王巖松，賀明睿，王冬妍，姜鑫，羅景陽，袁帥

（1.沈陽市食品藥品檢驗所，遼寧 沈陽 110124；2.沈陽化工大學，遼寧 沈陽 110142；3.遼寧省藥品檢驗檢測院,遼寧 沈陽 110036）

溶膠-凝膠分子印跡技術(shù)是采用溶膠-凝膠法將模板分子引入無機網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中制備分子印跡聚合物（Molecular Imprinted Polymer，MIP）的一項技術(shù)，是溶膠-凝膠法和分子印跡技術(shù)的結(jié)合體[1-3]。模板分子在聚合物基體中以共價鍵，非共價鍵，氫鍵等形成具有“記憶”功能的識別位點。模板分子脫離聚合物后留下與其結(jié)構(gòu)相匹配的立體空腔，通過立體空腔與識別位點對模板分子表現(xiàn)出特異的識別性[4-5]。目前分子印跡聚合物已廣泛應(yīng)用于分離技術(shù)、傳感技術(shù)、環(huán)境檢測、食品檢測等領(lǐng)域，展現(xiàn)了良好的性能和應(yīng)用前景[6-7]。

烯肟菌胺作為模板分子，均勻的鑲嵌在鈦酸丁酯的聚合物中，依靠烯肟菌胺分子構(gòu)型和物理吸附在聚合物中形成與之相匹配立體空間結(jié)構(gòu)，通過索氏提取洗脫模板分子后，保留具有特異吸附性能的空腔，空腔的比例和識別位點的分布直接影響著印跡聚合物的吸附性和特異性。優(yōu)化模板分子與功能單體的比例，聚合過程中酸的加入量，溫度的控制等實現(xiàn)烯肟菌胺分子印跡聚合物的最佳吸附性能。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

串聯(lián)質(zhì)譜儀（API 4000，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；液相色譜儀（LC 20A，日本島津公司）；電子天平（BS244S，賽多利斯科學儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱（101-2，余姚市遠東數(shù)控儀器廠）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，鞏義市英峪予華儀器制造廠）；臺式離心機（800-1，金壇區(qū)西城區(qū)新瑞儀器廠）；恒溫水浴振蕩器（SHA-B，國華企業(yè)）；電子萬用爐（DL-1，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司）。

烯肟菌胺（質(zhì)量分數(shù)98%，沈陽化工研究院）；氟嗎啉（質(zhì)量分數(shù)95%，沈陽化工研究院）；烯酰嗎啉（質(zhì)量分數(shù)98%，德國的Sigma公司）；無水乙醇（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；鈦酸丁酯（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）；鹽酸（分析純，國藥有限公司）；冰乙酸（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher公司）。

1.2 MIP的制備

準確稱取0.382 4 g烯肟菌胺于250 mL三角瓶中，加入60 mL無水乙醇攪拌至完全溶解。逐滴加入一定量的鈦酸丁酯，充分混勻后緩慢加入一定體積的鹽酸（1 mol·L-1），再加入1 mL 去離子水，在一定溫度的水浴中攪拌5 h得到透明溶膠。取出三角瓶置于40℃烘箱中保溫48 h形成凝膠，升高溫度至60℃干燥24 h，充分研磨后置于索氏提取器中，60 mL無水乙醇-乙酸（體積比為8∶2）提取6 h，反復(fù)多次用甲醇-水（體積比為1∶1）超聲洗脫至洗脫液為中性后用甲醇洗脫，LC-MS/MS檢測不到烯肟菌胺分子為止，將聚合物置于60℃烘箱中烘干后得到烯肟菌胺分子印跡聚合物，置于干燥器中備用。

非分子印跡聚合物（NIP）的制備步驟除不添加烯肟菌胺，與MIP 制備方法一致。

1.3 MIP的性能表征

1.3.1 LC-MS/MS檢測的條件

Symmetry C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,3.5 μm)；流動相A為水，B為甲醇，分別添加質(zhì)量分數(shù)為0.1%的甲酸；線性梯度洗脫程序：0～1 min為10%B，1～5 min由10%B變?yōu)?5%B，5～7 min由80%B變?yōu)?5%B，7～7.5 min由95%B變?yōu)?0%B，7.5～10 min 保持10%B。流速：0.3 mL·min-1。柱溫：35℃。進樣體積10 μL。

