李杰,謝燕燕,王馨,王霖虹,和紅霞,孫慶云,晏亞輝,閆振宇

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院血液科,河北唐山 063000)

血友病B(hemophilia B)是一種X 染色體相關(guān)的隱性遺傳性疾病,其發(fā)病機制為編碼凝血因子IX的基因突變導(dǎo)致凝血功能障礙,目前尚無治愈方法[1]。 其作為一種單基因型疾病,基因治療為該疾病的治愈提供了可能。 間接體內(nèi)法(ex vivo)為基因治療的間接途徑,其實質(zhì)是指通過將攜帶目的基因的病毒或非病毒載體轉(zhuǎn)染實驗動物或患者體內(nèi)的組織或細胞,該組織或細胞作為靶細胞再次回輸入體內(nèi),產(chǎn)生所需蛋白的表達。 本實驗組前期已經(jīng)探討了攜帶hFIX 的重組腺病毒可以轉(zhuǎn)染小鼠脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose-derived stem cell,ADSC),并得到目的蛋白的表達,但未探討腺病毒轉(zhuǎn)染后,ADSC 的干性有無變化,也未進行轉(zhuǎn)染后細胞是否可以進行穩(wěn)定表達的實驗研究。 本實驗就此問題進行初步研究,探討ADSC 轉(zhuǎn)染攜帶目的基因的腺病毒后,干性有無改變及蛋白是否穩(wěn)定表達,為ADSC 作為血友病基因治療的靶細胞動物實驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級近交系雄性 C57BL/6 小鼠 4 只,3 ～4周齡,體重20 ～30 g,購自北京華阜康動物有限公司【SCXK(京)2019-0008】,飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)中心實驗室【SYXK(冀)2015-0038】。 自由進食水,室溫溫度控制在(18 ～26)℃,相對濕度40% ～70%, 12 h 晝夜交替,每次 8 ～ 12 h 通風(fēng)換氣。 本實驗通過華北理工大學(xué)實驗動物倫理委員會審查,符合動物倫理要求,按照3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 實驗細胞

實驗細胞為近交系C57BL/6 小鼠脂肪間充質(zhì)干細胞(ADSC),為本實驗組進行分離培養(yǎng)。

1.1.3 試劑與儀器

胎牛血清(PAN,P30-2600);DMEN/F12 培養(yǎng)基(Corning,10-092-CVR);Pen/Strep 青鏈霉素 雙抗 100X (Corning, 30 - 002-CI); PBS 緩 沖 液(Hyclone,02-024-1ACS);含 0.05%EDTA 胰蛋白酶(Hyclone,03-050-1B)。 重組腺病毒 Ad-F9-GFP 及Ad-GFP(上海漢恒生物科技有限公司)。堿性磷酸酶染色劑(BASO,BA4117);茜素紅染色劑(Lengene,美國);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,RR037 A);2 × UTaq PCR MasterMix(含染料)(ZOMANBIO, ZT201 A - 2 ); DNA Marker I(ZOMANBIO,zm101-2);Protease lnhibitor Cocktail(EDTA-Free,100Xin DMSO)(APExBIO,K1007);F9 Polyclonal Antibody(ABclonal,A1578);ACTB(ABclonal,AC026);超敏ExPlus ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(ZOMANBIO,ZD310 A-1);人凝血因子IX(FIX)ELISA Kit(Andy gene,Human1954)。

生物安全柜(海爾集團有限公司,HR60-IIA2,中國);超凈工作臺(Forma Scientific,美國);CO2細胞培養(yǎng)箱(Forma 公司,SL-JC-2323,美國);倒置相差顯微鏡(Olympus,CX-24,日本);熒光電子顯微鏡(Nikon 公司,TI-U,日本);普通 PCR 儀(伯樂生物技術(shù)有限公司,美國);電泳儀(伯樂生物技術(shù)有限公司,美國);酶標(biāo)儀(Biotek 公司,ELX800,美國);凝膠成像系統(tǒng) AI600(GE,美國)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

本實驗分為4 組,A 組：重組腺病毒Ad-F9-GFP轉(zhuǎn)染首次轉(zhuǎn)染細胞;B 組：重組腺病毒Ad-F9-GFP轉(zhuǎn)染后細胞傳代后1 代;C 組：重組腺病毒Ad-F9-GFP 轉(zhuǎn)染后細胞傳代后2 代;D 組：正常ADSC。

1.2.2 ADSC 復(fù)蘇

將凍存ADSC 從液氮中取出,迅速置于37℃水浴鍋中復(fù)溶,“8”字形滑動,注意期間凍存瓶蓋及封口膜位置不可接觸水浴鍋中溫水,避免污染。 待細胞溶解,約1 min 后將細胞快速置入含有0.5 mL 預(yù)熱培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,后逐漸加入培養(yǎng)基至3 ～4 mL。 滴管混勻后,置于 37℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h 后換液處理。

