李 星 ，譚敦勇 ，郭惠明 ，趙明一 ，朱 平

［1.吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南吉首416000；2.廣東省心血管病研究所廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣州510010；3.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，長沙410006］

提要：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是通過重編程體細(xì)胞而得到的類似胚胎干細(xì)胞和胚胎APSC 多能細(xì)胞的一種細(xì)胞類型。iPSCs 向心肌細(xì)胞分化是一種使心肌細(xì)胞再生，治療心肌梗死、心力衰竭等相關(guān)疾病的一種新興技術(shù)。本文通過對(duì)近年來發(fā)表的iPSCs 向心肌細(xì)胞分化的相關(guān)文獻(xiàn)的整理、總結(jié)和分析，介紹近年來iPSCs 及其向心肌細(xì)胞分化的相關(guān)研究進(jìn)展、所面臨的問題以及未來的發(fā)展方向。

心血管疾病是全球疾病死亡的主要原因，每年導(dǎo)致大約1 700 萬人死亡。由于復(fù)雜的致病因素，心血管疾病目前仍難以預(yù)防。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的獲得，為心肌細(xì)胞的再生修復(fù)予以了新的希望。干細(xì)胞治療心血管疾病，通過再生心肌細(xì)胞，成為目前公認(rèn)的最有前途的治療手段［1-2］。2006 年日本科學(xué)家Takahashi 等［3］利用病毒載體將 4 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子 Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 轉(zhuǎn)入分化的成纖維細(xì)胞中獲得了iPSCs。iPSCs的出現(xiàn)，解決了一直阻礙干細(xì)胞研究的排斥反應(yīng)、倫理學(xué)、法律方面等難題，為相關(guān)疾病的研究和治療打開了新的一扇門，成為學(xué)術(shù)界研究的一大熱點(diǎn)。在近10 多年的研究中發(fā)現(xiàn)，不止成纖維細(xì)胞，幾乎所有的體細(xì)胞都可重編程產(chǎn)生iPSCs［4］。然而，隨著生物技術(shù)、研究水平的提高，仍然有諸如重編程的效率、腫瘤的形成、iPSCs 定向分化、目標(biāo)細(xì)胞的純化與富集等相關(guān)問題亟待解決，運(yùn)用何種方法改進(jìn)這些問題，成為目前相關(guān)研究的熱點(diǎn)。本文通過對(duì)近年來iPSCs 向心肌細(xì)胞分化的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為臨床治療提供策略。

1 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

2006 年，日本科學(xué)家 Takahashi 等［3］首次報(bào)道通過DNA 途徑，將克隆入轉(zhuǎn)錄因子的病毒載體導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞后培養(yǎng)出iPSCs。但由于c-Myc 這一常見原癌基因的加入、病毒的參與，iPSCs 向腫瘤細(xì)胞分化不可避免。這種方法不僅存在瘤變可能，誘導(dǎo)效率低、細(xì)胞定向分化能力差也成為這項(xiàng)技術(shù)的詬病。但是我們不可否認(rèn)，該技術(shù)將當(dāng)代醫(yī)學(xué)許多不可能變成了可能。隨著科學(xué)家們研究的深入，Nakagawa 等［5］通過去掉 c-Myc 因子，只 Oct4，Sox2 和 Klf4 等 3 個(gè)因子來誘導(dǎo) iPSCs，可喜的是，在后來iPSCs 分化的過程中并沒有腫瘤細(xì)胞的形成。2009 年，Yu等［6］通過非整合型附著體載體方法獲得的iPSC，在去掉附著體后，一舉解決了病毒載體和原癌基因c-Myc 導(dǎo)致癌變的可能。到目前為止，只有轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4被認(rèn)為是必不可少的，而Sox2、Klf4、c-Myc 則被認(rèn)為是可以替代的轉(zhuǎn)錄因子［7］。通過RNA 途徑誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，避免了因?yàn)榛虿迦攵鴮?dǎo)致的成瘤風(fēng)險(xiǎn)。2011 年，Anokye-Danso 等［8］通過RNA 水平的重編程，在外加Hdac2 的基礎(chǔ)上，外源合成miR302/367，再將其克隆到pLOVE 載體上，最后把載體轉(zhuǎn)染到人和鼠的成纖維細(xì)胞，成功重編程出iPSCs。2017 年，Kim 等［9］通過機(jī)械牽張刺激成功使體細(xì)胞重編程為iPSCs，但是在他們的研究中發(fā)現(xiàn)機(jī)械牽張刺激并不能提高病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)率。2019 年，Gandhi 等［10］發(fā)現(xiàn)人纖維蛋白原在iPSCs 二維和三維分化上效率提高了37%；同年，Gagliano等［11］使用微流體技術(shù)成功地使數(shù)百個(gè)細(xì)胞同時(shí)重編程，該技術(shù)與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)多孔培養(yǎng)條件相比，原料成本降低約100 倍。

