燕 燕，崔銘昊，徐蘇云

（1.平湖市農(nóng)業(yè)生態(tài)能源站，浙江 平湖 314200；2.上海理工大學(xué)環(huán)境與建筑學(xué)院，上海 200093）

1 引言

蘆筍屬于百合科天門冬屬，為多年生宿根植物，別名為龍須菜、石刁柏等。蘆筍莖可以分為鱗芽、地上莖和地下根狀莖3 個部分，其鱗芽嫩莖生長到一定高度時可采摘作為蔬菜食用［1］。蘆筍的食用部分為嫩莖，約占莖總長度的1/2～2/3，剩余的木質(zhì)化部分，即老莖則成為收割時的廢棄物［2］；纖維素、半纖維素和木質(zhì)素占蘆筍秸稈總量的50%以上［3］。利用秸稈類有機固廢發(fā)酵生產(chǎn)腐植酸（Humic acid），既可減少環(huán)境污染，又可得到高附加值的生化黃腐酸產(chǎn)品，從而提高秸稈的資源化利用率［4］。

腐植酸是生物有機質(zhì)在微生物的分解轉(zhuǎn)化下，經(jīng)過長期的反應(yīng)和積累而得到的一類結(jié)構(gòu)功能十分復(fù)雜的混合物［2］。可按不同溶解性將其進行分類，其中黃腐酸（Fulvic acid，又稱富里酸） 是最具活性的一種成分，分子量小、滲透能力強、易被生物吸收利用［4-5］。黃腐酸應(yīng)用于農(nóng)業(yè)種植，能改良土壤、增強肥效、增加產(chǎn)量、提高作物抗病力和改善果實品質(zhì)［6］。微生物發(fā)酵生產(chǎn)生化黃腐酸工藝以固體發(fā)酵和液體發(fā)酵為主，固體發(fā)酵后需采用NaOH 等堿液浸出發(fā)酵產(chǎn)物中的腐植酸，液體發(fā)酵產(chǎn)物可就近作為液體肥料直接施入土壤［4］。比較而言，液體發(fā)酵更易實現(xiàn)連續(xù)化運行和工藝參數(shù)調(diào)控，有望縮短發(fā)酵周期。

多種微生物具有降解纖維素和半纖維素的能力，如假單胞菌屬（Pseudomonas）、色桿菌屬（Chrom obacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、纖維弧菌屬（Cellibrio） 中的一些細菌，以及木霉（Trichoderma）、青霉（Penicllium） 等多種真菌［7］。李艷［8］研究指出，有機物料與微生物是腐殖質(zhì)形成的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，不同微生物對不同有機物料的利用程度直接關(guān)系到腐殖化的效果及腐殖質(zhì)組分的組成與結(jié)構(gòu)，如木質(zhì)素等通過分解和氧化產(chǎn)生的醌型化合物、蛋白質(zhì)產(chǎn)生的氨基酸均為構(gòu)成腐殖質(zhì)的主要前體物質(zhì)，微生物對葡萄糖的腐殖化是合成過程，對纖維素的腐殖化則經(jīng)歷了降解再合成階段。真菌可能在細胞內(nèi)形成醌或其他芳香族化合物，在分泌到體外以及細胞自溶時很容易縮合-聚合成腐殖質(zhì)；鏈霉菌中的灰褐鏈霉菌、球孢鏈霉菌分別能夠促進黃腐酸、腐植酸的形成［7］。

以減量化為目標(biāo)的生物處理，大多關(guān)注秸稈水解過程中基質(zhì)的消耗速率，而對水解過程中腐殖質(zhì)類物質(zhì)的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化研究較少。劉陶［6］研究表明，發(fā)酵菌種類別及接種量、氮源及其添加量等均會影響液體發(fā)酵黃腐酸產(chǎn)量。發(fā)酵溫度是影響水解發(fā)酵進程的一項重要參數(shù)，陳廣銀等［9］研究指出，提高溫度對秸稈纖維素與木質(zhì)素的水解溶出有利。實際上，溫度對發(fā)酵產(chǎn)物的腐殖化轉(zhuǎn)化也將產(chǎn)生重要影響，高溫條件下可分解利用水解產(chǎn)物的微生物活性可能提高，造成試驗后期水解產(chǎn)物的大量損失，導(dǎo)致腐殖質(zhì)前體物質(zhì)濃度降低、減少腐植酸產(chǎn)量，因而有必要針對不同基質(zhì)種類的腐殖化過程進行溫度條件優(yōu)化。目前相關(guān)研究多基于固態(tài)發(fā)酵或堆肥過程中腐殖化進程開展，而關(guān)于水解發(fā)酵過程中腐殖化轉(zhuǎn)化的影響機制的報道較少。因此本研究以蘆筍秸稈為底物，對比了不同發(fā)酵溫度對蘆筍秸稈水解效率以及腐殖化過程的影響，以期提高黃腐酸的產(chǎn)率。

