楊雪，林錕，譚麗菊，王江濤*

( 1. 中國(guó)海洋大學(xué) 海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100)

1 引言

近年來(lái)，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)高密度、集約化的發(fā)展，大量的污水被排入海中，造成海洋生態(tài)平衡遭到嚴(yán)重破壞，有害藻華現(xiàn)象頻發(fā)[1]。自2007 年以來(lái)，黃海海域連續(xù)暴發(fā)由大型綠藻滸苔（Ulva prolifera）造成的綠潮災(zāi)害，呈現(xiàn)連續(xù)性和常態(tài)化趨勢(shì)。在黃海綠潮期間，大量的滸苔覆蓋在海水表面遮蔽陽(yáng)光，使得一部分海洋生物無(wú)法正常光合作用[2]，滸苔還會(huì)分泌出有毒的化學(xué)物質(zhì)，造成其他生物的死亡，對(duì)于近海的海洋生態(tài)系統(tǒng)造成了嚴(yán)重破壞，給我國(guó)沿海城市的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、旅游業(yè)、居民生活等帶來(lái)了諸多負(fù)面影響，嚴(yán)重威脅地區(qū)的可持續(xù)發(fā)展[3-7]。

大型海藻種類(lèi)較多，按色素種類(lèi)及含量不同可分為紅藻、綠藻、褐藻等，廣泛分布于潮間帶及潮間帶下的透光層，固著生長(zhǎng)于淺海海底的巖礁上或漂浮生長(zhǎng)。本研究?jī)蓚€(gè)目標(biāo)藻種，滸苔呈中空管狀體結(jié)構(gòu)，分枝細(xì)長(zhǎng)，最長(zhǎng)的分枝能夠達(dá)到1 m，生長(zhǎng)于沿岸高、中潮帶沙礫中，主要分布在日本群島及黃海地區(qū)[8-9]；石莼（Ulva lactuca）是一種比較常見(jiàn)的海藻類(lèi)植物，生長(zhǎng)于低潮帶，其主要生活在黃海和渤海的沿岸地區(qū)[10-11]。對(duì)限制性營(yíng)養(yǎng)鹽的競(jìng)爭(zhēng)能力是藻類(lèi)大量繁殖的關(guān)鍵，Redfield[12]提出浮游植物吸收海水中營(yíng)養(yǎng)鹽濃度的比值為Si∶N∶P = 16∶16∶1，適宜的氮磷比值有利于浮游植物的生長(zhǎng)繁殖，反之會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)失調(diào)，浮游生物種群結(jié)構(gòu)的改變，甚至引發(fā)藻華災(zāi)害。大量研究證實(shí)，黃海綠潮災(zāi)害的頻發(fā)，與海水中豐富的營(yíng)養(yǎng)鹽關(guān)系密切[13-14]。

在大型海藻生長(zhǎng)過(guò)程中，需要大量營(yíng)養(yǎng)鹽的支持，因此當(dāng)大型海藻與其他浮游植物共存時(shí)，其對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的掠取使得其他浮游生物的競(jìng)爭(zhēng)力下降。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞滸苔與浮游微藻的競(jìng)爭(zhēng)作用開(kāi)展了一系列研究[15-16]，取得了一定的科學(xué)認(rèn)知，但對(duì)于滸苔與其他大型藻類(lèi)的競(jìng)爭(zhēng)作用研究較少。大型藻類(lèi)之間也不可避免存在著競(jìng)爭(zhēng)作用，對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的吸收和適應(yīng)性也存在著差異，導(dǎo)致了它們之間的競(jìng)爭(zhēng)作用有強(qiáng)弱之分。已有研究結(jié)果表明，兩種常見(jiàn)綠潮藻石莼、滸苔在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，石莼的相對(duì)生長(zhǎng)速率都是最大的，并且生長(zhǎng)速率顯著高于滸苔和其他大型藻類(lèi)[17]，這與石莼的比表面積有關(guān)[18]。石莼作為黃海和渤海低潮帶的又一種常見(jiàn)海藻類(lèi)植物，卻并沒(méi)有造成如滸苔類(lèi)似的大規(guī)模暴發(fā)現(xiàn)象，探究其成因，南黃海海域N/P 比值水平更適合滸苔的生長(zhǎng)繁殖，這可能是滸苔大規(guī)模暴發(fā)的一個(gè)重要原因[2]。因此，本文主要研究不同的氮磷比下滸苔和石莼共培養(yǎng)下的競(jìng)爭(zhēng)作用，探索營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)滸苔生長(zhǎng)的影響，以期為滸苔綠潮機(jī)制提供科學(xué)基礎(chǔ)與理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查

