建立了高效液相色譜法測(cè)定花生芽中6-芐基腺嘌呤含量的方法。6-芐基腺嘌呤的檢測(cè)波長(zhǎng)為267nm;流動(dòng)相為甲醇-20mmol/L乙酸銨溶液(50∶50,v/v);前處理的提取方式為超聲波提取法;高效液相色譜法測(cè)定花生芽中6-芐基腺嘌呤含量的在1-50mg/L范圍線性良好,相關(guān)系數(shù)為0.9998,檢出限為0.1mg/kg,精密度為1.82%,用該方法測(cè)定花生芽中6-芐基腺嘌呤含量的回收率在90%以上。
6-芐基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine)分子式是C12H11N5,分子量為225.25,熔點(diǎn):230℃,形狀為白色晶體,難溶于水,微溶于乙醇等有機(jī)溶劑,易溶于酸和堿且性質(zhì)穩(wěn)定。6-芐基腺嘌呤是一種人工合成的細(xì)胞分裂素,主要用于促進(jìn)細(xì)胞分裂、細(xì)胞增大、種子發(fā)芽和果實(shí)生長(zhǎng)等,我國(guó)曾經(jīng)允許在豆芽生產(chǎn)上的應(yīng)用。6-芐基腺嘌呤作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,其安全性目前沒(méi)有結(jié)論,并且缺乏食品添加劑工藝必要性,目前我國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)GB2760已經(jīng)禁止6-芐基腺嘌呤作為食品用加工助劑生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)和使用。
6-芐基腺嘌呤更多的報(bào)道是關(guān)于在豆芽生產(chǎn)中的應(yīng)用,俗稱的“無(wú)根粉”主要成分就是6-芐基腺嘌呤,對(duì)于花生芽不管是生產(chǎn)方面或者是檢測(cè)方面報(bào)道較少?;ㄉ勘徽J(rèn)為一種食療兼?zhèn)涞氖称罚瑺I(yíng)養(yǎng)豐富,并富含維生素及各種氨基酸和微量元素,花生芽的生產(chǎn)和銷售越來(lái)越普遍,對(duì)花生芽的各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)方法有研究的意義。
6-芐基腺嘌呤的檢測(cè)方法主要是光譜法和色譜法,光譜法靈敏度不夠,基質(zhì)干擾大,色譜法具有準(zhǔn)確、高效、快速的特點(diǎn)。本論文研究高效液相色譜法測(cè)定花生芽中6-芐基腺嘌呤含量的方法,為花生芽中6-芐基腺嘌呤的檢測(cè)提供技術(shù)參數(shù)。
儀器及材料 高效液相色譜儀:LC20AD(日本島津公司);色譜柱:C18柱(250mm×4.6μm,美國(guó)waters公司);電子分析天平(日本島津公司);微波爐(美的公司);離心機(jī)(sigma公司);超純水系統(tǒng)(德國(guó)Millipore公司);刀片式均質(zhì)器(德國(guó)ⅠKA公司);超聲波提取器(上海比朗)。
6-芐基腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于99%(德國(guó)Dr.Erenstorfer公司);甲醇(色譜純,美國(guó)CNW公司);乙酸銨(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。
儀器條件 流動(dòng)相:甲醇:20mmol/L乙酸銨溶液(50∶50,v/v),等度洗脫。流速:1.0mL/min;色譜柱溫度:40℃;檢測(cè)器:二極管陣列檢測(cè)器,波長(zhǎng)267nm;進(jìn)樣量:20μL。
檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 二極管陣列檢測(cè)器能從190nm到900nm的全波段檢測(cè),要檢測(cè)6-芐基腺嘌呤首先要確定其檢測(cè)波長(zhǎng)。配制6-芐基腺嘌呤的標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度為10.0mg/L,上機(jī)測(cè)定,從測(cè)定結(jié)果的光譜色譜三維圖發(fā)現(xiàn)在5.8分鐘有明顯的響應(yīng),提取該時(shí)間點(diǎn)的吸收光譜圖,結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1 6-芐基腺嘌呤的吸收光譜圖
圖1 中發(fā)現(xiàn)在210nm及267nm處均有吸收頂點(diǎn),210nm處受到的干擾較大,因此選擇267nm為6-芐基腺嘌呤的檢測(cè)波長(zhǎng)。
