陳林軍,楊焱,吳迪,陳萬超,董國超,喬徐馨,吳春燕,李婷婷,3*

(1. 上海健康醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院,上海 200237; 2. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,上海 201403;3. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

近年來,隨著生活水平的提高,我國居民的生活習(xí)慣和膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生很大改變,高嘌呤和高糖食物攝入的不斷增加。 我國高尿酸血癥患病率已達(dá)13.7%,發(fā)病年齡呈低齡化,高尿酸血癥及其并發(fā)癥發(fā)病率呈逐年上升趨勢。 尿酸是人類嘌呤代謝的最終產(chǎn)物,當(dāng)血中尿酸水平大于420 μmol /L(7 mg/dL)時(shí)即定義為高尿酸血癥[1-3]。 尿酸鹽在關(guān)節(jié)腔和組織中沉積,進(jìn)而引發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性腎病,高尿酸血癥已是當(dāng)前影響人類健康的一種嚴(yán)重的代謝性疾病[4]。 因此建立穩(wěn)定的高尿酸血癥及肝腎損傷動物模型,對人類預(yù)防高尿酸血癥、篩選相關(guān)治療藥物尤為重要。

人類由于缺乏尿酸酶,因而尿酸是嘌呤代謝的最終產(chǎn)物。 但是其他大多數(shù)哺乳動物體內(nèi)固有尿酸酶,可將尿酸降解為尿囊素而隨尿液排出體外,故大多數(shù)動物體內(nèi)血尿酸值較低,建立高尿酸血癥的動物模型是非常困難的[5]。 迄今為止,高尿酸造模方法存在觀察周期較短,不穩(wěn)定的問題,國內(nèi)外尚無公認(rèn)的高尿酸血癥動物模型。 本研究采用給予尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀,同時(shí)增加體內(nèi)尿酸前體(次黃嘌呤、酵母)的量,以及高果糖攝入同時(shí)抑制腎小管尿酸的分泌聯(lián)合造模的方法,通過五個(gè)動物模型組篩選大鼠血清尿酸升高并維持較長時(shí)間的建模方法。 通過大鼠血清中尿酸(uric acid,UA)、尿素(urea,Urea)、肌酐(creatinine,Cr)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)等水平的檢測來考察與評價(jià)其建立持續(xù)、穩(wěn)定的高尿酸動物模型的可行性,并同時(shí)對大鼠踝關(guān)節(jié)組織、腎組織形態(tài)學(xué)觀察來比較不同高尿酸血癥造模法對腎、踝關(guān)節(jié)繼發(fā)性損傷的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級雄性 Sprague-Dawley 大鼠(下稱 SD 大鼠)48 只,(6 ± 1)周齡,體重(190 ± 10)g,購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司【SCXK(滬)2019-0812】,飼養(yǎng)在上海健康醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心【SYXK(滬)2018-0029】,室溫維持 25℃恒溫,動物自由飲水及攝食。 所有操作均根據(jù)美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)發(fā)布的實(shí)驗(yàn)室動物護(hù)理和使用指南(8th Edition, 2011, ISBN 10： 0-309-15400-6)進(jìn)行且均符合上海健康醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求(審批號：2019-HXXM-05-3048)。

1.1.2 試劑與儀器

氧嗪酸鉀(Potassium Oxonate,PO,阿拉丁,P137112);次黃嘌呤(Hypoxanthine,H,H108384);酵母膏(Yeast extract,YE,Y110984);鹽酸乙胺丁醇片(EMB,特一藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,國藥準(zhǔn)字H44023635);普通大鼠飼料(遼寧省沈陽前民動物實(shí)驗(yàn)飼料廠,GB14924.3-2010);氧嗪酸鉀聯(lián)合酵母混合飼料(2%氧嗪酸鉀,12%酵母膏,定制于北京博泰宏達(dá)生物);尿酸試劑盒(尿酸酶法、CH0101054、邁克生物股份有限公司);尿素試劑盒(尿素酶-谷氨酸脫氫酶法、CH0101051、邁克生物股份有限公司)等。