電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI)，正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)；電噴霧電壓(ionspray voltage IS)：5 500 V；霧化氣壓力：65 psi (448.16 kPa)；氣簾氣壓力：15 psi（103.42 kPa）；輔助氣壓力：65 psi（448.16 kPa）；離子源溫度：550℃；定性離子對、定量離子對、碰撞氣能量(collision energy，CE)及去簇電壓(declustering potential,DP)見表1。

表1 烯肟菌胺、氟嗎啉和烯酰嗎啉的質(zhì)譜參數(shù)

1.3.2 吸附動力學實驗

準確稱取20 mg MIP和NIP各7份，分別置于10 mL塑料離心管中，加入5 mL烯肟菌胺水溶液（10 mg·L-1）30℃恒溫水浴震蕩，不同時間間隔同時取出MIP和NIP各1份，離心后取上清液100 μL置于100 mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，取1 mL溶液過0.22濾膜，供LC-MS/MS測定。10、20、30、40、50、60、80 min吸附量Q與吸附時間t作圖，繪制吸附動力學曲線。吸附量計算見式（1）。

式中：Q—吸附量，μg·g-1；

V—烯肟菌胺標準溶液的體積，mL；

C0—烯肟菌胺的初始質(zhì)量濃度，ng·mL-1；

C1—吸附后烯肟菌胺的質(zhì)量濃度，ng·mL-1；

W—聚合物的質(zhì)量，mg。

1.3.3 靜態(tài)平衡吸附實驗

準確稱取20 mg MIP和NIP各6份，置于10 mL塑料離心管中，分別加入2、4、6、8、10和12 μg·mL-1的烯肟菌胺標準溶液5 mL，在30℃下恒溫震蕩60 min后離心，取上清液100 μL置于100 mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，取1 mL溶液過0.22濾膜，供LC-MS/MS測定。吸附量Q與烯肟菌胺濃度C作圖，繪制等溫吸附曲線。

1.3.4 MIP選擇性吸附實驗

取20 mg MIP各3份置于10 mL塑料離心管中，分別加入5 mL質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的烯肟菌胺、氟嗎啉和烯酰嗎啉水溶液，恒溫震蕩一定時間，供LC-MS/MS測定。比較MIP 對3種化合物的吸附性能。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同制備條件對MIP吸附性能的影響

2.1.1 印跡分子與交聯(lián)劑的摩爾比對MIP吸附量的影響

通過改變烯肟菌胺與鈦酸丁酯的摩爾比，考察其成膠效果和對MIP吸附性能的影響，制備過程中其他條件保持不變。

比較了烯肟菌胺與鈦酸丁酯摩爾比為1∶10、1∶15、1∶20時，隨著鈦酸丁酯的量的增大成膠時間縮短，在摩爾比為1∶20時，膠體渾濁并出現(xiàn)乳白色懸浮顆粒。準確稱取不同摩爾比的MIP各20 mg，置于10 mL質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的烯肟菌胺水溶液中，室溫下震蕩吸附60 min，之后離心，上清液供LC-MS/MS測定。計算吸附量Q，分別為375、1 110和720 μg·g-1。推測在鈦酸丁酯比例較低時，模板分子在聚合物中沒有形成獨立的空腔，特異識別位點較少，導(dǎo)致吸附性能較差。隨著鈦酸丁酯比例的增加，模板分子在聚合物中均勻的分散，形成完整獨立的空腔和與模板分子相匹配的識別位點，因此吸附性能較強。但是隨著鈦酸丁酯比例的繼續(xù)增加，模板分子在聚合物中形成空腔和識別位點的數(shù)量相對下降，同時部分模板分子被包裹在聚合物中無法脫離，導(dǎo)致MIP的吸附性能下降。因此實驗選擇烯肟菌胺與鈦酸丁酯的摩爾比為1∶15。

2.1.2 酸的用量對MIP吸附量的影響

在聚合反應(yīng)中，不改變其他聚合反應(yīng)條件的同時，嘗試不同酸的加入量考察對MIP吸附量的影響。

在5組聚合反應(yīng)中分別加入濃度為1 mol·L-1的鹽酸0.5、1.2、1.5、1.7、2.5 mL，鹽酸的加入量為0.5和2.5 mL時，溶液未形成膠體狀態(tài)，加入量為1.2、1.5和1.7 mL時，形成了透明的膠體，隨著酸加入量的增加，成膠速度加快。當酸的加入量為1.5 mL時，MIP的吸附量最大為1 170 μg·g-1，減少和加大鹽酸的加入量，吸附量都會相應(yīng)地下降。因為鈦酸丁酯帶有電負性，少量H離子存在中和了電負性，提高分子間碰撞的概率，催化聚合反應(yīng)。但是過量的H離子的存在，使得聚合反應(yīng)過快，在短時間形成了較大的膠粒，模板分子被完全封鎖在聚合物中間無法洗脫出來，降低了MIP應(yīng)有的特異吸附性。因此綜合以上實驗，選擇酸的加入量為1.5 mL。

