彭冬冬,董珂,厲巧,周志敏,肖灑,姜德建

(湖南省藥物安全評價研究中心,新藥藥效與安全性評價湖南省重點實驗室,長沙 410331)

陰道炎是目前婦科門診中常見疾病,是引導(dǎo)粘膜及粘膜下結(jié)締組織發(fā)生的炎癥,其主要包括細菌性陰道炎、霉菌性陰道炎、滴蟲性陰道炎以及細菌和真菌混合性陰道炎。 臨床上陰道炎病例大多是由多種菌(包括細菌和真菌) 混合感染所致,以陰道黏膜易充血、腫脹,有顆粒狀膿皰和小出血點等為主要臨床表現(xiàn)。 根據(jù)病原學(xué)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,亞洲婦女陰道炎發(fā)病率如下：陰道毛滴蟲2% ～5%,念珠菌屬 3% ～ 14%,細菌性陰道病 0% ～16%,細菌和真菌混合感染50%以上,混合性陰道炎占比逐年上升[1]。 混合性陰道炎不僅會影響女性患者的生活質(zhì)量,而且會導(dǎo)致女性不孕癥,故此類動物模型建立對該病的治療和發(fā)病機制研究具有重要意義。 因此,本研究采用SD 大鼠通過混合菌(加德納菌GV10-1 菌,白色念珠菌,B 族鏈球菌懸液)誘導(dǎo)建立混合性陰道炎模型,并對其臨床表現(xiàn)和病理生理改變進行觀察,為混合性陰道炎的藥物開發(fā)和評價提供新模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級約7 周齡雌性 SD 大鼠30 只,體重210 g,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司【SCXK(湘)2019-0004】;飼養(yǎng)于湖南省藥物安全評價研究中心 ABSL-II 生物安全實驗室 IVC 系統(tǒng)【SYXK(湘)2015-0016】。 飼養(yǎng)期間各組大鼠自由飲水,飼喂SPF 鼠料(Co60消毒)由北京科澳協(xié)力飼料有限公司【SCXK(京)2019-0003】提供。 飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明,溫度20.9 ～25.9℃,濕度42.5% ～64%。 動物實驗均按照湖南省藥物安全評價研究中心動物倫理與福利委員會的指導(dǎo)方針和批準進行(審批號：IACUC-2019(3)051)。

1.1.2 受試物

復(fù)方甲硝唑陰道栓,組份為：甲硝唑0.45 g、四環(huán)素50 mg、制霉菌素30 mg。 規(guī)格：每粒3 g,批號：09191001,失效日期：2021.09。 主要適應(yīng)癥：用于治療滴蟲性陰道炎、霉菌性陰道炎、細菌性陰道炎和老年性陰道炎、非特異性陰道炎及支原體感染、淋病雙球菌感染等病癥。 生產(chǎn)單位：河北金牛原大藥業(yè)科技有限公司。

1.1.3 試劑與儀器

苯甲酸雌二醇注射液,批號：20180101,規(guī)格：2 mL：4 mg,10 支/盒,失效日期：2020.01.05,生產(chǎn)廠家：四川金科藥業(yè)有限責(zé)任公司;注射用硫酸鏈霉素,批號：17053101,規(guī)格：1 g(100 萬單位)/瓶,失效日期：2020.04,生產(chǎn)廠家：瑞陽制藥有限公司。 革蘭氏染色液試劑盒,貨號：HB8278,批號：20190511,生產(chǎn)單位：青島海博生物技術(shù)有限公司。

DFC 420C 型病理成像系統(tǒng)(德國 Leica);DM2500 型熒光顯微鏡(德國Leica);3111 型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo);SPL-250 型生化培養(yǎng)箱(天津市萊伯特瑞);TP1020 型全自動脫水機(德國Leica);EG1150H+C 型組織包埋機(德國 Leica);RM2235 型石蠟切片機(德國 Leica)、CX31 型生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司);CV5030+HV 型全自動封染一體機(德國Leica);BX43+MD50 型生物顯微鏡+數(shù)碼成像系統(tǒng)(日本奧林巴斯公司)。

1.1.4 試驗菌株

陰道加德納氏菌(BNCC 337545)和白色念珠菌(17015177)由杭州先端生物科技有限公司提供,B族鏈球菌(ATCC 12386)由北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司提供,均來源于陰道炎患者的白帶樣本。 所有菌株均在本中心進行培養(yǎng)及傳代,并擴增至108CFU/mL 以上。

