6H2O和AlCl3提供。所有溶液在最終光譜測(cè)量前均充分搖勻并靜置30 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針TBMP在不同極性溶劑中的光譜學(xué)性質(zhì)

TBMP在溶液中和固態(tài)下均呈現(xiàn)出強(qiáng)藍(lán)色熒光發(fā)射(圖1插圖)。TBMP在不同溶劑中的紫外吸收光譜圖和熒光發(fā)射光譜圖見圖1a和圖1b。由圖可知，TBMP的紫外吸收峰位于331～340 nm附近，隨著溶劑極性的增加，未觀察到明顯的紫外吸收峰偏移；而在熒光光譜中，隨著溶劑極性的增加，熒光峰的位置從384 nm移動(dòng)至460 nm，顯示出了明顯的紅移，計(jì)算得斯托克斯位移從51 nm增加到127 nm。

λ/nm

λ/nm圖1 TBMP在各溶劑中的紫外吸收光譜(a)和熒光發(fā)射光譜(b)Figure 1 Normalized absorption(a) and fluorescent emission(b) spectra of TBMP in various solvents

TBMP在溶液中和固態(tài)下觀察到的強(qiáng)藍(lán)色熒光可能是由于分子內(nèi)部的D-π-A電荷轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由TB橋上的胺基作為電子受體(D)以及兩翼上的吡啶端基作為電子供體(A)共同構(gòu)成，并通過電子的推拉相互作用實(shí)現(xiàn)有效的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)。另一方面，TBMP在熒光光譜中明顯的紅移現(xiàn)象可能是由于激發(fā)態(tài)的TBMP分子具有比基態(tài)TBMP分子更高的極性，溶質(zhì)與溶劑之間更強(qiáng)的偶極-偶極相互作用會(huì)導(dǎo)致能級(jí)顯著降低，使得TBMP展現(xiàn)出明顯的正溶劑化效應(yīng)以及顯著的紅移[24]。TBMP在不同極性溶劑中的光譜學(xué)性質(zhì)與對(duì)位和鄰位取代的探針TBPP和TBOP相似[17-18]，這表明吡啶中氮原子的取代位置對(duì)它們?cè)诓煌瑯O性溶劑中的光譜性質(zhì)沒有明顯影響。

λ/nm

λ/nm圖2 TBMP pH滴定實(shí)驗(yàn)的紫外光譜(a)和熒光光譜(b)Figure 2 Absorption(a) and fluorescent emission(b) spectra of TBMP in pH titration experiment

2.2 探針TBMP對(duì)pH滴定的紫外和熒光響應(yīng)

圖2a為pH紫外吸收滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由圖可知，隨著質(zhì)子濃度增加(pH 7.09～2.43)，在356 nm處觀察到明顯的消光點(diǎn)，在335 nm的紫外吸收下降并伴隨輕微紅移(335 nm至342 nm)。與TBPP和TBOP(均為50 nm左右)相比[17-18]，TBMP的紅移明顯較小，并且未觀察到新的吸收峰出現(xiàn)，這是由于吡啶上不同取代位置的氮原子與TB骨架之間不同的協(xié)同效應(yīng)所致[25-26]，推測(cè)間位取代的氮原子在質(zhì)子化之后受到ICT效應(yīng)的影響較小，對(duì)LUMO軌道的影響也較小[27]。

在pH熒光滴定實(shí)驗(yàn)中(圖2b)，TBMP在460 nm處具有明顯的熒光發(fā)射峰，據(jù)此可以計(jì)算出TBMP具有較大的斯托克斯位移(127 nm)，而較大的斯托克斯位移有助于減少分子內(nèi)的激發(fā)相互干擾[11,28]。同時(shí)，探針TBMP展現(xiàn)出典型的熒光強(qiáng)度與pH值的關(guān)系[29](圖3)，隨著pH值降低(7.13～3.11)時(shí)，探針TBMP的熒光強(qiáng)度逐漸減弱直到完全猝滅，使得探針TBMP可以用于檢測(cè)的pH范圍在 6.5～3.11，根據(jù)Henderson-Hasselbach方程可以計(jì)算得出TBMP的pKa值為3.89。此外，pH滴定過程中沒有觀察到光譜偏移，表明質(zhì)子化后的結(jié)構(gòu)(TBMP-H+)在溶液中不發(fā)光。圖4展現(xiàn)了TBMP、TBMP-H+的結(jié)構(gòu)與pH響應(yīng)機(jī)理。

pH圖3 TBMP在460 nm處的熒光強(qiáng)度與pH值的關(guān)系;激發(fā)波長(zhǎng)335 nmFigure 3 Fluorescence intensities plot of TBMP vs.pH value at 460 nm;λex=335 nm

2.3 pH檢測(cè)過程機(jī)理探究

為了進(jìn)一步探索TBMP的檢測(cè)機(jī)理，在TBMP的DMSO-d6溶液中加入不同濃度的稀鹽酸，并對(duì)樣品進(jìn)行1H NMR檢測(cè)，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著質(zhì)子濃度增加，TB骨架的質(zhì)子特征吸收峰(10-H和11-H)和吡啶端基上質(zhì)子特征吸收峰(1-H和2-H)逐漸向低場(chǎng)移動(dòng)，表明TB骨架上的N和吡啶端基上的N都發(fā)生了質(zhì)子化。TBMP的質(zhì)子化位點(diǎn)與只有吡啶端基發(fā)生質(zhì)子化的TBPP和TBOP有顯著不同[17-18]。

δ圖4 探針TBMP逐滴加入等量稀鹽酸后的1H NMR譜圖Figure 4 1H NMR spectra of probe TBMP in DMSO-d6 by adding equivalent amount of HCl

