白 雪，張 斌，汪 瀟，莘曉陶

錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院口腔科(錦州 121001)

口腔鱗癌是常見于口腔頜面部的一種惡性腫瘤，具有侵襲性強、易發(fā)生轉(zhuǎn)移等特點，容易侵襲顱腦、上呼吸道等部位，嚴重影響人們生命健康。口腔鱗癌發(fā)病過程涉及多種癌基因的激活、抑癌基因失活及信號通路的異常改變[1-3]。隨著腫瘤生物學的深入研究，采取靶向性調(diào)控腫瘤細胞的方法，將可能抑制腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移、耐藥，可能為腫瘤臨床治療開辟一種新的干預手段。因此，潛在靶點的選擇，深入研究與腫瘤細胞相關的調(diào)控機制，為靶向治療腫瘤開辟了一條新道路。近年來越來越多研究顯示微小RNA(microRNA,miR)表達異常參與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程[4]。研究顯示，miR-637在膽管癌、膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤中表達異常[5-6]，但其在口腔鱗癌中還未見研究，RING1是Polycomb家族(PCG)蛋白復合物(Polycomb repessive complex 1，PRC1)中主要成員，主要維持已處于阻抑狀態(tài)的染色質(zhì)的穩(wěn)定性，在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[7-8]，經(jīng)miRdb生信網(wǎng)站預測，RING1與miR-637存在靶向關系。因此本研究重點探討miR-637過表達對口腔鱗癌細胞增殖的影響，以及miR-637與RING1的關系，初步研究其發(fā)揮作用的分子機制。

材料與方法

1 實驗材料 人口腔鱗癌細胞株Tca-8113,購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。miR-637 mimic及miR-637 NC購自廈門慧嘉生物科技有限公司。miR-637 mimics序列為5’-UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3’，miR-637 NC序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。RPMI 1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、胰酶購自美國Sigma公司；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(批號DRR041A)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號DRR047A)購自大連寶生物工程有限公司；CCK-8相關試劑購于美國GLPBIO公司；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒購自北京全式金生物公司；鼠抗人增殖細胞核抗原(PCNA)、RING1、GAPDH一抗及二抗(辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG)購自美國Abcam公司；雙熒光素酶報告檢測試劑盒購自美國Promega公司；普通光學顯微鏡購自日本Olympus公司；熒光定量PCR儀、自動酶標儀(Elx800)購自美國Bio-Rad公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)：Tca-8113細胞經(jīng)常規(guī)復蘇后，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合至80%左右時胰酶消化傳代。

2.2 細胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率檢測：選取對數(shù)生長期的Tca-8113細胞，以2×105/孔密度接種于24孔板中，待細胞密度達50%～70%時，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明說進行轉(zhuǎn)染，每組設置6個復孔。試驗分為三組：對照組，含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基;miR-637 NC組，轉(zhuǎn)染空載體;miR-637 mimics組，轉(zhuǎn)染miR-637 mimics。通過倒置熒光顯微鏡觀測轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染后通過400 mg/L的G418篩選穩(wěn)定細胞株，并以400 mg/L的G418維持培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞供后續(xù)使用。

2.3 qRT-PCR檢測miR-637表達情況：收集2.2中各組細胞，利用Trizol試劑盒抽提細胞總RNA，應用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為10 μl(2 μl 5×Reaction mix，1 μl Random primer，0.5 μl逆轉(zhuǎn)錄酶，5 μl RNA樣品)，25 ℃、5 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶活性，用去離子水將cDNA稀釋10倍后-20℃保存。以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增。程序設定為：95 ℃預熱3 min，95 ℃、30 s ，60 ℃、30 s，72 ℃、15 s，上述3步驟35次循環(huán)，72 ℃、5 min終止反應。miR-637以U6為內(nèi)參基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物設計見表1。采用2-ΔΔCt算法計算miR-637相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

2.4 CCK-8法檢測Tac-8113細胞增殖情況：收集2.2中各組細胞，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h，每組設6個復孔，加入10 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)4 h后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光值(OD值),以未接種細胞質(zhì)加培養(yǎng)基孔的OD值為空白對照調(diào)零，并計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=[1-處理組OD值/未處理組OD值]×100%。