1.2 方法[2-8]

1.2.1 菌株的復(fù)蘇、傳代/純化

陰道加德納氏菌：取陰道加德納氏菌甘油凍存液,于37℃水浴中輕輕搖晃,加速解凍,用一次性無菌接種環(huán)劃線接種于哥倫比亞血平板(成品,購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)上復(fù)蘇,(36 ± 1)℃厭氧培養(yǎng)48 h,形成灰白色、半透明、光滑、針尖樣大小的菌落。 用一次性無菌接種環(huán)于一生長良好的陰道加德納氏菌的哥倫比亞血平板上挑取單個菌落,采用劃線法轉(zhuǎn)接于另一無菌哥倫比亞血平板上,(36 ± 1)℃培養(yǎng)48 h,2 ～ 8℃暫存,備用。

B 族鏈球菌：取 B 族鏈球菌甘油凍存液,于37℃水浴中輕輕搖晃,加速解凍,用一次性無菌接種環(huán)劃線接種于血平板(成品,購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)上復(fù)蘇,(36 ± 1)℃培養(yǎng)24 h 后,形成灰白色、表面光滑、圓形、β 溶血的菌落,部分菌株無明顯β 溶血環(huán)。 用一次性無菌接種環(huán)于一生長良好的B 族鏈球菌的血平板上挑取單個菌落,采用劃線法轉(zhuǎn)接于另一無菌血平板上,(36 ± 1)℃培養(yǎng)24 h,2 ～ 8℃暫存,備用。

白色念珠菌：取白色念珠菌甘油凍存液,于37℃水浴中輕輕搖晃,加速解凍,用一次性無菌接種環(huán)劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂(成品,購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。 121℃,30 min 高溫高壓滅菌,待冷卻至50℃左右,注入20 ～25 mL 于90 mm無菌培養(yǎng)皿中,待凝固后方可使用)平板上復(fù)蘇,25～28℃培養(yǎng)48 h 后,生成灰白乳酪樣菌落。 用一次性無菌接種環(huán)于一生長良好的白色念珠菌的沙氏葡萄糖瓊脂平板上挑取單個菌落,采用劃線法轉(zhuǎn)接于另一無菌沙氏葡萄糖瓊脂平板上,25 ～28℃培養(yǎng)48 h,2 ～ 8℃暫存,備用。

1.2.2 形態(tài)觀察及革蘭氏染色觀察

光學(xué)顯微鏡下觀察陰道灌洗液菌株形態(tài)和數(shù)量等。 用接種環(huán)挑取1 環(huán)蒸餾水至潔凈載玻片上,挑取1 個單菌落,與蒸餾水混合均勻;涂布經(jīng)火焰固定,加結(jié)晶紫溶液和碘液,各染1 min 水洗,脫色液,不時搖動載玻片約10 ～30 s,至無紫色脫落為止水洗,再加復(fù)染色染1 min 水洗。 干后油鏡觀察菌株形態(tài)。

1.2.3 大鼠混合性陰道炎模型建立

30 只大鼠分別于給藥前第1 ～3 天每只皮下注射0.5 mg 的苯甲酸雌二醇注射液(每日上午進行),其中20 只模型大鼠陰道內(nèi)注入鏈霉素每只每次50 μg(上午進行),然后向陰道內(nèi)注入混合菌(加德納菌GV10-1 菌,白色念珠菌,B 族鏈球菌懸液)(1 × 108CFU/mL)每只每次 50 μL(下午進行),每天1 次,連續(xù)3 d,復(fù)制混合性陰道炎模型,空白組大鼠陰道接種 50 μL 不含菌株的半固體培養(yǎng)基。 模型組和空白組大鼠分別于分組前向大鼠陰道內(nèi)注入50 μL 無菌 PBS,移液槍輕輕吹打5 次后吸出沖洗液(約250 μL),取50 μL 用于顯微鏡下觀察是否存在陰道混合菌感染。 選取感染成功20 只大鼠按體重和菌株負荷量隨機分為模型組和藥物驗證組(復(fù)方甲硝唑陰道栓每只54 mg,每天1 次,連續(xù)5 d),每組10 只動物。 正常組和模型組大鼠經(jīng)陰道給予等量的0.9%氯化鈉注射液。