iPSCs 通過一系列的分化過程，產(chǎn)生具有收縮功能的心肌細(xì)胞。這個(gè)復(fù)雜的分化過程是通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)通路來調(diào)節(jié)的，前期的相關(guān)研究也證實(shí)Tbx5、Hey2、Irx4、MLC2v、MLC2a、MLC1a 等基因調(diào)控心肌細(xì)胞的分化；同時(shí)，nodal、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、Wnts、成纖維生長因子等信號(hào)亦調(diào)控著iPSCs 向心肌細(xì)胞分化；大量的研究也發(fā)現(xiàn)維甲酸可控制心肌細(xì)胞的識(shí)別。iPSCs 向心肌細(xì)胞分

化和胚胎心臟分化的機(jī)制類似，通過對(duì)iPSCs 向心肌細(xì)胞分化機(jī)制的研究，更有利于控制iPSCs 向心肌細(xì)胞定向分化。iPSCs 的輝煌研究歷程，無疑證明其在治療心血管疾病方面有著巨大的潛力，將iPSCs 誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，這對(duì)心肌病的基礎(chǔ)研究和臨床治療都起到至關(guān)重要的作用，極大地促進(jìn)了心肌病的研究發(fā)展［12］。

2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的方法

2.1 小規(guī)模分化策略

2.1.1 擬胚體生成法 擬胚體（embryoid body，EB）生成法是利用iPSCs 生成心肌細(xì)胞的最常用方法。EB 生成法使未分化的iPSCs 聚合體在懸液中生長，形成一種被稱為EBs的結(jié)構(gòu)［13］。EBs 是可以分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層的細(xì)胞群［14］。傳統(tǒng)的EBs 生成方法，包括靜態(tài)懸浮培養(yǎng)、懸滴和強(qiáng)制聚集。在無血清條件下，通過幾種細(xì)胞因子（如激活素A 和BMP4）的參與，EBs 可以有效地分化為心肌細(xì)胞。Zhang 等［15］用 OCT4，SOX2，NANOG，LIN28 等慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)hiPSCs 后生成EBs，使其分化出具有功能的心肌細(xì)胞。證明iPSCs 是一種可行的心臟修復(fù)的自體細(xì)胞來源，也是心血管研究的有力工具。這些由iPSCs/EBs 分化而來的心肌細(xì)胞與人類胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生的心肌細(xì)胞相似，并且表達(dá)了相似的表型、結(jié)構(gòu)和功能特征。文章指出，由iPSCs 分化的心肌細(xì)胞培養(yǎng)過程中顯示出Oct3 和Nanog 使細(xì)胞分化能力下降，而NANOG 和LIN28 則促進(jìn)了細(xì)胞的分化。同時(shí)，電生理學(xué)研究表明，iPSCs 有一種像ES 細(xì)胞一樣的能力，可以根據(jù)動(dòng)作電位的特征分化成Nodal、心房及心室的表型，并通過β-腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)途徑的刺激使搏動(dòng)頻率增加和動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間下降。