2.5 平板克隆法檢測細胞增殖情況：收集2.2中各組細胞,分別用0.25%胰酶消化并吹打成單個細胞,將細胞懸浮在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中備用，將細胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細胞以每皿50、100、200個細胞梯度分別接種在培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)動使細胞均勻分散，置于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見克隆時終止培養(yǎng)，棄上清，加4%多聚甲醛固定15 min，去除固定液，加應用染色液20～30 min，流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。在顯微鏡(低倍鏡)計數(shù)大于10個細胞的克隆數(shù)，計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。

2.6 雙熒光素酶報告基因：收集2.1中對數(shù)期TCA-8113細胞，以2×104/孔密度接種于24孔板中，設置四組，每組6個復孔，24 h后分別轉(zhuǎn)染Neg-miR 637(空載體)+野生型(WT)-RING1，Neg-miR 637(空載體)+突變型(MT)-RING1，miR 637+WT-RING1，miR 637+MT-RING1。24 h后按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書添加螢火蟲和海參熒光素酶試劑上機檢測。每孔的數(shù)值以螢火蟲熒光活性/海參熒光活性顯示，試驗重復3次。

2.7 蛋白免疫印跡法檢測ki67蛋白表達情況：收集2.2中各組細胞，加入RIPA裂解液，冰上靜置，充分裂解后通過蛋白提取試劑盒提取總蛋白。使用BCA蛋白試劑盒測定細胞中總蛋白濃度。用10%SDS-PAGE分離蛋白，半干法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，TBST清洗3次后，在室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗，PCNA(1∶500)、RING1(1∶250)，以GAPDH做為內(nèi)參，24 h后吸取一抗，清洗硝酸纖維素膜后，加入相應二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔1∶2000)37 ℃封閉2 h，洗膜后滴加ECL顯色液，用凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白條帶圖片，用Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍照對蛋白質(zhì)表達量進行定量分析。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染效率檢測 熒光顯微鏡下miR-637 NC組、miR-637 mimics組中細胞轉(zhuǎn)染效率均達90%以上。qRT-PCR顯示，與對照組相比，miR-637 NC組miR-637表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，miR-637 mimics組miR-637表達顯著升高(P<0.05)；與miR-637 NC組相比，miR-637 mimics組miR-637表達顯著升高(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 熒光顯微鏡觀察miR-637 NC組、miR-637 mimics組轉(zhuǎn)染效率(×200)

表2 各組miR-637表達水平比較

2 miR-637過表達對Tac-8113細胞增殖的影響 CCK-8實驗顯示，與對照組相比，miR-637 NC組各時間點OD值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，miR-637 mimics組轉(zhuǎn)染后48、72 、96 h后OD值顯著降低(P<0.05)；與miR-637 NC組相比，miR-637 mimics組轉(zhuǎn)染后48 、72 、96 h后OD值顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組OD值比較

3 平板克隆法 平板克隆法顯示，與對照組相比，miR-637 NC組克隆形成率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，miR-637 mimics組克隆形成率顯著降低(P<0.05)；與miR-637 NC組相比，miR-637 mimics組克隆形成率顯著降低(P<0.05)。見圖2、表4。

表4 各組克隆形成率比較

4 miR-637過表達對增殖相關蛋白表達的影響(抑制增殖) 蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-637 NC組PCNA蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，miR-637 mimics組PCNA蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與miR-637 NC組相比，miR-637 mimics組PCNA蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖3、表5。

A：對照組；B：miR-637 NC組；C：miR-637 mimics組

表5 各組增殖相關蛋白PCNA表達水平比較

5 雙熒光素酶檢測miR-637與RING1關系 雙熒光素酶報告基因檢測顯示共同轉(zhuǎn)染miR-637+WT-RING1后，熒光素酶活性表達受抑制，而轉(zhuǎn)染Neg-miR637+WT-RING1、Neg-miR637+MT-RING1、miR-637+MT-RING1組熒光素酶活性無明顯變化，見圖4。