1.2.4 觀察指標

(1)分別于分組前及給藥第5 天后用棉簽蘸取SD 大鼠外陰或陰道分泌物,涂于病理載玻片上,酒精固定,常規(guī)瑞氏染色和革蘭氏染色鏡檢,并在顯微鏡(× 200 倍)下觀察菌體和線索細胞情況。 治愈(轉(zhuǎn)陰)：顯微鏡下觀察不到菌絲和(或)芽孢(或)線索細胞;未愈：顯微鏡下觀察可見菌絲和(或)芽孢(或)線索細胞。 計算轉(zhuǎn)陰率(轉(zhuǎn)陰率=治愈例數(shù)/動物總例數(shù))(2)分別于分組前及給藥第5 天后取大鼠陰道分泌物進行清潔度檢查。 陰道清潔度評分標準：I 度：鏡下以陰道桿菌為主,并可見大量上皮細胞,計為1 分;II 度：有部分陰道桿菌,上皮細胞亦可見,也有部分膿細胞和雜菌,計為2 分;III度：只見少量陰道桿菌和上皮細胞,但有大量的膿細胞和其他雜菌,計為3 分;IV 度：鏡下無陰道桿菌,幾乎全是膿細胞和大量雜菌,計為4 分。 (3)于末次給藥后處死大鼠,取出、吸干表面液體后稱量陰道重量,計算陰道指數(shù)(陰道指數(shù)=陰道重量/動物體重),同時測量陰道pH。 (4)收集分組前、治療5 d 的陰道灌洗液,按照梯度稀釋后進行培養(yǎng),計數(shù)100 μL 灌洗液中的菌落數(shù)。 (5)取陰道組織置于10%中性福爾馬林溶液中固定,石蠟包埋、切片、HE 染色進行組織病理學(xué)觀察。 根據(jù)充血、水腫、出血、浸潤4 項指標進行評分,具體評分標準：黏膜上皮光滑,無壞死脫落,黏膜下無充血、水腫、出血、炎細胞浸潤,陰道內(nèi)無炎性滲出物,計為0 分;黏膜上皮無壞死脫落,黏膜下充血,陰道內(nèi)無炎性滲出物,計為1 分;黏膜上皮有灶性壞死脫落,黏膜下充血、水腫,無炎細胞浸潤,計為2 分;黏膜上皮有灶性壞死脫落,黏膜下充血、水腫、點狀出血、少量炎細胞浸潤,計為3 分;黏膜上皮壞死脫落,黏膜下充血、水腫、點狀出血、炎細胞浸潤,陰道內(nèi)有大量炎性滲出物,計為4 分。 記錄炎癥分值并統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,計量資料采用平均值± 標準差( ˉx ± s)表示。 Leven’s test 方法檢驗方差齊性,單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行統(tǒng)計分析,LSD test(參數(shù)法)進行兩兩比較分析。 計數(shù)資料以百分率表示,采用χ2檢驗或Fisher確切概率法,以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 陰道分泌物涂片轉(zhuǎn)陰率

如圖1 和圖2 所示,正常組10/10 例動物陰道涂片未染色和染色鏡檢可見少量卵圓形白色念珠菌,但均未見菌絲和線索細胞,感染率為0;模型組9/10 例動物陰道涂片未染色和染色鏡檢可見大量菌絲和球狀的線索細胞,感染率90%;復(fù)方甲硝唑陰道栓組9/10 例動物陰道涂片未染色和染色鏡檢未見菌絲和線索細胞,1/10 例動物陰道涂片未染色和染色鏡檢可見菌絲,但不未見線索細胞,治愈率90%。

2.2 陰道灌洗液混合菌計數(shù)

如圖3 及圖4 所示,革蘭氏染色鏡檢,陰道加德納氏菌染色鏡檢,呈革蘭陰性細小桿菌,常呈球桿狀;B 族鏈球菌呈革蘭陽性球菌,單個、成雙或鏈狀排列、長短不一;白色念珠菌表層卵圓形芽生細胞,革蘭染色呈陽性。 如表1 所示,與正常組比較,給藥第5 天后模型組陰道灌洗液混合菌計數(shù)顯著增加(P ＜0.01);與模型組比較,給藥第5 天后復(fù)方甲硝唑陰道栓組陰道灌洗液混合菌計數(shù)顯著降低(P ＜0.01)。

圖1 陰道涂片(× 40,標尺 = 50 μm)Figure 1 Vaginal smear(× 40,Bar = 50 μm)

圖 2 陰道涂片(Wright’s staining,× 10,標尺 = 100 μm)Figure 2 Vaginal smear (Wright’s staining, × 10,Bar = 100 μm)