2 材料和方法

2.1 原材料和接種物

以浙江平湖某農(nóng)場的蘆筍老莖為研究對象。蘆筍老莖含水量為91.1%，揮發(fā)性固體（VS） 與總固體（TS） 的比值為94.4%，干固體纖維素含量為27.1%。水解菌劑購自湖北啟明生物工程有限公司（有機肥料腐熟劑），混合菌劑包括芽孢桿菌（Bacillus subtillis，＞90%）、放線菌、酵母菌和絲狀真菌，1 g 菌劑中約含有活菌5×1010個，以CMC-Na 液體培養(yǎng)基測試該菌劑的纖維素酶活性為43.02 U/g，表明該菌劑具有較高的纖維素水解能力。蘆筍秸稈理化性質(zhì)見表1。

表1 蘆筍秸稈理化性質(zhì)

2.2 試驗設(shè)置

研究以1 L 錐形瓶作為水解發(fā)酵裝置，每組投加300 g 蘆筍老莖（顆粒粒徑＜1 cm）、300 mL 去離子水，按蘆筍老莖質(zhì)量比0.3%接種菌劑，各添加1%尿素作為氮源補充，共設(shè)置4 個溫度處理組：25、35、45、55 ℃。每組設(shè)置兩個平行試驗，水解發(fā)酵持續(xù)16 d。試驗過程中，每2 d 取10 mL 的混合物樣品，將混合物樣品以10 000 r/min 離心6 min，然后用0.45 μm 過濾器過濾后儲存上清液待測。

2.3 分析方法

所采集的液體樣品的溶解態(tài)總有機碳（TOC）濃度，采用TOC 分析儀（Jena/3100） 檢測；揮發(fā)性有機酸（VFAs） 濃度采用氣相色譜（Agilent GC7890B，安捷倫科技有限公司，美國） 測定；蛋白質(zhì)濃度采用考馬斯亮藍G-250 分光光度法測定；多糖濃度采用苯酚硫酸分光光度法測定；黃腐酸濃度采用容量滴定法測量［10］。在水解前后分別取固體樣品測定TS 和纖維素含量，并計算得到總固體降解率和纖維素降解率，固體TS 和VS 采用重量法分析，纖維素含量采用重鉻酸鉀氧化法測定。纖維素降解率計算公式如下：

式中：R 代表蘆筍秸稈的纖維素降解率，%；c0和c1分別代表水解前后的纖維素含量，mg/g；TS0和TS1分別代表蘆筍秸稈水解前后的含固率，%。

水解液中溶解性有機物組分采用三維熒光光譜儀（3D-EEM，日本日立F-7000FL） 表征，將熒光數(shù)據(jù)進行處理計算得到腐殖化指數(shù)（HIX） 和熒光指數(shù)（FI）［11］，計算方式如下：

式中：Ex 表示激發(fā)波長，nm；Em 表示發(fā)射波長，nm。

3 結(jié)果和討論

3.1 固體分解效率

圖1 所示為各試驗組的TS 和纖維素降解率。經(jīng)過16 d 的水解，各試驗組的TS 降解率依次為：49.5%（35℃） ＜51.4%（25 ℃） ＜55.4%（45 ℃） ＜59.2%（55 ℃）。試驗結(jié)果表明當(dāng)水解溫度為55 ℃時，水解系統(tǒng)對TS 具有較高的去除率，比35 ℃組的TS 降解率高出9.7 個百分點，比25℃組高出7.8 個百分點。水解結(jié)束時，各試驗組纖維素降解率依次為19.6% （25 ℃） ＜22.1% （35 ℃） ＜25.6%（45 ℃） ＜32.1%（55 ℃），表明纖維素降解率與溫度呈正相關(guān)。接種菌劑以枯草芽孢桿菌為主，說明該菌種對高溫條件耐受能力較好，其分泌的纖維素酶活性能在55 ℃條件下實現(xiàn)更高的纖維素分解效率［5，10］。纖維素降解率高于TS 降解率，可能是由基質(zhì)的有機物結(jié)構(gòu)和菌種微生物種類造成的，蘆筍秸稈隨收割時間延后而逐漸木質(zhì)化，水解環(huán)境下木質(zhì)素的降解相對纖維素要困難［4］；研究表明，真菌和放線菌對木質(zhì)素的降解效果更佳［7］，本研究采用的水解發(fā)酵菌劑主要為枯草芽孢桿菌，對木質(zhì)素的降解能力有限，從而限制了整體干固體物質(zhì)的降解效率。

