陳曉霞，顏世果，孫欽峰，李玉蘭

牙周組織再生是牙周領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，為尋找安全有效的生長(zhǎng)因子和種子細(xì)胞是多年來(lái)研究者們共同奮斗的目標(biāo)。核心結(jié)合因子α1(core binding factor α1，cbfα1)是成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子和成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子。研究發(fā)現(xiàn)cbfα1過(guò)表達(dá)可以誘導(dǎo)非成骨型細(xì)胞表達(dá)成骨相關(guān)基因[1-2]。說(shuō)明cbfα1在組織成骨方面起著重要作用。人牙齦成纖維細(xì)胞(human gingival fibroblasts, hGFs)在某些因子的誘導(dǎo)下也可表現(xiàn)出一定成骨特性。而cbfα1是否也能夠在一定程度上誘導(dǎo)hGFs成骨，還鮮有研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)用慢病毒作為載體將cbfα1轉(zhuǎn)染人牙齦成纖維細(xì)胞觀(guān)察其成骨表型轉(zhuǎn)化的可能性，以期為牙周組織再生尋找理想的生長(zhǎng)因子和種子細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

慢病毒體系pLenti6.3-Ires-EGFP (pL-E)及包裝質(zhì)粒Mix 購(gòu)于美國(guó)Invitrogen，pCMV5-cbfα1、熒光定量PCR試劑盒由山東省口腔生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，POLOdelivererTM3000 Transfection Reagent 購(gòu)于上海銳賽公司，Polybrene 購(gòu)于上海Sigma公司，cbfα1/Runx2單克隆抗體購(gòu)于上海abcam公司，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG、兔/鼠SP檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser 購(gòu)于大連寶生物有限公司、ROCHE LightCycler 480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)于德國(guó)ROCHE。

1.2 方法

1.2.1 重組慢病毒構(gòu)建及包裝 以質(zhì)粒pCMV5-cbfα1為模板設(shè)計(jì)引物，并在目的基因上下游分別添加酶切位點(diǎn)PacI和AscI，引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因,將目的基因PCR產(chǎn)物和慢病毒載體pLenti6.3-Ires-EGFP 進(jìn)行雙酶切,并回收所需酶切片段，利用T4 DNA ligase連接,置4 ℃冰箱過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板上，培養(yǎng)過(guò)夜，第2天挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，將PCR鑒定呈陽(yáng)性的克隆接到LB液體培養(yǎng)基中搖菌過(guò)夜，次日提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定。最后將酶切鑒定呈陽(yáng)性的克隆送測(cè)序。將構(gòu)建成功的pLenti6.3-cbfα1-Ires-EGFP (pL-cbfα1)及空載體pLenti6.3-Ires-EGFP (pL-E) 大量提取質(zhì)粒，分別與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，收集病毒液，采用熒光法測(cè)定病毒濃度。計(jì)算滴度公式如下：感染形成單位=(平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/視野)×(視野數(shù)/孔)÷病毒體積(mL)÷稀釋倍數(shù)。

表1 PCR引物設(shè)計(jì)

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人牙齦成纖維細(xì)胞取自年輕患者(18～30歲)因手術(shù)切除的健康牙齦組織，經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)，取3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 慢病毒感染hGFs 將狀態(tài)良好的hGFs細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液，以密度1×105個(gè)/孔接種到六孔板中，次日換液，根據(jù)查閱文獻(xiàn)及MOI值測(cè)定結(jié)果，以MOI=50加入慢病毒pL-cbfα1、pL-E及polybrene(終濃度5 mg/L)，感染24 h后，更換新鮮培養(yǎng)液，72 h后觀(guān)察各組細(xì)胞狀態(tài)及綠色熒光的表達(dá)情況。

1.2.4 hGFs外源基因cbfα1 mRNA表達(dá) 慢病毒pL-cbfα1、pL-E轉(zhuǎn)染hGFs 72 h后，Trizol法提取細(xì)胞mRNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將各組轉(zhuǎn)化成cDNA，采用熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞外源基因cbfα1 mRNA表達(dá)。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

1.2.4 細(xì)胞免疫組化 慢病毒感染hGFs 72 h后，用預(yù)冷的95%乙醇固定，以正常細(xì)胞作對(duì)照，用3%H2O2室溫孵育30 min，0.01%PBS洗滌3次，0.3% TritonX-100室溫通透30 min，0.01%PBS洗滌3次，用5%～10%正常山羊血清封閉10 min，再滴加1∶200 cbfα1抗體稀釋液，37 ℃孵育3 h，滴加生物素標(biāo)記二抗(山羊抗兔，山羊抗鼠)，室溫孵育2 h，0.01%PBS洗滌3次，滴加適量辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，室溫孵育15 min，0.01%PBS洗滌3次，DAB顯色劑避光顯色，復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.2.5 hGFs骨相關(guān)基因的表達(dá) 慢病毒pL-cbfα1、pL-E感染hGFs，72 h后提取細(xì)胞mRNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用熒光定量PCR法進(jìn)行成骨相關(guān)基因Bsp、Opn、ColⅠ、OC檢測(cè)。按照熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配制各反應(yīng)體系，引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以上各組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒構(gòu)建及包裝