1.2.3 ADSC 的消化及傳代

將細胞培養(yǎng)瓶中原有細胞培養(yǎng)液棄去,加入3～5 mL 生理鹽水清洗2 次后棄去液體,注意將瓶中剩余生理鹽水應(yīng)用移液器去除,后加入600 μL 含0.05% EDTA 的胰蛋白酶,放入37℃細胞培養(yǎng)箱,2 min后顯微鏡下觀察,細胞完全消化后加入2 mL完全培養(yǎng)基終止,轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中,1000 rpm離心5 min 后棄去上清液,加入4 mL 10% FBS 將細胞吹勻后移至2 個細胞瓶中,每瓶放置2 mL 培養(yǎng)基,最后在每瓶細胞瓶中補充2 mL 10%FBS 培養(yǎng)基,放置于含有5% CO2的37℃孵育箱中培養(yǎng),3 d后再次換液。

1.2.4 重組腺病毒Ad-F9-GFP 體外轉(zhuǎn)染ADSC

取第3 代ADSC,計數(shù)2.5 × 105個細胞接種于12.5 cm2細胞瓶中,觀察細胞生長狀態(tài),當(dāng)細胞生長匯合率至70% ～80%,更換新的完全培養(yǎng)基,取重組腺病毒Ad-F9-GFP 按照MOI=300 轉(zhuǎn)染細胞(MOI=病毒載量×體積/細胞數(shù)量,本研究MOI=300 為前期實驗結(jié)果顯示最佳轉(zhuǎn)染MOI)。 24 h 后進行換液處理。 熒光顯微鏡觀察熒光表達情況。

1.2.5 轉(zhuǎn)染后ADSC 傳代培養(yǎng)

首次轉(zhuǎn)染后ADSC 留取足夠數(shù)量細胞,其余細胞進行傳代培養(yǎng),至轉(zhuǎn)染后第1、2 代細胞,熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況,傳代方法同1.2.3。

1.2.6 轉(zhuǎn)染后ADSC 的成骨誘導(dǎo)檢測

取重組腺病毒轉(zhuǎn)染后ADSC,觀察細胞生長狀態(tài),待匯合率為60% ～70%時,依據(jù)相關(guān)文獻[2-3]進行成骨誘導(dǎo),并于誘導(dǎo)培養(yǎng)第7 天后進行ALP 染色,第30 天后茜素紅染色。 觀察轉(zhuǎn)染后ADSC 的分化能力,初步探討重組腺病毒轉(zhuǎn)染后ADSC 的干性有無改變。

1.2.7 RT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染后ADSC 傳代后目的基因表達

依據(jù)實驗分組,A 組細胞轉(zhuǎn)染后72 h,B、C、D組待細胞長滿細胞瓶,應(yīng)用TRIzol 法提取細胞總RNA。 RNA 提取后,測定 RNA 純度及濃度測定。樣品合格后,取1 μg 提取RNA 根據(jù)試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄合成。 依據(jù) TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書,逆轉(zhuǎn)錄條件為 37℃ 15 min,85℃ 5 s,4℃forever。 以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物行 PCR,根據(jù)小鼠 GAPDH(179 bp)為內(nèi)參,F9(118 bp)的基因序列設(shè)計引物(表1),引物送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司Invitrogen 合成。 再行 PCR 擴增特異序列,PCR 反應(yīng)條件：94℃ 3 min,94℃ 30 s,60℃ 45 s,72℃ 1 min,72℃ 5 min,30 個循環(huán)。 PCR 產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.8 ELISA 檢測轉(zhuǎn)染后細胞及傳代后hFIX：Ag表達

依據(jù)實驗分組,A 組細胞轉(zhuǎn)染后72 h,B、C、D組待細胞長滿細胞瓶,提取細胞上清液,依據(jù)ELISA試劑說明書,檢測上清液中hFIX：Ag 表達情況。

1.2.9 Western Blot 檢測轉(zhuǎn)染后細胞及傳代后目的蛋白表達

依據(jù)實驗分組,A 組細胞轉(zhuǎn)染后72 h,B、C、D組待細胞長滿細胞瓶,提取細胞蛋白。 BCA 蛋白濃度測定后,行Western Blot 檢測蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗所得數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0 和 GraphPad Prism 5 軟件處理統(tǒng)計分析軟件進行分析,計量資料以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx ± s)表示,多組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,P ＜0.05 表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6 小鼠ADSC 復(fù)蘇后狀態(tài)觀察