蘇北淺灘及其鄰近海域水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)達(dá)，海水富營(yíng)養(yǎng)化較為嚴(yán)重，滸苔于3 月在蘇北淺灘海域開(kāi)始萌發(fā)，并在風(fēng)和海流的作用下，向北漂浮聚集，在我國(guó)山東半島海域形成綠潮災(zāi)害，因此本研究于2018 年5 月12-24 日 對(duì) 蘇 北 淺 灘 及 其 鄰 近 海 域（32.3°～34.0°N，120.6°～122.2°E）進(jìn)行了為期13 d 的調(diào)查，布設(shè)了6 個(gè)斷面24 個(gè)站位。由于蘇北淺灘及其鄰近海域水深較淺，故只采集表層海水，水樣采集后立即經(jīng)GF/F 濾膜（0.7 μm，Whatman，450℃灼燒4 h）過(guò)濾，樣品于?20℃冷凍保存，用于后續(xù)氮磷比值的分析。

2.2 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用滸苔及石莼于2018 年5 月采自蘇北淺灘海域，采集后用高溫高壓滅菌海水反復(fù)沖洗3～4 次，用軟毛刷刷去泥沙和附生生物，鏡檢確認(rèn)無(wú)雜藻后，挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好“無(wú)白化”的藻體備用。實(shí)驗(yàn)用海水由專(zhuān)業(yè)人員采集自蘇北淺灘，用孔徑0.45 μm 的醋酸纖維濾膜過(guò)濾，經(jīng)過(guò)120℃高溫殺菌20 min，靜置冷卻至室溫后待用。海水鹽度為31，海水本底N 濃度為13.36 μmol/L，為0.24 μmol/L。

2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 組不同的氮磷比，分別為N/P =3.2∶1、N/P = 16∶1、N/P = 40∶1，濃度設(shè)計(jì)如表1 所示，除氮、磷外其余營(yíng)養(yǎng)要素按f/2 培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)充，實(shí)驗(yàn)在添加有200 mL 培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶中進(jìn)行，培養(yǎng)期間每?jī)商旄鼡Q培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶均勻放置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為20℃，光照強(qiáng)度60 μmol/(m2·s)，光暗比為12 h∶12 h。實(shí)驗(yàn)分為3 組培養(yǎng)體系，滸苔單獨(dú)培養(yǎng)，石莼單獨(dú)培養(yǎng)，滸苔與石莼混合培養(yǎng)，兩種藻類(lèi)均為非附著生長(zhǎng)，每組設(shè)置3 組重復(fù)，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行11 d。

表 1 培養(yǎng)液中氮、磷添加含量Table 1 Addition of nitrogen and phosphorus in culture solution

2.4 生物量及相對(duì)增長(zhǎng)率的測(cè)定與計(jì)算

實(shí)驗(yàn)采用測(cè)定濕重和分枝（直徑）長(zhǎng)度的方法觀測(cè)各種營(yíng)養(yǎng)條件下滸苔和石莼的生長(zhǎng)速率。濕重法是將培養(yǎng)的所有滸苔（石莼）撈出，用吸水紙吸干藻體表面的水分，置于干燥的培養(yǎng)皿中于分析天平稱(chēng)重，滸苔（石莼）初始重量均為（0.20 ± 0.01） g。測(cè)量滸苔平均分枝長(zhǎng)度法，是用鑷子夾住一株滸苔的中心主枝部分，放入有滅菌海水的培養(yǎng)皿中，讓滸苔分枝向一邊自然伸展，用厘米尺測(cè)量其一端到最長(zhǎng)分枝末端長(zhǎng)度，即是這一株滸苔長(zhǎng)度。測(cè)量這組燒杯中的所有滸苔分枝長(zhǎng)度，計(jì)算其平均長(zhǎng)度。測(cè)量石莼平均直徑法，是將石莼用打孔器切成直徑為1.5 cm 的大小相同的圓片，在各個(gè)條件下培養(yǎng)后測(cè)定其平均直徑。

2.5 營(yíng)養(yǎng)鹽測(cè)定

使用營(yíng)養(yǎng)鹽自動(dòng)分析儀（BRAN LUEBBE，AA3）以分光光度法對(duì)采集水樣的營(yíng)養(yǎng)鹽濃度進(jìn)行分析，主要分析參數(shù)及方法為：總氮，堿性過(guò)硫酸鉀消解分光光度法；總磷，堿性過(guò)硫酸鉀消解鉬銻藍(lán)分光光度法。

2.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 19 對(duì)滸苔及石莼生物量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較不同培養(yǎng)體系間相對(duì)增長(zhǎng)率的差異（單因素方差分析，one-way ANOVA），p＜ 0.05 作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 滸苔暴發(fā)時(shí)蘇北淺灘海域氮磷比值