離心機(jī)(eppendorf,centrifuge 5424,美國),全自動生化分析儀(HITACHI,7080 Automatic Analyzer,日本), PRECICE 全自動數(shù)字切片掃描系統(tǒng)(PRECICE 500,北京優(yōu)納科技有限公司,中國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

將48 只雄性 Sprague-Dawley 大鼠(下稱 SD 大鼠)隨機(jī)分為6 組(每組8 只),分別為空白對照組(Control 組)、氧嗪酸鉀組(OA 組)、氧嗪酸鉀+次黃嘌呤組(OA+H 組)、氧嗪酸鉀+酵母膏組(OA + YE組)、10%果糖+乙胺丁醇組(10% Fru + 0.2% EMB組)、2%氧嗪酸鉀聯(lián)合12%酵母特殊飼料組(OA PO組)。 所有動物適應(yīng)生活環(huán)境,自由進(jìn)食和飲水,1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 造模方法

Control 組給予正常飼養(yǎng),OA 組給予250 mg/(kg·d)氧嗪酸鉀腹腔注射,OA + H 組給予氧嗪酸鉀 250 mg/(kg·d)聯(lián)合次黃嘌呤 100 mg/(kg·d)腹腔注射, OA + YE 組給予氧嗪酸鉀250 mg/(kg·d)腹腔注射聯(lián)合酵母膏3.5 mL/(kg·d)灌胃,除OA PO 組喂食氧嗪酸鉀聯(lián)合酵母特殊飼料,10% Fru +0.2% EMB 組飲用果糖加乙胺丁醇的水外,其余組別SD 大鼠均攝取正常飼料和飲用正常水,造模方法詳見表1。 每周尾部采血1 次,連續(xù)造模5 周。

1.2.3 檢測指標(biāo)及處理

采血前12 h 禁食、不禁水,每周對SD 大鼠尾部靜脈抽血每只0.5 mL,37℃水浴30 min,以3000 r/min 離心 15 min,取血清 200 μL,按照尿酸、尿素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒(maccura,上海)的操作說明,并采用自動生化儀測定血清中各生化指標(biāo)的水平。

1.2.4 大鼠腎及關(guān)節(jié)病理組織學(xué)檢查

大鼠處死后,取全腎及膝關(guān)節(jié),全腎用生理鹽水清洗后,浸泡在福爾馬林溶液中固定。 SD 大鼠膝關(guān)節(jié)浸潤EDTA 脫鈣液中12 d,達(dá)到用針可以輕松刺穿的程度后,進(jìn)行固定。 取肝、腎、膝關(guān)節(jié)組織進(jìn)行脫水、石蠟包埋、制片(4 μm)、HE 染色、利用PRECICE 全自動數(shù)字切片掃描系統(tǒng)觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS Statics 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用單因素方差分析,以P＜0.05 表示差異有顯著性;P＜0.01 表示差異極具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察

空白組大鼠飲食正常,毛色光滑,反應(yīng)靈敏,體重正常;5 個(gè)造模組隨著時(shí)間的推移,體重相對空白對照組有明顯減輕,毛色發(fā)黃,食量減少,排尿量明顯增多,且1 月后造模組開始出現(xiàn)大鼠踝關(guān)節(jié)紅腫等炎癥,腳踝行動不靈活現(xiàn)象,且OA PO 組大鼠體重減輕最明顯,精神萎靡,易怒,且腳踝腫脹程度明顯高于其他造模組。

2.2 大鼠血清中尿酸值、尿素值變化

2.2.1 不同造模組大鼠血清中尿酸值變化

與空白組相比較,除OA PO 組外,其余模型組尿酸值總體沒有升高反而略微有所降低,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;建模 1 周,模型組 OA、OA + H、OA + YE、10%Fru + 0.2% EMB 與空白組接近,OA PO 組尿酸反而降低,可能是氧嗪酸鉀作為一種尿酸酶的競爭性抑制劑,大鼠體內(nèi)尿酸濃度快速升高時(shí),可能反饋性促進(jìn)尿酸酶的表達(dá)或者活性增加[6];建模5 周,OA PO 組尿酸值與空白組比較有顯著的升高,且差值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;OA、OA + H、OA + YE、10% Fru+ 0.2% EMB 模型組與空白組相比較尿酸值持續(xù)降低,出現(xiàn)模型組尿酸值不升高反而降低的異?，F(xiàn)象,可能與大鼠體內(nèi)的尿酸酶活力反饋性升高有關(guān)。 (見表1)