慢病毒pLenti6.3-cbfα1-Ires-EGFP 經(jīng)酶切及測(cè)序檢驗(yàn)其構(gòu)建成功(圖1～2)，通過(guò)293T細(xì)胞包裝病毒并收集病毒液。采用熒光法檢測(cè)病毒滴度(圖3)，按照公式計(jì)算pL-cbfα1的滴度為：(13×183)÷(0.1×10-3)=2.3×107ifu/mL，陰性對(duì)照pL-E滴度為：1×108ifu/mL。

泳道1：Marker 15000(從上至下分別為15 000，10 000,7 500,5 000,2 500，1 000,750,500,250 bp)；泳道2～3：PacI和AscI酶對(duì)重組載體進(jìn)行雙酶切(目的條帶：9 100 bp + 1 587 bp)

圖2 cbfα1測(cè)序圖

圖3 pL-cbfα1感染293T細(xì)胞

2.2 重組慢病毒感染hGFs

慢病毒pL-cbfα1及pL-E感染hGFs，72 h后可以觀(guān)察到大量的綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染效率為70%～80%，而細(xì)胞死亡率約10%左右，但轉(zhuǎn)染后的慢病毒空載體組和正常細(xì)胞組在細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)方面未發(fā)現(xiàn)明顯差異，結(jié)果如圖4、5、6。

圖4 pL-cbfα1轉(zhuǎn)染hGFs

圖5 pL-EGFP轉(zhuǎn)染hGFs

圖6 正常hGFs

2.3 外源基因cbfα1 mRNA表達(dá)

pL-cbfα1感染hGFs后，采用熒光定量PCR法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)感染后的hGFs有cbfα1的過(guò)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組cbfα1的表達(dá)量增加7.4倍(P<0.05)，而空載體組和正常組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)(圖7)。

*： vs. hGFs組和pL-E, P<0.05

2.4 細(xì)胞免疫染色

實(shí)驗(yàn)組的hGFs經(jīng)抗cbfα1染色顯示：被感染的細(xì)胞核中可見(jiàn)棕褐色顆粒沉著，呈陽(yáng)性表達(dá)，而未感染的正常細(xì)胞及空白載體組中呈陰性表達(dá)(圖8)。

A:慢病毒pL-cbfα1感染細(xì)胞cbfα1陽(yáng)性染色( ×400);B: 慢病毒pL-E感染細(xì)胞cbfα1陰性染色( ×400);C: 正常hGFs中cbfα1陰性染色( ×400)

2.5 成骨相關(guān)基因的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組的hGFs可以檢測(cè)到成骨相關(guān)基因骨涎蛋白(Bsp)、骨橋蛋白(Opn)、Ⅰ型膠原(ColⅠ)、骨鈣蛋白(OC)的表達(dá)。而且實(shí)驗(yàn)組各成骨相關(guān)基因的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組和空載體組(P<0.05)。對(duì)空載體組和正常對(duì)照組各成骨相關(guān)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，其結(jié)果顯示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明空載體組對(duì)成骨相關(guān)基因的表達(dá)無(wú)影響。見(jiàn)圖9。

*：vs. hGFs和pL-E，P<0.05

3 討 論

在誘導(dǎo)種子細(xì)胞成骨方面，國(guó)內(nèi)外對(duì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP2)的研究是最多的，因?yàn)樗荁MP家族成員中活性最強(qiáng)，也是唯一能單獨(dú)誘導(dǎo)成骨的因子，并且在牙周組織再生和修復(fù)中發(fā)揮重要作用[3-4]。而cbfα1是成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子，它通過(guò)調(diào)控多種礦化相關(guān)蛋白，啟動(dòng)并促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，對(duì)成骨細(xì)胞早期分化起決定作用[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)cbfα1-/-基因敲除小鼠表現(xiàn)為膜內(nèi)骨及軟骨內(nèi)鈣化的完全缺失，即使在BMP2的作用下，小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)外均不能誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞[8]，說(shuō)明cbfα1較BMPs有更直接的促進(jìn)成骨作用。Takeuchi 等[9]對(duì)8周齡雄性Wistar大鼠左上頜第一磨牙行牙髓切斷術(shù)后覆蓋三氧化物凝聚體(MTA)，在術(shù)后第5天發(fā)現(xiàn)大部分牙髓組織的細(xì)胞核中可以檢測(cè)到cbfα1,說(shuō)明cbfα1可能參與牙髓組織修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。有研究還發(fā)現(xiàn)cbfα1在牙囊和牙乳頭中也都有表達(dá)而且隨著牙齒的進(jìn)一步發(fā)育和牙根、牙周組織的形成，cbfα1的表達(dá)更為明顯[10]，這說(shuō)明cbfα1可能參與牙周組織的發(fā)育。尚淑賢等[11]研究發(fā)現(xiàn)在小鼠牙胚鐘狀期牙囊細(xì)胞質(zhì)中cbfα1只有mRNA的表達(dá)，而未見(jiàn)蛋白的表達(dá)。而且cbfα1蛋白在前期牙本質(zhì)和牙槽骨中有表達(dá)，但在成牙本質(zhì)細(xì)胞、成釉細(xì)胞和牙本質(zhì)中，cbfα1 mRNA和蛋白均未見(jiàn)表達(dá)，由此推斷cbfα1是牙齒發(fā)育所必須的轉(zhuǎn)錄因子[12]。因此我們選擇cbfα1作為研究因子，以期其在牙周組織再生方面有進(jìn)一步的研究。