圖3 接種前菌株培養(yǎng)鏡檢(革蘭氏染色, × 100,標尺 = 100 μm)Figure 3 Microscopic examination of strain culture before inoculation (Gram’s staining, × 100, Bar = 100 μm)

注：A： 革蘭氏染色(陰道加德納氏菌;B 族鏈球菌);B：陰道涂片(白色念珠菌)。圖4 陰道灌洗液鏡檢(× 40,標尺 = 50 μm)Note. A, Gram staining (gardnerella vaginalis; group B streptococcus). B, Vaginal smear (candida albicans).Figure 4 Transvaginal lavage(× 40,Bar = 50 μm)

表1 混合性陰道炎對大鼠陰道灌洗液菌落數(shù)的影響( ˉx ±s,n = 10)Table 1 Effects of mixed vaginitis on colony count of vaginal lavage in rats ( ˉx ±s,n =10)

2.3 陰道清潔度檢查

正常組動物陰道涂片有部分陰道桿菌,同時可見大量的上皮細胞,清潔度為II 度,評分為2.0 ±0.0;模型組動物陰道涂片僅少見上皮細胞,無陰道桿菌,可見大量的雜菌,清潔度為III ～IV 度,評分為3.7 ± 1.2;復(fù)方甲硝唑陰道栓組動物陰道涂片僅少量的陰道桿菌,可見部分的上皮細胞,清潔度為II～ IIII 度,評分為 2.3 ± 0.2。 提示模型組動物連續(xù)接種混合菌3 d,致病菌經(jīng)5 d 在大鼠陰道體內(nèi)不斷繁殖,優(yōu)勢菌逐漸減少,清潔度明顯增加(P ＜0.05);經(jīng)陰道給予復(fù)方甲硝唑陰道栓治療5 d 后,清潔度較模型組明顯降低(P ＜0.05)。

2.4 陰道pH

給藥前各組動物陰道分泌物經(jīng)0.1 級pH 試紙檢測,正常組、模型組及復(fù)方甲硝唑陰道栓組陰道分泌物 pH 值分別為 4.1 ± 0.9、4.0 ± 1.2、3.9 ±1.4;給藥第5 天,正常組、模型組及復(fù)方甲硝唑陰道栓組陰道分泌物 pH 值分別為 4.2 ± 1.1、7.7 ±2.1、4.5 ± 0.6。 提示模型組動物連續(xù)接種混合菌3 d,致病菌經(jīng)5 d 在大鼠陰道體內(nèi)不斷繁殖,優(yōu)勢菌逐漸減少,pH 值明顯增加(P ＜0.01);經(jīng)陰道給予復(fù)方甲硝唑陰道栓治療5 d 后,動物陰道pH 值與給藥前變化不大,與同期模型組比較,pH 值明顯降低(P ＜ 0.01)。

2.5 陰道組織指數(shù)

正常組、模型組及復(fù)方甲硝唑陰道栓組陰道體質(zhì)量分別為 1.02 ± 0.23、0.98 ± 0.45 及 1.13 ±0.17,模型組大鼠陰道指數(shù)與正常組比較,差異不具有顯著性;混合性陰道炎大鼠經(jīng)復(fù)方甲硝唑陰道栓治療5 d 后,復(fù)方甲硝唑陰道栓組陰道指數(shù)與模型組比較,差異不具有顯著性。

2.6 陰道組織病理檢查

2.6.1 一般鏡下觀察

如圖5 所示,正常組：陰道黏膜上皮細胞未見壞死,固有層為致密結(jié)締組織,未見充血水腫及炎細胞浸潤。 模型組：陰道壁變厚,上皮細胞壞死,固有層出現(xiàn)充血和水腫,以中性粒細胞為主,淋巴細胞和單核細胞炎細胞浸潤,纖維細胞增生明顯。 復(fù)方甲硝唑陰道栓組陰道分泌物減少,鏡下觀察上皮連續(xù)性好,少見淺表糜爛,炎癥細胞浸潤減少。

2.6.2 陰道組織病變評分

正常組陰道組織未見炎癥細胞浸潤或水腫及充血,病變評分為0.0 ± 0.0;模型組陰道組織可見大量的炎癥細胞浸潤,同時伴有炎性滲出物,病變評分為3.5 ± 0.4;復(fù)方甲硝唑陰道栓組陰道組織可見充血,但未見水腫和炎癥細胞浸潤,病變評分為1.0 ± 0.1。 結(jié)果顯示模型組動物連續(xù)接種混合菌3 d,大鼠陰道組織病變程度加重(P ＜0.01);經(jīng)陰道給予復(fù)方甲硝唑陰道栓治療5 d 后,動物陰道組織病變程度有所減輕(P ＜0.01)。 提示復(fù)方甲硝唑陰道栓能顯著改善混合性陰道炎大鼠陰道組織病變程度。