2.2.2 不同造模組大鼠血清生化指標(biāo)的比較

血尿素(Urea)與肌酐(Cre)都是反應(yīng)腎功能的重要指標(biāo),丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)是反映肝功能的生化指標(biāo)[7]。造模5 周后,各組實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)血清生化指標(biāo)見圖1。造模組的血清肌酐和尿素氮水平明顯低于健康對照組,氧嗪酸鉀聯(lián)合酵母特殊飼料組(OA PO 組)血清中肌酐、尿素水平大幅提升,伴有嚴(yán)重的腎損傷,血肌酐水平顯示已經(jīng)出現(xiàn)腎衰現(xiàn)象。 同時(shí),丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平顯著降低,說明肝也伴有明顯損傷。 其他各模型組尿素氮和肌酐與對照組相比,氧嗪酸鉀 + 次黃嘌呤組(OA+ H 組) 尿素水平有顯著升高,腎出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷。氧嗪酸鉀組(OA 組)、氧嗪酸鉀+次黃嘌呤組(OA +H 組) 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶有降低,肝出現(xiàn)損傷。10%果糖+乙胺丁醇組(10%Fru + 0.2%EMB 組)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平降低,肝也出現(xiàn)損傷。

表1 每周各組大鼠血清中尿酸水平變化(μmol/L,n=8)Table 1 Changes of serum uric acid level in rats of each group every week(μmol/L,n=8)

2.3 大鼠肝及關(guān)節(jié)病理形態(tài)學(xué)觀察

2.3.1 大鼠肝形態(tài)觀察及HE 染色

大鼠肝組織大體標(biāo)本見圖2,肉眼觀察可見,空白對照組肝為棕紅色,包膜光滑,質(zhì)地柔軟;模型組肝顏色略微發(fā)黃,肝體積有增大,質(zhì)地變硬,OA PO組較為嚴(yán)重。 大鼠肝組織HE 染色顯示,空白對照組未見肝細(xì)胞脂肪變性,未見明顯炎癥性細(xì)胞浸潤;模型組 OA 組、OA + H 組、OA + YE 組、OA PO組局部肝匯管區(qū)可見少量炎癥細(xì)胞浸潤,說明OA組、OA + H 組、OA + YE 組、OA PO 組對 SD 大鼠腎均有不同程度損傷,其中氧嗪酸鉀混合飼料組損傷最嚴(yán)重。

注：大鼠在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)血清生化指標(biāo)與Control 組比較,*P ＜0.05,** P ＜0.01,***P ＜0.001。圖1 大鼠在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)血清生化指標(biāo)的比較Note. Compared with Control group, *P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01,***P ＜ 0.001.Figure 1 Comparison of serum biochemical indicators in rats at the end of experiment

圖2 各組大鼠的肝及HE 染色病理切片(箭頭：炎細(xì)胞浸潤)Figure 2 Livers and HE stained pathological sections of rats in each group(Arrows indicate inflammatory cell infiltration)