如圖1 所示,凍存ADSC 在細胞復(fù)蘇后,大致外觀與凍存前ADSC 未見明顯改變,細胞呈均勻長梭型生長。

2.2 重組腺病毒 Ad-F9-GFP 轉(zhuǎn)染小鼠ADSC 及轉(zhuǎn)染后傳代熒光圖

重組腺病毒Ad-F9-GFP 轉(zhuǎn)染 ADSC 24 h 后,熒光顯微鏡下可見熒光表達。 隨時間延長熒光逐漸增強,72 h 后可見熒光亮度強于24 h。 待細胞長滿細胞瓶,傳代后仍可見熒光表達(圖2)。

2.3 轉(zhuǎn)染后ADSC 的成骨誘導(dǎo)檢測

如圖3 所示,A、B 兩圖為重組腺病毒轉(zhuǎn)染細胞后成骨誘導(dǎo),圖C、圖D 分別為第7 天、第30 天進行ALP 染色,圖C 為應(yīng)用偶氮偶聯(lián)法,圖中顯示大量紅色顆粒為細胞核,散在可見部分藍色顆粒。 圖D為第30 天行茜素紅染色,細胞間可見大小不一的棕褐色塊狀沉淀,即礦化結(jié)節(jié)。

2.4 RT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染后ADSC 傳代后目的基因表達

如圖 4 所示,四組細胞均可見到內(nèi)參基因GAPDH 的表達,在 F9 基因表達上, A、B、C 組可見到符合118 bp 基因表達片段,而D 組未見到表達情況。 根據(jù)圖像,進行灰度值分析,A、B、C 三組明顯高于D 組表達,差異具有顯著性。

2.5 ELISA 檢測轉(zhuǎn)染后細胞及傳代后hFIX:Ag表達

結(jié)果分析顯示四組細胞中,A 組、B 組及 C 組ELISA 法檢測抗原水平,均可見hFIX：Ag 的表達,分析四組間數(shù)據(jù),差異具有顯著性。 A 組中hFIX：Ag(81.62 ± 8.82)ng/mL 水平明顯高于其它三組,B 組(52.50 ± 3.25)ng/mL、C 組(47.41 ± 4.00)ng/mL hFIX：Ag 水平高于 D 組正常 ADSC(0.76 ± 0.44)ng/mL,提示ADSC 在轉(zhuǎn)染重組腺病毒Ad-F9-GFP后傳代2 次仍可穩(wěn)定表達目的蛋白(圖5)。

注：A：凍存前24 h;B：復(fù)蘇后24 h;C：復(fù)蘇后48 h;D：復(fù)蘇后72 h。圖1 復(fù)蘇后ADSC 細胞生長情況Note. A,24 hours before cryopreservation. B,24 hours after recovery. C,48 hours after recovery. D,72 hours after recovery.Figure 1 Growth of ADSC cells after recovery

注：A：轉(zhuǎn)染 24 h 后;B： 轉(zhuǎn)染 72 h 后;C：轉(zhuǎn)染后傳代 1 次;D：轉(zhuǎn)染后傳代 2 次。圖2 Ad-F9-GFP 轉(zhuǎn)染細胞及傳代后熒光表達Note. A, 24 hours after transfection. B, 72 hours after transfer. C, The first passage after transfer. D, The second passage after transfer.Figure 2 Fluorescent expression of Ad-F9-GFP transfected cells and subcultured cells

注：A：重組腺病毒轉(zhuǎn)染后成骨誘導(dǎo);B：重組腺病毒轉(zhuǎn)染后成骨誘導(dǎo)熒光圖;C：成骨誘導(dǎo)后堿性磷酸酶染色;D：成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色。圖3 重組腺病毒轉(zhuǎn)染ADSC 成骨誘導(dǎo)圖Note.A, Osteogenic induction after recombinant adenoviral transfer. B, Osteogenic induction fluorescence map after recombinant adenoviral transfer. C, Alkaline phosphatase staining after osteogenic induction. D, Alizalin red staining after osteogenic induction.Figure 3 Results of osteogenic induction of ADSC by recombinant adenovirus

注：與 D 組相比,***P＜ 0.001。 (下圖同)圖4 四組細胞F9 基因RT-PCR 結(jié)果及灰度值比較圖Note. Compared with group D,***P＜0.001.(The same in the following Figures)Figure 4 Comparison of RT-PCR results and gray value of F9 gene in the four groups

圖5 ELISA 檢測細胞上清液hFIX：Ag 表達水平Figure 5 Expression of hFIX：Ag in cell culture medium by ELISA