蘇北淺灘及其臨近海域表層水體氮磷比值的平面分布如圖1 所示。由圖可看出，蘇北淺灘及其臨近海域表層水體氮磷比值總體呈現(xiàn)近岸高，遠(yuǎn)岸分布不均的分布特征，其中高值中心位于江蘇省鹽城市大豐區(qū)附近海域，可能由于該海域漁業(yè)養(yǎng)殖及浮游生物活動(dòng)密集，排（釋?zhuān)┓糯罅康?。調(diào)查海區(qū)總氮濃度范圍在13.88～50.92 mg/L，平均值為28.65 mg/L；總磷濃度范圍在0.35～0.96 mg/L，平均值為0.58 mg/L；氮磷比在36.12～63.12 之間，平均值為48.42。水體中氮磷比值與浮游生物體中氮磷比值越接近越有利于浮游生物生長(zhǎng)，溫珊珊等[19]測(cè)得滸苔藻體中N/P 為45.8，說(shuō)明蘇北淺灘水體氮磷比值十分適宜滸苔的生長(zhǎng)。根據(jù)氮磷比值確定整個(gè)海區(qū)在滸苔暴發(fā)期間存在磷限制，滸苔暴發(fā)期間根據(jù)體內(nèi)的氮磷比吸收大量的氮、磷，然而海區(qū)磷含量遠(yuǎn)小于滸苔生長(zhǎng)所消耗的量。

圖 1 本文采樣站位和蘇北淺灘海域氮磷比值（2018 年5 月）Fig. 1 The sampling stations and the ratio of nitrogen to phosphorus distribution in the Subei Shoal (May 2018)

3.2 不同氮磷比對(duì)滸苔生長(zhǎng)影響

不同氮磷比條件下單獨(dú)培養(yǎng)滸苔的濕重及生長(zhǎng)率、分枝長(zhǎng)度及分枝增長(zhǎng)率隨時(shí)間的變化情況如圖2所示。不同氮磷比值對(duì)滸苔的生長(zhǎng)影響不同，N/P =3.2∶1、N/P = 16∶1、N/P = 40∶1 這3 組的日均相對(duì)增長(zhǎng)速率（濕重）分別為1.86%、2.23%、3.81%。由圖2可以綜合看出，N/P = 40∶1 組相對(duì)于其他兩組對(duì)滸苔生長(zhǎng)促進(jìn)效果更明顯，說(shuō)明在培養(yǎng)液中高氮磷比能促進(jìn)滸苔的生長(zhǎng)，氮對(duì)滸苔生長(zhǎng)的促進(jìn)效果更明顯。由于滸苔分枝長(zhǎng)度較難控制統(tǒng)一，盡量選擇了分枝長(zhǎng)度相近的滸苔，從滸苔分枝長(zhǎng)度看（圖2c），N/P =3.2∶1 組的滸苔分枝長(zhǎng)度基本沒(méi)有增長(zhǎng)，相比之下N/P = 40∶1 組呈現(xiàn)出了很好的增長(zhǎng)，在11 d 培養(yǎng)之后分枝長(zhǎng)度增加了49.72%，說(shuō)明滸苔生理狀態(tài)較好。從生長(zhǎng)速率來(lái)看，N/P = 3.2∶1 組和N/P = 16∶1組實(shí)驗(yàn)初期生長(zhǎng)速率快，到后期開(kāi)始降低甚至出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，且滸苔藻體開(kāi)始出現(xiàn)“白化”現(xiàn)象，考慮是由于部分營(yíng)養(yǎng)元素逐漸被消耗不能滿(mǎn)足滸苔的生長(zhǎng)需求，因而滸苔不再生長(zhǎng)甚至死亡。

3.3 不同氮磷比對(duì)石莼生長(zhǎng)影響

不同氮磷比條件下單獨(dú)培養(yǎng)石莼的濕重及生長(zhǎng)率、直徑長(zhǎng)度及直徑增長(zhǎng)率隨時(shí)間的變化如圖3 所示。N/P = 3.2∶1、N/P = 16∶1、N/P = 40∶1 這3 組的日均相對(duì)增長(zhǎng)速率（濕重）分別為7.48%、6.04%、5.25%。由圖可看出N/P = 3.2∶1 組的石莼生長(zhǎng)情況優(yōu)于N/P = 16∶1 組和N/P = 40∶1 組。石莼在實(shí)驗(yàn)初期生長(zhǎng)速率快，然后逐漸平穩(wěn)生長(zhǎng)，到后期仍有生長(zhǎng)的趨勢(shì)，并不像滸苔呈現(xiàn)停止生長(zhǎng)甚至死亡。從直徑長(zhǎng)度也可以看出，在培養(yǎng)中期石莼直徑增長(zhǎng)速率最快，可能是由于實(shí)驗(yàn)初期石莼切片之后邊緣還未適應(yīng)環(huán)境，短期內(nèi)增長(zhǎng)速率未呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)，但直徑長(zhǎng)度總體呈現(xiàn)一直增長(zhǎng)的趨勢(shì)，N/P = 3.2∶1 組在培養(yǎng)11 d后增長(zhǎng)了0.26 cm。有學(xué)者研究表明，石莼中含有IAA類(lèi)生長(zhǎng)素能夠增加細(xì)胞滲透吸收能力，從而使細(xì)胞體積增大，還能促進(jìn)RNA 和蛋白質(zhì)的合成，為合成原生質(zhì)體和細(xì)胞壁提供原材料，保持石莼的持久生長(zhǎng)[20]。