2.3.2 大鼠腎形態(tài)觀察及HE 染色

大鼠腎組織大體標(biāo)本見圖3,肉眼觀察可見,空白對照組腎色暗紅,表面光滑,外觀無腫脹造;模組腎均有肥大,呈鼓型,腎色發(fā)黃,OA PO 組尤為嚴(yán)重,且外觀表面細(xì)顆粒狀。 對大鼠腎組織進(jìn)行病理組織學(xué)檢查,根據(jù)HE 染色顯示,空白對照組大鼠腎結(jié)構(gòu)正常,腎小球大小正常,腎小管結(jié)構(gòu)清晰完整,無異變,無結(jié)晶積累,間質(zhì)內(nèi)未見異常; OA、OA +H、OA + YE 各模型組均出現(xiàn)腎小球內(nèi)不同程度的尿酸鈉鹽結(jié)晶沉積,腎小管排列不規(guī)則不明顯,OA + H組腎小管周圍炎性細(xì)胞浸潤;模型10% Fru + 0.2%EMB 組有少量的尿酸鈉鹽沉積,腎小管局部擴(kuò)張;模型OA PO 組腎小球硬化,內(nèi)有大量的尿酸鈉鹽結(jié)晶積累,間質(zhì)嚴(yán)重?cái)U(kuò)張,所有腎小球發(fā)生病變,腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)空泡非常明顯,說明OA 組、OA + H 組、OA + YE 組、OA PO 組對SD 大鼠腎都有不同程度損傷,且氧嗪酸鉀混合飼料損傷最嚴(yán)重。

2.3.3 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜肌組織病理學(xué)觀察

滑膜是關(guān)節(jié)囊內(nèi)的一層很薄的組織,當(dāng)關(guān)節(jié)內(nèi)部受到刺激時(shí),滑膜就會首先發(fā)生炎性反應(yīng),引起積液、發(fā)熱腫大等癥狀運(yùn)動表現(xiàn)欠佳,導(dǎo)致關(guān)節(jié)屈伸困難。 痛風(fēng)性滑膜炎,正是因?yàn)槟蛩峤Y(jié)晶這一刺激物,沉積至滑膜所引起的[8]。 選取空白對照組及OA、OA + H、OA + YE、10% Fru + 0.2% EMB、OA PO 各模型組的踝關(guān)節(jié)滑膜肌進(jìn)行病理組織學(xué)檢查(圖4),根據(jù)HE 染色顯示,空白對照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜 2 ～ 5 層排列規(guī)整、緊致、有序; OA、OA + H、OA+ YE、10% Fru + 0.2% EMB、OA PO 各模型組關(guān)節(jié)滑膜增厚,排列散亂、無序、松散,其中OA + YE 組有大量的中性粒細(xì)胞浸潤,其他模型組有輕微炎癥細(xì)胞,這與造模組大鼠腳踝出現(xiàn)紅腫炎癥表象一致。 雖然 OA、OA + H、OA + YE、10% Fru + 0.2%EMB 模型組尿酸值波動幅度小,且有幾個(gè)時(shí)間段尿酸值有略微降低。 但是大鼠取材前已出現(xiàn)步態(tài)異常,踝關(guān)節(jié)腫脹,病理觀察也出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤等關(guān)節(jié)炎癥狀[9]。 吳燕升等[10]研究報(bào)道,氧嗪酸鉀造模后,大鼠會出現(xiàn)一個(gè)短暫性的尿酸升高隨后降低的現(xiàn)象,一般會在12 h 內(nèi)恢復(fù)到正常水平。 所以我們推斷由于大鼠體內(nèi)尿酸酶的作用,OA、OA + H、OA+ YE、10% Fru + 0.2% EMB 這 4 個(gè)模型組 12 h 后大鼠血清尿酸值降低,檢測不到高尿酸,但是踝關(guān)節(jié)已經(jīng)出現(xiàn)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎癥狀。

注： 紅色箭頭：尿酸鈉沉積結(jié)晶;黑色箭頭：病變腎小管;藍(lán)色箭頭：病變腎小球。圖3 各組大鼠的腎及HE 染色病理切片Note. Red arrow, deposition and crystallization of sodium uric acid. Black arrow, diseased renal tubules. Blue arrow,diseased glomeruli.Figure 3 Kidney and HE stained pathological sections of rats in each group

圖4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜肌組織HE 染色病理切片(圈出部分為大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織)Figure 4 HE stained pathological sections of of ankle joints in rats of each group(Circled portion is synovial tissue from rat ankle)