流動(dòng)相的選擇 選擇純甲醇、甲醇-20mmol/L乙酸銨溶液(50∶50,v/v)和甲醇-水(50∶50,v/v)三種不同體系的流動(dòng)相作比較,流速均為為1.0mL/min,進(jìn)樣濃度為1.0mg/L的6-芐基腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液,結(jié)果見(jiàn)圖2。
圖2 不同甲醇比例作為流動(dòng)相的峰面積變化圖
從圖2中,1號(hào)為純甲醇流動(dòng)相的色譜圖,峰形不對(duì)稱,出峰時(shí)間過(guò)早有可能與其他雜質(zhì)重合或者分離不好;3號(hào)為甲醇-水(50∶50,v/v)流動(dòng)相的色譜圖,峰形對(duì)稱但是峰展寬較大;2號(hào)為甲醇-20mmol/L乙酸銨溶液(50∶50,v/v)流動(dòng)相的色譜圖,峰形對(duì)稱并且峰展寬小,乙酸銨在流動(dòng)相中有改善峰形的作用,因此選擇甲醇-20mmol/L乙酸銨溶液(50∶50,v/v)作為測(cè)定6-芐基腺嘌呤的流動(dòng)相。
樣品前處理 用甲醇提取花生芽中的6-芐基腺嘌呤,比較幾種不同的提取方式,花生芽直接稱樣20.0g置于100mL的離心管中,加入50mL甲醇,用刀片式均質(zhì)器均質(zhì)2分鐘。超聲波提?。河贸暡ㄌ崛∑魈崛?0min;浸泡提取:在室溫下放置10小時(shí);微波提取:微波提取2分鐘;各方法提取結(jié)束后冷卻,5000r/min離心10分鐘,取上層溶液過(guò)0.45μm濾膜,上機(jī)測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表1。表中微波提取法雖然用時(shí)少,但是結(jié)果偏低,可能的原因是提取時(shí)間不足或者是6-芐基腺嘌呤分解了,超聲波提取效率高,因此選擇超聲波提取法提取花生芽中的6-芐基腺嘌呤。
表1 花生芽加標(biāo)提取6-芐基腺嘌呤結(jié)果
方法學(xué)驗(yàn)證 線性關(guān)系及檢出限 配制6-芐基腺嘌呤的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,上機(jī)測(cè)定,高效液相色譜法6-芐基腺嘌呤在1-50mg/L的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.9998,以基線噪聲的三倍作為測(cè)定的檢出限,6-芐基腺嘌呤的檢出限為0.1mg/kg。
表2 6-芐基腺嘌呤線性及檢出限
精密度及回收率 進(jìn)樣10.0mg/L的6-芐基腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液,連續(xù)進(jìn)樣11次計(jì)算精密度,結(jié)果見(jiàn)表4,高效液相色譜法測(cè)定6-芐基腺嘌呤的精密度為1.82%,精密度符合測(cè)定的要求。
表3 6-芐基腺嘌呤精密度
取花生芽樣品,稱樣20.0g,添加6-芐基腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液作為回收率的測(cè)試,按照3.3的前處理方法處理花生芽樣品,回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。高效液相色譜法測(cè)定6-芐基腺嘌呤的回收率在90%以上,滿足分析要求。
表4 6-芐基腺嘌呤的回收率
建立了高效液相色譜法測(cè)定花生芽中6-芐基腺嘌呤含量的方法。通過(guò)提純光譜,確定選擇267nm為6-芐基腺嘌呤的檢測(cè)波長(zhǎng);通過(guò)比較,選擇甲醇-20mmol/L乙酸銨溶液(50∶50,v/v)作為檢測(cè)6-芐基腺嘌呤的流動(dòng)相,流動(dòng)加入乙酸銨能夠很好地改善峰形;研究了前處理的提取方式,選擇超聲波提取法提取花生芽中的6-芐基腺嘌呤;對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證,高效液相色譜法測(cè)定花生芽中6-芐基腺嘌呤含量的在1-50mg/L范圍線性良好,相關(guān)系數(shù)為0.9998,檢出限為0.1mg/kg,精密度為1.82%,用該方法測(cè)定花生芽中6-芐基腺嘌呤含量的回收率在90%以上。高效液相色譜法測(cè)定花生芽中6-芐基腺嘌呤含量的方法準(zhǔn)確,高效,可滿足檢測(cè)技術(shù)要求。
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