2.1.2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與內(nèi)臟內(nèi)胚層樣細(xì)胞共培養(yǎng) 內(nèi)臟內(nèi)胚層（visceral-endoderm，VE）是在胚胎發(fā)育的早期階段形成的胚外細(xì)胞層，分泌胚胎發(fā)育的關(guān)鍵因子。Mummery 等［16］報(bào)道了小鼠的VE 細(xì)胞共同培養(yǎng)可以有效誘導(dǎo)其分化為心肌細(xì)胞。Passier 等［17］在研究中發(fā)現(xiàn)，在20%胎牛血清（FCS）存在的情況下，我們通過與VE細(xì)胞，END-2共培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)iPSCs 向心肌細(xì)胞分化。在這項(xiàng)研究中，細(xì)胞的分化程度和血清濃度呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)，在無胎牛血清的情況下，與只有20%的胎牛血清相比，分化后的細(xì)胞搏動(dòng)次數(shù)增加了24 倍。當(dāng)抗壞血酸被添加到無血清的共培養(yǎng)體中，觀察到細(xì)胞的搏動(dòng)次數(shù)增加了40%。雖然END-2 的心肌誘導(dǎo)機(jī)制尚不清楚，但實(shí)驗(yàn)研究證明了END-2 的誘導(dǎo)活性，在HepG2 與END-2 之間有表達(dá)共同的蛋白質(zhì)圖譜。發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)介質(zhì)中都存在6 種蛋白質(zhì)，包括可能在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變（EMT）上發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)。然而，在Graichen 等［18］的研究中發(fā)現(xiàn)，在無血清共培養(yǎng)體中，即使有END-2 的參與，在分化的細(xì)胞數(shù)量超過10%后，很難有進(jìn)一步的分化。通過篩選候選分子，確定了SB203580 這種特殊的p38 MAP 激酶抑制劑，是一種強(qiáng)有力的促進(jìn)心臟生成的促進(jìn)劑。但有趣的是，在SB203580 的濃度超過15 mmol/L 的情況下，心肌細(xì)胞的生成受到強(qiáng)烈抑制。因此，對(duì)p38MAP 激酶通路的調(diào)節(jié)，結(jié)合由END-2 細(xì)胞釋放的因子，在早期決定心肌分化的效率中起著至關(guān)重要的作用。

2.1.3 通過特異性心源性生長因子使混合的iPSCs 單層細(xì)胞分化 該方法通過在不同動(dòng)物模型中依次添加已知誘導(dǎo)心臟發(fā)育的生長因子，使iPSCs 直接向心臟譜系分化。通過這種特定生長因子的連續(xù)添加旨在體外模擬心臟組織的胚胎發(fā)育過程。外胚層中的Nodal 信號(hào)傳導(dǎo)引起中胚層分化標(biāo)志著原腸胚的發(fā)生。Nodal 在胚芽層發(fā)育中的作用至關(guān)重要。事實(shí)上，在早期胃腸形成過程中，Nodal 的喪失已被證明會(huì)導(dǎo)致中胚層的喪失和過度的外胚層分化，甚至胚胎的死亡。在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育中心是第一個(gè)可識(shí)別的組織。它原始的條紋形成于外胚層和內(nèi)胚層之間的間胚層細(xì)胞層。這些細(xì)胞表達(dá)大量的中胚層基因，包括Wnt3、Brachyury T、BMP4和 MESP-1［19-20］。此外，MESP-1通過DKK1 和CER1 直接抑制Wnt 和Nodal 信號(hào)，對(duì)早期中胚層誘導(dǎo)具有較強(qiáng)的抑制作用。在此基礎(chǔ)上，采用連續(xù)幾輪的重組生長因子如堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、BMP4、Wnt3 和激活素 A 等刺激 iPSCs，隨后加入 DKK1 或其他Wnt 抑制劑，誘導(dǎo)細(xì)胞分化。此外，如Noggin，血管內(nèi)皮生長因子，CHIR 和 IWR-1/IWP-2［21］，轉(zhuǎn)化生長因子-β信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑，SHH 信號(hào)的激活［22］都已被證明能提升分化效率。