牙齦成纖維細(xì)胞作為牙周組織的組成成分，其來(lái)源豐富、容易獲得、具有很強(qiáng)的生長(zhǎng)和自我繁殖能力，在適當(dāng)?shù)拇碳は驴梢员磉_(dá)成骨細(xì)胞表型[13]，也因此牙齦成纖維細(xì)胞越來(lái)越受研究者們的關(guān)注。董廣英等[14]研究發(fā)現(xiàn)hBMP2基因轉(zhuǎn)染的人牙齦成纖維細(xì)胞，能夠表達(dá)hBMP2的相關(guān)分子，并具有成骨細(xì)胞活性。而對(duì)細(xì)胞的增殖特性無(wú)明顯影響。儲(chǔ)慶等[15]通過(guò)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)正常牙齦成纖維細(xì)胞不表達(dá)Bsp,其Opn的表達(dá)也低于牙周膜成纖維細(xì)胞，而通過(guò)轉(zhuǎn)染人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1基因(TGF-β1)可提高細(xì)胞Bsp、Opn和OC的表達(dá)。說(shuō)明牙齦成纖維細(xì)胞在相關(guān)因子的刺激下有一定的成骨表型。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用慢病毒作為載體是因?yàn)榭紤]到它對(duì)于分裂和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，尤其對(duì)一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化細(xì)胞等，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)染效率[16]，又很少引發(fā)免疫反應(yīng)，而且經(jīng)過(guò)構(gòu)建后的慢病毒載體可以攜帶大約5 kbp，甚至更長(zhǎng)的目的基因，當(dāng)然隨著目的基因長(zhǎng)度的增加，其病毒滴度也隨之下降[17-22],這在本實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)。

我們?cè)谥暗膶?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)人牙齦成纖維細(xì)胞中cbfα1在mRNA水平上有表達(dá)，而在蛋白水平上無(wú)表達(dá)[23]，提示cbfα1對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞的分化可能具有一定的調(diào)控潛能。本次實(shí)驗(yàn)將外源性基因cbfα1轉(zhuǎn)染到hGFs后，采用熒光定量PCR檢測(cè)到cbfα1 mRNA的表達(dá)比未感染組增強(qiáng)了7.4倍(P<0.05)，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)被感染的細(xì)胞胞核中有棕色顆粒沉著，呈陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明慢病毒介導(dǎo)的外源基因cbfα1能夠成功感染hGFs并表達(dá)相應(yīng)基因。由于cbfα1刺激成骨特異性基因表達(dá)是通過(guò)和骨特異性順式作用元件2(OSE2)結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而多種成骨細(xì)胞相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)存在OSE2，如OC、ColⅠ、Bsp、Opn等[24]。我們通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的hGFs成骨相關(guān)因子Bsp、Opn、OC及ColⅠ的表達(dá)，結(jié)果顯示各成骨相關(guān)因子均有不同程度增強(qiáng)。說(shuō)明人牙齦成纖維細(xì)胞在外源基因cbfα1的誘導(dǎo)下也可以表現(xiàn)出一定的成骨能力。但是我們看到代表成骨細(xì)胞晚期的表達(dá)標(biāo)志物OC的表達(dá)量較少，這可能是由于cbfα1只在成骨細(xì)胞分化的早期起作用[25]的緣故。因?yàn)樵谥暗难芯恐心馨l(fā)現(xiàn)cbfα1可上調(diào)不成熟成牙本質(zhì)細(xì)胞中牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)的表達(dá)，同時(shí)還可下調(diào)成熟成牙本質(zhì)細(xì)胞中DSPP的表達(dá)[26]。而過(guò)表達(dá)cbfα1能顯著增強(qiáng)成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的早期標(biāo)記基因的表達(dá)[27]。并且可以促進(jìn)牙乳頭細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，但卻抑制成牙本質(zhì)細(xì)胞的最終分化成熟[28]。說(shuō)明cbfα1在牙齒發(fā)育過(guò)程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。我們推測(cè)如果用cbfα1基因轉(zhuǎn)移到因牙周炎而導(dǎo)致牙槽骨缺損的部位，或許可以誘導(dǎo)其周?chē)例l成纖維細(xì)胞表型發(fā)生改變，從而實(shí)現(xiàn)牙周組織的再生，這將是我們研究的方向，本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究該基因在牙周組織再生工程中的作用奠定了基礎(chǔ)。