李若涵，佘文婷，華 超，駱 瑜，黃 麗，彭友儉

外傷、腫瘤、炎癥等可能會(huì)導(dǎo)致大面積的骨組織缺損，為臨床修復(fù)帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)，缺損的組織修復(fù)成為了亟待解決的難題[1]。目前臨床常用的傳統(tǒng)骨修復(fù)方法效果通常不甚理想，常規(guī)治療后仍有5%～10%的患者骨缺損不能正常愈合[2]。近年來(lái)，干細(xì)胞移植和生長(zhǎng)因子改性的骨修復(fù)材料的出現(xiàn)在極大程度上解決了骨組織再生效果不良的問(wèn)題。但骨修復(fù)材料的研究與應(yīng)用目前尚處于起步階段，仍需要開(kāi)展大量相關(guān)的基礎(chǔ)研究，為生物材料的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor, HGF)作為能刺激肝細(xì)胞增殖的物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，是一種來(lái)源于間葉組織的細(xì)胞外信號(hào)分子，由間充質(zhì)細(xì)胞分泌，參與上皮-間充質(zhì)相互作用[3]。HGF具有強(qiáng)大的促有絲分裂效應(yīng)，通過(guò)自分泌和旁分泌作用促進(jìn)肝臟、心臟和肌肉的營(yíng)養(yǎng)吸收和利用，并促進(jìn)組織修復(fù)[4-6]。骨的愈合過(guò)程(包括血管形成、炎癥抑制和間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入等)由細(xì)胞外信號(hào)分子介導(dǎo)[7]。血小板衍生生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等多種細(xì)胞外信號(hào)分子均可以促進(jìn)骨折愈合和骨再生[8]。然而，HGF在骨組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用尚未探明。因此，本研究擬通過(guò)在小鼠成骨細(xì)胞前體細(xì)胞系(MC3T3-E1)中外源加入HGF以探索HGF對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖、凋亡以及成骨分化和礦化能力的影響，旨在為HGF在骨組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)，并為新型骨生物材料的研發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

CO2培養(yǎng)箱(Thermo,美國(guó))；離心機(jī)(Eppendorf,德國(guó))；PCR儀(Biorad,美國(guó))；HGF(Peprotech，美國(guó))；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8, CCK-8)(Dojindo,日本)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天，上海)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，RT-PCR試劑盒(Takara，日本)；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runt-related transcription factor 2，Runx2)、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(osterix，OSX)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH)抗體(ABCAM，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，2 d換液，3～4 d傳代，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè) 將MC3T3-E1細(xì)胞分為3組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入生理鹽水，其他兩組加入HGF溶液至終濃度分別為10 ng/mL、25 ng/mL。培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后在避光處加入配制好的CCK-8液，37 ℃孵育2 h，450 nm檢測(cè)其OD值。

1.2.3 TUNEL法檢測(cè) 細(xì)胞分組及處理如上。培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，加入0.3% Triton X-100的PBS,室溫孵育5 min。加入50 μL TUNEL檢測(cè)液，37 ℃避光孵育60 min。用抗熒光淬滅液封片，在熒光顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取5個(gè)視野，以凋亡細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值作為細(xì)胞的凋亡率。

1.2.4 堿性磷酸酶(ALP)和茜素紅染色 將MC3T3-E1細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(HGF：25 ng/mL)，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10 nmol/L地塞米松、0.2 mmol/L維生素C)培養(yǎng)7 d后，按照說(shuō)明進(jìn)行ALP染色；成骨誘導(dǎo)14 d后，4%多聚甲醛固定1 h,現(xiàn)配的1%茜素紅染液孵育30 min，自然干燥，觀察拍照。

1.2.5 PCR檢測(cè) 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)7 d后，Trizol法提取總RNA。按照說(shuō)明書將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為：42 ℃，15 min，共3個(gè)循環(huán)，85 ℃，5 s。應(yīng)用RT-PCR試劑盒檢測(cè)成骨相關(guān)基因的mRNA水平，包括ALP、Runx2、OCN、OSX，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性：95 ℃，2 min；PCR反應(yīng)：95 ℃變性15 s，60 ℃退火+延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)；繪制熔解曲線：95 ℃，5 s。以GAPDH為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)目的基因的引物序列

1.2.6 Western Blot檢測(cè) 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)7 d后，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，離心后收集上清液。利用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，并將相同量的蛋白加入PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，濕轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫?fù)u床孵育2 h，底物化學(xué)發(fā)光ECL顯色，凝膠成像儀曝光后進(jìn)行圖像分析。采用GAPDH作為內(nèi)參，檢測(cè)ALP、Runx2、OCN、OSX的表達(dá)情況，每組重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 HGF對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖能力的影響

培養(yǎng)24 h時(shí)，10 ng/mL和25 ng/mL的HGF組與對(duì)照組的OD值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。培養(yǎng)48 h時(shí)，高濃度組的OD值較對(duì)照組明顯升高，提示細(xì)胞增殖能力的增強(qiáng)。培養(yǎng)72 h時(shí)，10 ng/mL組與25 ng/mL組的OD值與對(duì)照組比較差異具有顯著性(P<0.05)，說(shuō)明10 ng/mL和25 ng/mL的HGF均明顯促進(jìn)了成骨細(xì)胞的增殖(表2)。

表2 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性的影響(OD值)