為了進(jìn)一步理解TBMP的檢測(cè)機(jī)理，使用Gaussian 09程序以及B3LYP / 6-311G(d)函數(shù)對(duì)TBMP的LUMO和HOMO進(jìn)行了密度泛函理論(DFT)計(jì)算，TBMP-H+的LUMO-HOMO能隙(1.31 eV)小于TBMP的能隙(3.82 eV)，這與紫外吸收光譜中觀察到的紅移現(xiàn)象相對(duì)應(yīng)。對(duì)質(zhì)子化發(fā)生在吡啶端基N1上和質(zhì)子化發(fā)生在TB骨架N2的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了計(jì)算，其相對(duì)能量分別為0 eV和3.03 eV，表明TBMP的質(zhì)子化過程傾向于首先發(fā)生在吡啶端基上的N1。推測(cè)從TBMP到TBMP-H+的質(zhì)子化過程有兩個(gè)步驟：首先質(zhì)子化發(fā)生在吡啶端基的N1，然后TB骨架上的N2被質(zhì)子化。相比之下，TBPP和TBOP的質(zhì)子化僅發(fā)生在吡啶端基[17-18]。這是由于TBPP和TBOP的吡啶氮原子的質(zhì)子化通過ICT效應(yīng)降低了TB骨架上N周圍的電子密度，使TB骨架上質(zhì)子化后的結(jié)構(gòu)較不穩(wěn)定，傾向于丟失質(zhì)子。然而，在TBMP的雙質(zhì)子化過程中，由于吡啶上間位取代的N具有不同的電子效應(yīng)和空間位阻效應(yīng)，兩者的協(xié)同使得ICT效應(yīng)不會(huì)通過共軛體系傳導(dǎo)至TB骨架，因此TB骨架上N質(zhì)子化后的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，從而令TBMP展現(xiàn)出獨(dú)特的雙質(zhì)子化過程。

Time/min

Cycies圖5 pH值為6.23和3.94時(shí)，探針TBMP在2 h內(nèi)的熒光強(qiáng)度(460 nm)(a)，反復(fù)調(diào)節(jié)pH值時(shí)探針TBMP熒光強(qiáng)度(460 nm)(b)Figure 5 Plot of fluorescence intensities(460 nm) of TBMP at pH 6.23 and 3.94 in 2 h(a),plot of fluorescence intensities(460 nm) with reverse pH values(b)

2.4 探針TBMP的穩(wěn)定性，可逆性和選擇性

在實(shí)際應(yīng)用中，穩(wěn)定性、可逆性和選擇性是pH熒光探針的關(guān)鍵指標(biāo)。檢測(cè)TBMP溶液在pH值 6.23和3.94條件下2 h內(nèi)的熒光強(qiáng)度(圖5a)，TBMP的熒光強(qiáng)度在整個(gè)測(cè)試過程中幾乎保持同一水平。這些表明TBMP對(duì)于酸性條件的檢測(cè)具有優(yōu)秀的穩(wěn)定性。此外，為了檢驗(yàn)TBMP的可逆性，通過加入微量稀鹽酸和氫氧化鈉將pH值控制在7.00～2.39，反復(fù)調(diào)節(jié)pH值數(shù)次并記錄熒光強(qiáng)度(圖5b)，其熒光強(qiáng)度仍然保持在相同水平，可以用作酸性pH熒光探針。

與此同時(shí)，探究含氮有機(jī)小分子新型pH熒光探針的選擇性對(duì)于其在實(shí)際情況下的應(yīng)用至關(guān)重要，通過測(cè)試TBMP的選擇性可以推測(cè)出其在不同離子環(huán)境下的抗干擾性(圖6)。由圖可知，金屬離子和氨基酸的存在對(duì)熒光強(qiáng)度沒有明顯影響，這表明TBMP在金屬離子和氨基酸出現(xiàn)的情況下對(duì)H+的具有優(yōu)秀的選擇性。探針TBMP的穩(wěn)定性、可逆性和選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與探針TBPP和TBOP相似[17-18]，表明N取代位置效應(yīng)對(duì)探針的穩(wěn)定性、可逆性和選擇性的影響較小。

圖6 在不同金屬離子和氨基酸條件下，探針TBMP在pH 7.00(黑)和pH 3.49(灰)下的熒光強(qiáng)度Figure 6 Fluorescence intensities(460 nm) of TBMP at pH 7.00(black) and 3.49(grey) under the condition with different metal ions and amino acids

設(shè)計(jì)并合成了基于朝格爾堿骨架和間位取代吡啶端基的新型pH熒光探針TBMP。探針TBMP對(duì)于酸性pH變化有明顯的熒光響應(yīng)并具有較大的斯托克斯位移(127 nm)。1H NMR和DFT理論計(jì)算揭示了檢測(cè)機(jī)理，其中吡啶端基和TB骨架中的氮相繼發(fā)生質(zhì)子化引起了其對(duì)pH值變化的光譜學(xué)響應(yīng)。TBMP在pH滴定實(shí)驗(yàn)中顯示出相對(duì)較小的紅移，但它仍具有良好的穩(wěn)定性，靈敏度和選擇性，具有在酸性條件下用作pH熒光探針的潛力。在極性不同的溶液中，TBPP、TBOP和TBMP的光物理性質(zhì)相似；而在滴定實(shí)驗(yàn)中，受到在吡啶端基上間位取代氮的取代位置效應(yīng)的影響，TBMP光譜學(xué)性質(zhì)及其質(zhì)子化過程與另兩種探針有顯著的不同。該研究有助于進(jìn)一步設(shè)計(jì)和理解具有吡啶端基的新型熒光探針。