3 討論

混合性陰道炎是指陰道受多種病菌(如霉菌、細菌、滴蟲等)、原蟲感染而引起的炎癥性病變,也就是陰道菌群失調(diào)的局部表現(xiàn)。 臨床實踐上多數(shù)是混合感染,如真菌感染多繼發(fā)于細菌感染或治療之后。 臨床上婦科診斷主要通過陰道分泌物培養(yǎng)、清潔度、pH 以及胺臭味試驗檢查,篩選出可能性疾病。 陰道炎治療原則主要是消除誘因,根據(jù)患者情況選擇局部或全身應(yīng)用抗真菌藥物,應(yīng)將抗真菌藥與抗細菌藥聯(lián)合應(yīng)用。 但這些藥物在殺死致病菌的同時,也殺死了起自潔作用的乳桿菌,所以只能取得暫時緩解,由于失去優(yōu)勢乳桿菌的保護,新一輪感染很快出現(xiàn),導(dǎo)致遷延反復(fù)。 由此可見,陰道炎方面疾病對人類健康的危害依然嚴重,其治療任務(wù)依然艱巨,因此建立符合臨床陰道炎表現(xiàn)的模型對陰道炎的治療都有著重要的意義。 目前文獻報道的模型有細菌性、真菌性、滴蟲性和衣原體性陰道炎模型,其中真菌性陰道炎模型研究較多,而真菌和細菌混合感染模型報道甚少,因此本研究主要通過大鼠經(jīng)皮下注射給予苯甲酸雌二醇,建立假動情期,同時經(jīng)陰道給予注射用硫酸鏈霉素處理,能夠破壞正常大鼠的陰道菌群, 再注入致病性混合菌(加德納菌GV10-1 菌,白色念珠菌,B 族鏈球菌懸液)更容易定植到大鼠陰道內(nèi),有利于混合菌的生長和繁殖,從而復(fù)制混合性陰道炎模型。

圖5 SD 大鼠陰道組織病理切片(× 100,HE 染色)Figure 5 Vaginal histopathological sections of SD rats (× 100, HE staining)

研究顯示,混合性陰道炎模型組大鼠給藥第5天混合感染率為90%,致病性菌落數(shù)顯著增加,陰道分泌物涂片轉(zhuǎn)陰率顯著減少,清潔度評分顯著增加,同時陰道pH 顯著增加,其異常癥狀與臨床上陰道炎的臨床表現(xiàn)相似。 顯微鏡下觀察到陰道壁變厚,上皮細胞壞死,固有層出現(xiàn)充血和水腫,以中性粒細胞為主,淋巴細胞和單核細胞炎細胞浸潤,纖維細胞增生明顯,其病理改變與臨床基本一致。 復(fù)方甲硝唑陰道栓含有甲硝唑、制霉菌素、四環(huán)素等多種成分,可以同時殺死細菌、霉菌和滴蟲,用于治療滴蟲性陰道炎、細菌性陰道炎和霉菌性陰道炎等多種類型的陰道炎。 甲硝唑的抗菌譜包括消化鏈球菌、韋榮球菌、梭形桿菌、真桿菌等,其中甲硝唑的硝基在特定條件下還原成一種細胞毒性物質(zhì),并參與細菌的基因代謝過程致細菌的死亡[9-11]。 制霉菌素栓劑是一種多烯型抗真菌藥物,對念珠菌屬的抗菌活性高,可與真菌細胞膜上甾醇結(jié)合,改變細胞膜通透性進而發(fā)揮抗菌功能[12]。 故本次研究選用復(fù)方甲硝唑陰道栓作為混合性陰道炎模型的陽性藥進行驗證,結(jié)果顯示復(fù)方甲硝唑陰道栓能顯著減輕陰道黏膜的炎癥浸潤,顯著減少陰道分泌物和陰道灌洗液的致病菌群數(shù)目,同時降低陰道pH 值和清潔度評分。

綜上所述,對大鼠進行雌激素和注射用硫酸鏈霉素預(yù)處理后,接種混合菌可成功建立大鼠混合性陰道炎模型,為女性生殖系統(tǒng)的藥物篩選與評價提供有效的動物模型。