盡管小規(guī)模分化方案成功地使iPSCs 向心肌細(xì)胞分化，但是它們的可重復(fù)性是有限的，相關(guān)實(shí)驗(yàn)步驟的可控性以及試驗(yàn)方法的繁瑣給iPSCs 的臨床應(yīng)用帶來很大限制。此外，大型動(dòng)物模型和組織工程也都需要持續(xù)提供龐大數(shù)量的心肌細(xì)胞，這就需要更先進(jìn)的大規(guī)模iPSCs 向心肌細(xì)胞分化方案。

2.2 大規(guī)模分化策略

2.2.1 2D 單層培養(yǎng)法 iPSCs 的分化通常可以在傳統(tǒng)的培養(yǎng)皿或燒瓶中進(jìn)行，即在基質(zhì)表面貼壁培養(yǎng)（2D）分化。2D 培養(yǎng)法具有超越傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法的巨大優(yōu)勢。相對(duì)單層培養(yǎng)法也直接允許無濃度梯度的生長因子和小分子進(jìn)入細(xì)胞，從而潛在地支持實(shí)驗(yàn)的再現(xiàn)［23］。單層培養(yǎng)法也沒有要求EB 法的典型應(yīng)答步驟，從而減少了操作過程中的步驟，以及組織培養(yǎng)用品的使用。因此，通過成倍增加培養(yǎng)皿或使用多層燒瓶，將2D 培養(yǎng)皿擴(kuò)大用于iPSCs 大規(guī)模生產(chǎn)是可行的。然而，這仍然需要大量的空間和勞動(dòng)力。由于對(duì)細(xì)胞治療制劑生產(chǎn)成本的考慮，此方法最終會(huì)受到的經(jīng)濟(jì)限制［24］。

2.1.2 3D 懸浮培養(yǎng)法 三維空間的開發(fā)需要懸浮物的生成，在連續(xù)培養(yǎng)iPSCs 的培養(yǎng)基中，即在懸浮狀態(tài)下培養(yǎng)單細(xì)胞［25］。然而，未改變基因組的iPSCs 持續(xù)單細(xì)胞培養(yǎng)法尚未有相關(guān)論文發(fā)表［26］。最近也有學(xué)者建議使用一種合成的、與《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GMP）相兼容的水凝膠作為iPSCs 分化的3D 培養(yǎng)物［27］。水凝膠培養(yǎng)在一定程度上模擬了胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中人胚胎干細(xì)胞的過渡階段，為多能細(xì)胞的增殖分化提供條件［28］。但該方法與iPSCs 分化的相容性仍有待實(shí)踐證明［29］。同時(shí)，在懸浮培養(yǎng)中植入單個(gè)iPSC 或細(xì)胞團(tuán)，特別是在靜態(tài)培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞易在重力作用下聚集。隨后，經(jīng)常觀察到不受控制和有害的細(xì)胞團(tuán)融合。最近，利用一種稱為gellan 膠的高分子聚合物，證明了聚合體可以在靜態(tài)條件下保持完全懸浮，并有效地防止融合［30］。然而，這種靜態(tài)的培養(yǎng)環(huán)境不能使iPSCs 與代謝產(chǎn)物、營養(yǎng)物質(zhì)、細(xì)胞因子等充分交換，培養(yǎng)環(huán)境的PH、氧等各種理化因素都不能形成一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，因此，一批能使iPSCs 在動(dòng)態(tài)環(huán)境中分化的反應(yīng)器應(yīng)運(yùn)而生。