2.1.3 反應(yīng)溫度對MIP吸附量的影響

溫度是聚合反應(yīng)速率的重要因素，實驗比較了35、40、45、50℃條件下對聚合反應(yīng)的影響。在35℃聚合時，10 h 未形成膠體。在40和45℃聚合時，分別在5和4.5 h形成無色透明溶膠狀態(tài)，在50℃時3后溶液出現(xiàn)黏稠狀，很快出現(xiàn)白色懸浮顆粒。對40和45℃制備的MIP進行了吸附量的測定，45℃制備的MIP吸附量1 170 μg·g-1略高于40℃制備的MIP吸附量1 085 μg·g-1，因此實驗選擇聚合反應(yīng)溫度為45℃。

2.2 MIP吸附性能實驗

2.2.1 吸附動力學實驗

聚合物的吸附動力學實驗是為了考察吸附量隨著吸附時間的增加的變化情況，MIP和NIP吸附量隨著吸附時間的變化曲線見圖1。如圖所示，在30 min內(nèi)MIP吸附量迅速增大，30到60 min加大緩慢，60到80 min處于平衡狀態(tài)，NIP 在20 min后趨于平衡，在吸附曲線平衡階段MIP的吸附量明顯高于NIP。因為吸附開始階段，溶液中模板分子濃度較大與聚合物接觸頻率較大，模板分子迅速與聚合物表面形成物理吸附，NIP 在20 min附近達到了飽和吸附；30 min前MIP在表面吸附同時模板分子進入“記憶”空腔，隨著空腔和識別位點被占據(jù)增大了模板分子進入深層次空腔的阻力，吸附速率下降。在超聲震蕩的作用下，60 min后MIP達到了飽和吸附。

圖1 MIP和NIP對烯肟菌胺的吸附動力學曲線

2.2.2 靜態(tài)吸附實驗

采用靜態(tài)吸附法，考察在一定的條件下MIP和NIP對不同濃度的烯肟菌胺的吸附量。根據(jù)不同濃度下吸附量的變化，以不同溶液中烯肟菌胺濃度為橫坐標，吸附量Q為縱坐標，作MIP和NIP的等溫吸附曲線，吸附時間為60 min，見圖2。

圖2 聚合物的靜態(tài)吸附曲線

如圖2所示，MIP和NIP都表現(xiàn)出隨著吸附烯肟菌胺濃度的升高吸附量變大的趨勢，NIP的吸附曲線比較平穩(wěn)，MIP曲線在4到8 μg·mL-1出現(xiàn)了突越，MIP結(jié)構(gòu)中印跡空腔和識別位點與烯肟菌胺濃度相匹配，烯肟菌胺分子在MIP中迅速占位，在質(zhì)量濃度達到10 μg·mL-1時吸附行為達到終點，最大吸附量為1 170 μg·g-1。NIP依靠自身的縫隙和疏松的結(jié)構(gòu)也存在一定的吸附行為，飽和吸附量為520 μg·g-1。

2.2.3 MIP選擇性的考察

在相同的實驗條件下，比較了MIP對烯肟菌胺、氟嗎啉和烯酰嗎啉的吸附能力，實驗結(jié)果MIP對烯肟菌胺的吸附量明顯高于氟嗎啉和烯酰嗎啉，為1 170 μg·g-1。對氟嗎啉和烯酰嗎啉的吸附量分別為545和560 μg·g-1，略高于NIP。氟嗎啉和烯酰嗎啉的結(jié)構(gòu)比較相近，吸附量也變化不大，再次證明MIP結(jié)構(gòu)中形成的記憶空腔和識別位點只與烯肟菌胺分子相匹配，與氟嗎啉和烯酰嗎啉的分子結(jié)構(gòu)不具有識別功能。

3 結(jié) 論

以烯肟菌胺為模板分子，采用溶膠-凝膠法制備了分子印跡聚合物，摸索出事宜的制備條件，通過吸附性能實驗證明了MIP具有較強的吸附性，能夠選擇性吸附烯肟菌胺分子。實驗將利用MIP的特異選擇性吸附應(yīng)用食品中烯肟菌胺殘留的固相萃取。