2.6 Western Blot 檢測轉(zhuǎn)染后細胞及傳代后hFIX表達

如圖6 所示,A 組蛋白表達灰度值(0.68 ±0.10)、B 組(0.49 ± 0.15)、C 組(0.18 ± 0.05)明顯高于D 組蛋白表達灰度值(0.02 ± 0.01),差異具有顯著性。

3 討論

血友病B 為一種單基因隱性遺傳性疾病,男性多發(fā)病,研究表明血友病發(fā)病率約為1/25 000[4],目前的治療方法主要以替代治療為主[5]。 然而,替代治療具有一個非常常見的問題,即FIX 因子半衰期約為24 h,隨著時間的延長,藥物濃度逐漸降低,無法持久維持在有效血藥濃度。 并且隨著給藥頻率的增加,也將增加患者體內(nèi)FIX 抗體即抑制物的發(fā)生率。 這種抑制物的產(chǎn)生則會使之后的凝血因子輸注達不到預(yù)期效果[6]。 作為一種單基因遺傳性疾病,基因治療成為可能治愈手段成為可能。 基因治療則可以分為體內(nèi)途徑(in vivo)和體外途徑(ex vivo),in vivo 主要是指將攜帶有目的基因的各種載體直接注入體內(nèi),從而產(chǎn)生一系列的蛋白表達,達到研究者的預(yù)期結(jié)果。 而ex vivo 則主要表現(xiàn)在將目的基因整合到從機體內(nèi)分離提取的各種干細胞上,再通過將該細胞移植到宿主體內(nèi),達到預(yù)期效果[7]。

圖6 Western Blot 檢測細胞hFIX 蛋白水平Figure 6 Western Blot was used to detect cellular hFIX protein expression

在各種間充質(zhì)干細胞中,脂肪間充質(zhì)干細胞(ADSC)具有其自身的優(yōu)勢,易于提取[8-10]。 研究表明,ADSC 仍具有其他間充質(zhì)干細胞的主要特征：具有向其它細胞分化的潛能[11-19]。 多項研究表明,ADSC 的應(yīng)用范圍非常廣泛,得到了眾多方面的應(yīng)用[20-29]。

在本研究前期工作中,對于 C57BL/6 小鼠ADSC 的分離培養(yǎng)有所涉及,并對于該細胞進行了流式細胞術(shù)及成脂成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)進行鑒定,證明ADSC 的成功抽提。 同時通過將腺病毒和ADSC相結(jié)合,對于血友病基因治療的體外方法成功奠定基礎(chǔ)。 初步證明了攜帶hFIX 基因的腺病毒能有效轉(zhuǎn)染ADSC,使其表達具有凝血活性的hFIX 蛋白?；谏鲜鰧嶒炑芯拷Y(jié)果,本實驗通過對于攜帶hFIX基因的腺病毒轉(zhuǎn)染后的ADSC 傳代培養(yǎng),初步探討攜hFIX 基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染后的ADSC 是否穩(wěn)定表達。

實驗過程中,我們發(fā)現(xiàn)重組腺病毒轉(zhuǎn)染ADSC后,經(jīng)過傳代后培養(yǎng),仍可表達較高的hFIX 活性。ELISA 檢測細胞上清液中,攜帶 F9 基因轉(zhuǎn)染的ADSC 經(jīng)過細胞傳代培養(yǎng)仍可以分泌hFIX 并分泌如細胞上清液。 數(shù)據(jù)表明,三組實驗組數(shù)據(jù)均明顯高于空白對照組。 Weston Blot 檢測四組ADSC 的細胞內(nèi)蛋白表達,A、B、C 三組均可見到表達在50kDa左右的hFIX 蛋白表達,而D 組未見到該蛋白表達。在本實驗中,應(yīng)用RT-PCR 檢測四組ADSC 中F9 基因表達情況,結(jié)果顯示：A、B、C 三組均可見到位于118 bp 的基因表達條帶而未見到D 組表達。 實驗中,ELISA、Weston Blot 及 RT-PCR 結(jié)果中,A 組數(shù)值均為最高,考慮與腺病毒本身的特點,該病毒為非包膜雙聯(lián)DNA,攜帶的遺傳物質(zhì)并不整合到宿主細胞基因組有關(guān)。 但是該病毒包裝量大,也避免了插入突變的風(fēng)險[30]。

綜合上述實驗結(jié)果,我們初步認為在攜帶hFIX基因的腺病毒轉(zhuǎn)染后的ADSC,其攜帶的hFIX 基因并不受細胞傳代的影響。 ADSC 可以作為基因治療的有效靶細胞。 這也為后續(xù)血友病ex vivo 基因治療動物實驗奠定了基礎(chǔ)。