圖4 雙熒光素酶報告基因分析結(jié)果

6 miR-637過表達對RING1蛋白表達影響 蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-637 NC組RING1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，miR-637 mimics組RING1蛋白顯著降低(P>0.05)；與miR-637 NC組相比，miR-637 mimics組RING1蛋白顯著降低(P>0.05)。見圖5、表6。

A：對照組；B：miR-637 NC組；C：miR-637 mimics組

表6 各組RING1蛋白表達水平比較

討 論

miR-637是近年來新發(fā)現(xiàn)的miRNA[9-10]，Zhang等[11]研究表明miR-637在結(jié)直腸癌中表達顯著下調(diào)，miR-637過表達抑制結(jié)直腸癌細胞增殖。Yi等[12]研究顯示，miR-637在膠質(zhì)瘤中低表達，其異常表達并可參與腫瘤細胞增殖及侵襲等生物學過程。研究顯示，miR-637在卵巢癌中表達顯著下調(diào)，過表達可抑制卵巢癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[13]。但miR-637在口腔鱗癌中報道較少，本研究前期試驗顯示miR-637在口腔鱗癌中低表達，猜測miR-637在口腔鱗癌中可能與其他惡性腫瘤中發(fā)揮相同作用。為此我們選取口腔鱗癌細胞Tac-8113進行轉(zhuǎn)染使miR-637過表達，探討miR-637在Tac-8113發(fā)揮作用。倒置熒光顯微鏡鏡下觀察空載體及miR-637 mimics轉(zhuǎn)染進入細胞內(nèi)的效率高，qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-637 mimics組miR-637表達水平顯著高于miR-637 NC組與對照組，提示轉(zhuǎn)染成功可供后續(xù)使用。CCK8試驗顯示顯示miR-637 mimics組Tac-8113細胞增殖抑制率顯著高于對照組、miR-637 NC組，提示miR-637過表達可降低Tac-8113細胞增殖，此外平板克隆試驗也驗證了這一猜測，但miR-637抑制Tac-8113細胞增殖相關機制尚不清楚。PCNA是DNA 復制所必需的一種聚合酶的附屬蛋白，對細胞由G1期向S期過渡起調(diào)節(jié)作用，其含量的變化與細胞增殖的進程同步，可作為衡量細胞增殖狀態(tài)的客觀指標之一，一般認為，腫瘤分化程度越低，其增殖能力越強，PCNA表達也越高[14-15]。本研究中，口腔鱗癌細胞Tac-8113經(jīng)miR-637 mimics轉(zhuǎn)染后PCNA蛋白水平顯著下調(diào)，提示miR-637可能在Tac-8113細胞中發(fā)揮抑癌基因作用。

經(jīng)生物信息學軟件miRdb預測，RING1是miR-637的候選靶基因，PCG基因是進化中較為保守的轉(zhuǎn)錄抑制因子，通過形成蛋白復合物PRC1、PRC2發(fā)揮沉默靶向基因的作用，RING1是PRC2中的主要成員[16]，研究表明，RING1在乳腺癌中高表達，發(fā)揮癌基因作用[17]。本研究雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)顯示，通過轉(zhuǎn)染miR-637 mimics與WT-RING1后，雙熒光素酶活性明顯抑制，提示miR-637對Tac-8113細胞中RING1基因發(fā)揮抑制作用。此外WB結(jié)果顯示，miR-637 mimics組RING1蛋白表達顯著低于miR-637 NC組與對照組，進一步驗證了二者的靶向關系。猜測miR-637可能通過靶向RING1表達參口腔鱗癌Tac-8113細胞增殖過程，miR-637可能成為治療口腔鱗癌的潛在靶點，但其內(nèi)在分子機制尚不明確，有待進一步研究。

綜上所述，miR-637可能通過下調(diào)RING1表達抑制口腔鱗癌Tac-8113細胞增殖，可為口腔鱗癌分子診斷及靶向治療提供理論基礎。但本研究也存在一定不足，miR-637調(diào)控RING1相關通路有待進一步研究。