2.1.3 在生物反應(yīng)器中使用儀器攪拌的3D懸浮培養(yǎng)法 據(jù)最近的文獻(xiàn)表明，“自由漂浮”的懸浮培養(yǎng)法有望得到iPSCs生產(chǎn)和分化出107-1010 甚至更多數(shù)量的目標(biāo)細(xì)胞［31］。因此，在生物反應(yīng)器中使用儀器攪拌的3D 懸浮培養(yǎng)法在iPSCs 生產(chǎn)和分化中具有巨大的優(yōu)勢。通過葉輪控制攪拌，確保均勻混合和分布的細(xì)胞、培養(yǎng)基和氣體，不同的葉輪類型、攪拌速度和細(xì)胞接種密度可用于控制細(xì)胞聚集和后續(xù)的進(jìn)程［32］。Donghui 等［33］首次在動(dòng)態(tài)的生物反應(yīng)器用聚賴氨酸包裹藻酸鹽的膠囊中實(shí)現(xiàn)了心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。完全儀器化生物反應(yīng)器可以監(jiān)視、調(diào)控關(guān)鍵工藝參數(shù)，包括pH 值和DO 等的在線評(píng)估。其他的在線監(jiān)測代謝參數(shù)，如葡萄糖、乳酸鹽和銨濃度也是大型生物反應(yīng)器的監(jiān)測指標(biāo)［34］。目前正在開發(fā)更先進(jìn)的工具，如無標(biāo)簽、非侵入性監(jiān)測細(xì)胞的多能性與分化，以及自動(dòng)化3D 顯微鏡，以更好地評(píng)估和控制干細(xì)胞的特性［35-36］。

綜上所述，影響iPSCs 向心肌細(xì)胞分化的因素很多，其中一些包括起始細(xì)胞群、生長因子以及培養(yǎng)條件，詳見表1。諸如很多物理刺激iPSCs 分化的方法（電刺激［37］、機(jī)械牽拉［38］），根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定這些因素的最佳使用方案是iPSCs 向心肌細(xì)胞成功分化的關(guān)鍵。

表1 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的分化方法及特點(diǎn)

3 問題和展望

iPSCs 相關(guān)研究經(jīng)歷了10 余年，有一定進(jìn)展。和胚胎干細(xì)胞相比較，iPSCs 避免了醫(yī)學(xué)倫理學(xué)問題及免疫排斥等問題，但一些問題仍值得各國學(xué)者們深思和需要解決。首先，提高重編程效率是該領(lǐng)域研究亟待突破的一面壁壘，這與基因?qū)氲姆绞健⒄衔稽c(diǎn)、表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的數(shù)量和模式等多種因素有關(guān)，iPSC 的誘導(dǎo)方式在經(jīng)過各國學(xué)者的改進(jìn)，付出了巨大的努力，但其誘導(dǎo)方法的效率依然很低，在少量誘導(dǎo)完全成功的iPSC 中，由于其并不穩(wěn)定的狀態(tài)，現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)并不能很好地控制其實(shí)驗(yàn)過程。其次是腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體將多能性因子轉(zhuǎn)入分化成熟的體細(xì)胞，這里的多能性因子包括c-Myc 這一常見原癌基因，再加上病毒的參與，細(xì)胞分化的不確定性，腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)目前也無法避免。最后，iPSC 的定向分化、雜細(xì)胞的移除、目標(biāo)細(xì)胞的富集與純化以及移植后細(xì)胞的存活時(shí)間都需要學(xué)者們在今后的研究中去解決。

iPSCs 向心肌細(xì)胞分化是一項(xiàng)造福心肌梗死、心臟衰竭等心臟病患者的一門前沿技術(shù)，為心肌細(xì)胞的再生與修復(fù)打開了新的一扇大門，相關(guān)研究的機(jī)遇與挑戰(zhàn)也并存。在誘導(dǎo)分化的機(jī)制方面還非常有限，提高誘導(dǎo)效率、控制iPSCs 定向分化以及簡化其誘導(dǎo)途徑、iPSCs 的大規(guī)模生產(chǎn)、誘導(dǎo)生成的心肌細(xì)胞的富集純化等仍是今后研究的熱點(diǎn)。