采用氧嗪酸鉀聯(lián)合酵母特殊飼料組(2%氧嗪酸鉀,12%酵母膏),第5 周已經(jīng)達(dá)到維持較長時(shí)間的高尿酸水平。 通過腎組織、踝關(guān)節(jié)HE 染色,腎組織腎小球內(nèi)有大量尿酸鈉晶體沉積,腎小管上皮細(xì)胞可見明顯的胞質(zhì)空泡,排列紊亂,管腔擴(kuò)張,說明腎損傷非常嚴(yán)重,關(guān)節(jié)滑膜略微增厚,排列散亂,少量中性粒細(xì)胞浸潤。 與其他模型組相比,氧嗪酸鉀混合飼料組血尿酸、血尿素、血肌酐、腎損傷效果都較為明顯。 且建模方法更接近人類痛風(fēng)疾病的發(fā)病機(jī)制,可以最大程度上的模擬臨床上形成的痛風(fēng)癥狀有利于研究人類高尿酸相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制以及治療藥物靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)。

3 討論

建立高尿酸血癥動物模型,主要通過增加尿酸來源、抑制尿酸排出、抑制尿酸酶的活性來進(jìn)行[11-12]。 本實(shí)驗(yàn)建立了5 種造模方法,氧嗪酸鉀組(OA)、氧嗪酸鉀 + 次黃嘌呤組(OA + H)、氧嗪酸鉀+酵母膏組(OA + YE)、10%果糖 + 0.2%乙胺丁醇組(10% Fru + 0.2% EMB)這四種造模方法均未能形成持續(xù)穩(wěn)定的高尿酸模型,造?？尚行暂^小。其原因可能是氧嗪酸鉀所誘導(dǎo)的動物體內(nèi)尿酸水平在一日內(nèi)并不穩(wěn)定,且SD 大鼠尾部靜脈采血時(shí)間延時(shí)很長,不能保證在同一時(shí)間點(diǎn)給全部模型組采血,個(gè)體也存在差別,導(dǎo)致尿酸值有較大的差異。給予SD 大鼠氧嗪酸鉀+酵母混合飼料,成功的誘導(dǎo)了大鼠高尿酸血癥合并肝腎損傷模型。 大鼠體內(nèi)存在尿酸酶,所以大鼠高尿酸模型往往存在不穩(wěn)定的問題,氧嗪酸鉀是目前國內(nèi)外最常用的高尿酸血癥造模藥物。 Yukio 等[13]每隔兩小時(shí)連續(xù)腹腔注射給予大鼠250 mg/kg 的氧嗪酸鉀,可明顯提高血中尿酸水平,但是尿酸值隨后很快降低。 有報(bào)道稱果糖可致血尿酸迅速升高,且果糖是目前唯一已知的可增加血尿酸的糖類,乙胺丁醇也可作為抑制尿酸排泄的藥物[14]。 本實(shí)驗(yàn)使用了果糖聯(lián)合乙胺丁醇造模,但是5 周依然沒有成穩(wěn)定的高尿酸模型。 本實(shí)驗(yàn)建立的氧嗪酸鉀聯(lián)合酵母特殊飼料的高尿酸模型,與人類痛風(fēng)臨床現(xiàn)象高度相似,大大提高了模型的穩(wěn)定性以及可重復(fù)性,減少了灌胃、注射等實(shí)驗(yàn)難度,并且能更好的模仿人類高尿酸的發(fā)病過程,且該方法操作簡便,穩(wěn)定,易于操作。

本研究使用氧嗪酸鉀、酵母膏等建立高尿酸血癥動物模型,從生化以及病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)OA PO 混合飼料組尿酸值升高且維持較長時(shí)間,腎、心臟等器官發(fā)生病變,是一種高效、便利的高尿酸血癥聯(lián)合腎損傷的動物模型,極具研究價(jià)值和醫(yī)療用途前景。 據(jù)統(tǒng)計(jì),我國高尿酸患者目前已經(jīng)達(dá)1.2 億,痛風(fēng)患者8000 萬人,且患病人數(shù)逐年增加[15-16]。 目前,國內(nèi)外還沒有有效的治療痛風(fēng)的藥物,動物疾病模型在研究人類致病機(jī)理中起到了關(guān)鍵作用,該模型的建立對高尿酸藥物的預(yù)防及藥物的篩選及開發(fā)有著非常重要的意義。