圖1 不同水解溫度條件下秸稈TS 降解率和纖維素降解率變化趨勢

3.2 水解過程中黃腐酸濃度變化

水解發(fā)酵過程中黃腐酸濃度變化如圖2 所示。

圖2 水解發(fā)酵過程中黃腐酸濃度變化

水解液中黃腐酸的濃度隨發(fā)酵時間的延長而增加，高溫條件下黃腐酸濃度趨于穩(wěn)定的速度更快且最終黃腐酸產(chǎn)量水平更高。在發(fā)酵13 d 以后，45 ℃和55 ℃試驗組的黃腐酸產(chǎn)量增速放緩并逐漸趨于穩(wěn)定，45 ℃試驗組黃腐酸產(chǎn)量從6 034 mg/L（13 d） 增加至6 335 mg/L（16 d），增幅為5.0%；55 ℃試驗組黃腐酸產(chǎn)量從7 210 mg/L（13 d） 增加至7 320 mg/L（16d），增幅僅為1.5%。而溫度為25℃和35 ℃的兩個試驗組黃腐酸濃度在水解中后期仍逐步升高。經(jīng)過16 d 發(fā)酵后得到的黃腐酸濃度分別為4 498 mg/L（25 ℃）＜4 792 mg/L（35 ℃）＜6 335 mg/L（45 ℃）＜7 320 mg/L（55 ℃），說明中高溫條件更有利于黃腐酸的合成。

3.3 水解液中有機物濃度變化

蘆筍秸稈水解過程中，水解液中各有機物成分的濃度變化如圖3 所示。水解初期，水溶性TOC 含量隨溫度升高而增大，第2 天的TOC 濃度較初始值分別增加了9.7%、21.9%、22.9%、33.3%，這可能是由于高溫條件具有更好的TOC 增溶效果，這與前人的研究結(jié)果一致［12-13］。45 ℃和55 ℃的兩個試驗組在水解第2 天的多糖濃度增幅明顯，比初始值分別增加了27.9%、29.9%；而35℃和25℃兩個試驗組在相同時間點的多糖含量并未出現(xiàn)明顯上浮，而是逐漸下降。第2～13天，TOC 和蛋白質(zhì)、多糖都隨反應(yīng)進行而逐漸下降， 55 ℃試驗組蛋白質(zhì)和多糖的下降速率更快，與此同時黃腐酸濃度的同期增幅更高，說明多糖的初期增溶可能對黃腐酸合成起到促進作用。在水解的中后期階段，55 ℃試驗組呈現(xiàn)出較高的多糖和蛋白質(zhì)去除率，這也與水溶性TOC 的結(jié)果相對應(yīng)。

蘆筍秸稈發(fā)酵初期，因大量水溶性有機質(zhì)的釋放，代謝中間產(chǎn)物的小分子有機酸（以丙酸、丁酸、戊酸為主） 迅速生成并在體系積累，如圖3所示，VFAs 濃度與TOC 同步大幅升高；而后，由于試驗研究采用了非封閉兼氧體系，接種物中需氧微生物可進一步將VFAs 轉(zhuǎn)化為CO2，或利用VFAs 與其他中間產(chǎn)物發(fā)生生物聚合，因此隨著發(fā)酵的進行，VFAs 濃度逐漸下降。45 ℃和55 ℃試驗組的VFAs 濃度峰值出現(xiàn)在水解第2 天，而25 ℃和35 ℃兩個試驗組的VFAs 濃度峰值稍有滯后，出現(xiàn)在第4 天；試驗結(jié)束時，55 ℃試驗組的VFAs水平最低（約為2 380 mg/L）。若體系嚴(yán)重酸化，會對微生物活性造成負(fù)面影響，進而抑制水解發(fā)酵的進程［7］。丁杰等［14］指出，有機質(zhì)在微生物的作用下分解為小分子的碳水化合物（包括小分子有機酸），其經(jīng)過微生物的生化循環(huán)途徑形成酚、醌類物質(zhì)，這些物質(zhì)是合成腐殖質(zhì)類物質(zhì)的前體，因此有機酸產(chǎn)生的同時會加快腐殖質(zhì)代謝速率，使二者處于動態(tài)平衡狀態(tài)，對腐殖化具有促進作用。本試驗結(jié)果表明，提高水解溫度可以縮短產(chǎn)酸時間、減少體系的酸積累，有利于水解發(fā)酵體系的穩(wěn)定以及后期的腐殖化進程。