2.2 HGF對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響

培養(yǎng)24 h和48 h時(shí)，10 ng/mL組細(xì)胞的凋亡率與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而在72 h時(shí)，10 ng/mL組明顯低于對(duì)照組(7.67%vs. 10.05%，P<0.05)。25 ng/mL組細(xì)胞的凋亡率在24 h、48 h及72 h均低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表3 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 HGF對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞礦化能力的影響

在對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)7 d后，ALP染色可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)呈紫色，實(shí)驗(yàn)組的染色明顯深于對(duì)照組。細(xì)胞成骨誘導(dǎo)14 d后，茜素紅染色顯示紅色鈣結(jié)節(jié)形成，實(shí)驗(yàn)組鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量與顏色均高于對(duì)照組(圖1)。

A、C：對(duì)照組ALP和茜素紅染色結(jié)果；B、D：實(shí)驗(yàn)組ALP和茜素紅染色結(jié)果

2.4 HGF對(duì)成骨相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

相較于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中成骨相關(guān)因子ALP、Runx2、OCN、OSX的mRNA表達(dá)水平顯著升高，相對(duì)表達(dá)量分別為1.78±0.17、3.49±0.26、1.60±0.04和1.82±0.17，以上差異較對(duì)照組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。Western Blot結(jié)果顯示，HGF也明顯促進(jìn)了成骨相關(guān)因子ALP、Runx2、OCN、OSX的蛋白表達(dá)(圖3)。這些結(jié)果表明，HGF可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨向分化。

與對(duì)照組比較，**：P<0.001

圖3 MC3T3-E1細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

3 討 論

成骨細(xì)胞作為骨形成的主要功能細(xì)胞，參與骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化，從而調(diào)節(jié)骨形成和重建[9]。MC3T3-E1細(xì)胞具有高水平的成骨細(xì)胞分化特性，經(jīng)誘導(dǎo)后形成礦化良好的細(xì)胞外基質(zhì)，特異性表達(dá)成骨相關(guān)因子，可作為成骨細(xì)胞來(lái)進(jìn)行研究[10]。因此，本研究應(yīng)用MC3T3-E1細(xì)胞探究HGF對(duì)成骨細(xì)胞增殖、凋亡和成骨分化的影響。

HGF的生物學(xué)作用包括促有絲分裂、運(yùn)動(dòng)、形態(tài)發(fā)生和抗凋亡活性等，不僅作用于肝臟組織，也可作用于多種間葉來(lái)源的組織細(xì)胞[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，HGF可以顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖，也對(duì)細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用，而且高濃度(25 ng/mL)的HGF相較于低濃度(10 ng/mL)作用更強(qiáng)。需要注意的是，HGF對(duì)破骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞同樣具有促生長(zhǎng)的作用[13-15]。這意味著，HGF對(duì)于骨再生和重建都具有重要作用，可能在骨缺損愈合過(guò)程中能夠吸收愈合不良的異位骨痂，重建新生骨，從而維持良好骨穩(wěn)態(tài)。因此，HGF在已發(fā)生不良愈合的骨再生環(huán)境中可能具有特異性的應(yīng)用前景。

已有研究發(fā)現(xiàn)，骨髓瘤細(xì)胞可以合成HGF，并且HGF在多發(fā)骨髓瘤病人的骨髓中維持較高濃度[16]。鄭彥文等[17]發(fā)現(xiàn)了HGF可以趨化誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向遷移，表明HGF在成骨分化過(guò)程中具有重要作用。在本研究中，ALP染色可見(jiàn)HGF處理后的MC3T3-E1細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)染色陽(yáng)性比例明顯升高，茜素紅染色也顯示出鈣結(jié)節(jié)數(shù)量的增加，表明了HGF對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成具有明顯的促進(jìn)作用。

ALP作為反映成骨細(xì)胞分化和骨基質(zhì)形成能力的標(biāo)志物[18]，在實(shí)驗(yàn)組中mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，表明HGF促進(jìn)了MC3T3-E1的早期分化。OCN是成骨細(xì)胞的特異性生化指標(biāo)，只表達(dá)于硬組織中，能夠調(diào)節(jié)礦物質(zhì)形成的速度和方向[19-20]。Runx2是成骨分化過(guò)程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，是骨形成過(guò)程中最早和最具特征性的標(biāo)志[21]。OSX是存在于Runx2下游的轉(zhuǎn)錄因子，僅在成骨細(xì)胞中特異性表達(dá)，主要在成骨分化晚期發(fā)揮作用[20]。通過(guò)對(duì)這些成骨相關(guān)因子的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)高濃度(25 ng/mL)的HGF可以顯著提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞中OCN、Runx2和OSX的mRNA和蛋白表達(dá)水平,與Wen等[22]對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究一致。成骨相關(guān)因子表達(dá)水平的升高意味著HGF促進(jìn)了MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化，展現(xiàn)了HGF在骨組織再生領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。

綜上所述，HGF能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠MC3T3-E1細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡，并且能夠促進(jìn)MC3T3-E1礦化誘導(dǎo)過(guò)程中成骨相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)，提升細(xì)胞的成骨分化和礦化能力，在成為骨生物材料改性因子方面具有極大的潛力和發(fā)展前景。本研究為HGF在骨組織再生中的應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)，為新型骨生物材料的研發(fā)提供了新的思路。