3.4 水解過程的腐殖化程度變化

圖4 為三維熒光圖譜處理計算所得水解液中3D-EEM 各區(qū)域熒光強度變化趨勢。圖4 中的I、II 和III 區(qū)為類蛋白物質(zhì)的主要熒光峰，其熒光強度均隨著水解發(fā)酵的進行而降低；Ⅳ區(qū)（Ex 為310～360 nm，Em 為370～450 nm） 為FA 熒光峰，各試驗組IV 區(qū)熒光強度隨發(fā)酵時間延長而增加，說明類腐殖質(zhì)類物質(zhì)開始逐漸出現(xiàn)。

圖4 水解液中3D-EEM 各區(qū)域熒光強度變化趨勢

HIX 指數(shù)代表HA/FA 比值，通常HIX 指數(shù)越高代表腐殖化程度越高［15］，常應(yīng)用在好氧堆肥過程中評價堆肥腐殖化水平，反映堆肥腐殖質(zhì)組分性質(zhì)的變化［16］。由圖5 可知，在水解結(jié)束時各試驗組HIX 指數(shù)達到最大，分別為0.54（25 ℃） ＜0.61（35 ℃） ＜1.05（45 ℃） ＜1.47（55 ℃）。溫度為55 ℃時，水解中期HIX 指數(shù)提升最快，在水解的第8 天達到1.23 并趨于穩(wěn)定；而45 ℃的試驗組在第13 天趨于穩(wěn)定。中溫兩組HIX 指數(shù)較低，與黃腐酸濃度的變化相對應(yīng)。

FI 指數(shù)用于表征熒光DOM 中腐殖成分的來源。當(dāng)FI＞1.9 時，主要為水溶性和自身微生物源，自發(fā)源特征較為明顯；當(dāng)FI＜1.3 時，主要來源于土地和土壤輸入，自生貢獻較少［17］。由圖5可知，4 個試驗組的FI 指數(shù)在水解中期均大于1.9，說明各組熒光DOM 的來源均來自微生物的活動，其中，溫度為55 ℃的試驗組的FI 指數(shù)在3 左右，表明高溫條件下熒光DOM 的自生來源特性更加強烈，這可能是源于更高的微生物活性［17］。

圖5 水解液中HIX 指數(shù)、FI 指數(shù)變化趨勢

李艷［8］研究表明，枯草芽孢桿菌處理的纖維素H/C、（O+S）/C 及（N+O）/C 比值相對基質(zhì)纖維素的比值降低，說明產(chǎn)物的分子縮合度增大、結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，即枯草芽孢桿菌降解纖維素后還能繼續(xù)合成大分子復(fù)雜有機物。曹云等［18］研究表明，超高溫預(yù)處理可促進大分子有機物降解為可溶性有機碳，促進了木質(zhì)纖維素組分降解溶出、更多的多酚產(chǎn)出，同時增加了腐殖質(zhì)前體還原糖、氨基酸的含量，從而有利于腐殖質(zhì)的生成。綜合圖2～5 所反映的水解液組分變化，可得出：高溫條件有利于纖維素等組分的水解，在水解初期增加了腐殖質(zhì)前體多糖、蛋白質(zhì)等成分的釋放，從而有效促進腐殖化進程。

4 結(jié)論

1） 水解溫度的升高有利于有機物大分子水解溶出，經(jīng)過16 d 水解后，55 ℃水解系統(tǒng)得到更高的TS 和纖維素去除率，分別為59.2%和32.1%；

2） 55 ℃試驗組在水解初期有較高的TOC 和多糖溶出，促進黃腐酸和其他腐殖質(zhì)類物質(zhì)的合成，從而加快水解系統(tǒng)的穩(wěn)定化進程、縮短反應(yīng)周期。