3.4 不同氮磷比對(duì)共培養(yǎng)下滸苔和石莼影響

如圖4 所示，在共培養(yǎng)下，高氮磷比N/P = 40∶1組滸苔在實(shí)驗(yàn)初期有明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)，但在實(shí)驗(yàn)后期出現(xiàn)下降，可能是由于滸苔對(duì)于磷的吸收利用能力不如石莼，因此出現(xiàn)了磷的限制作用；N/P = 16∶1 組滸苔的生長(zhǎng)情況并不明顯，培養(yǎng)5 d 后生物量便出現(xiàn)下降的趨勢(shì)；而N/P = 3.2∶1 組的滸苔在培養(yǎng)3 d 后生物量呈現(xiàn)急劇下降，生長(zhǎng)速率甚至低至?7.12%，說(shuō)明滸苔生長(zhǎng)受到了極大限制。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，N/P =3.2∶1 組和N/P = 16∶1 組滸苔藻體“白化”現(xiàn)象明顯，說(shuō)明部分滸苔受到營(yíng)養(yǎng)限制。在實(shí)驗(yàn)后期，將從培養(yǎng)瓶上刮下綠色附著物制片后進(jìn)行鏡檢觀察，顯示為滸苔孢子，說(shuō)明滸苔釋放出孢子以加速繁殖，當(dāng)孢子釋放后滸苔死亡[21]。相比而言，石莼在N/P = 3.2∶1 組、N/P = 16∶1 組、N/P = 40∶1 組的生物量都有明顯增加，由表2、圖4 也可以看出在共培養(yǎng)條件下，石莼的相對(duì)生長(zhǎng)速率均比滸苔大。綜上可得，滸苔和石莼共培養(yǎng)時(shí)，滸苔的生長(zhǎng)情況均不如單獨(dú)培養(yǎng)，并且氮磷比越小越不利于滸苔的生長(zhǎng)，而石莼的生長(zhǎng)情況相差不是很大，說(shuō)明石莼吸收營(yíng)養(yǎng)鹽的能力強(qiáng)于滸苔，尤其是吸收磷的能力，這可能與石莼的細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及比表面積有關(guān)。

圖 2 不同N/P 條件下單獨(dú)培養(yǎng)滸苔的濕重（a、b）及分枝長(zhǎng)度（c、d）變化Fig. 2 Changes in wet weight (a, b) and branch length (c, d) of U. prolifera under different N/P conditions of pure culture

4 討論

有國(guó)外學(xué)者提出當(dāng)海洋中的N/P ＞ 22 時(shí)，藻類(lèi)的生長(zhǎng)會(huì)相對(duì)受磷的限制；N/P ＜ 10 時(shí)，藻類(lèi)生長(zhǎng)受氮的影響比較大；當(dāng)22 ＞ N/P ＞ 10 時(shí)，不同的藻類(lèi)受氮、磷影響不同[22]。在本研究中，共培養(yǎng)時(shí)，N/P =40∶1 組滸苔在培養(yǎng)前期狀態(tài)較好，到后期開(kāi)始出現(xiàn)生物量降低的趨勢(shì)，可能是由于競(jìng)爭(zhēng)作用導(dǎo)致磷的限制而造成的；N/P = 3.2∶1 組滸苔的生長(zhǎng)情況較差，相對(duì)生長(zhǎng)速率甚至為負(fù)值，說(shuō)明滸苔的生長(zhǎng)受到了極大的限制甚至死亡，證實(shí)了在一定范圍內(nèi)氮是影響滸苔生長(zhǎng)的主要因子。吳婷[13]研究發(fā)現(xiàn)海水中添加磷對(duì)滸苔的生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用，但當(dāng)添加的磷達(dá)一定濃度時(shí)，促進(jìn)作用不如氮明顯，相對(duì)于氮，滸苔受磷添加影響較弱。龐秋婷等[23]關(guān)于滸苔現(xiàn)場(chǎng)圍隔實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也顯示，在磷酸鹽含量適中的培養(yǎng)條件下，高濃度氮更能促進(jìn)滸苔的生長(zhǎng)，與本文研究一致。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)時(shí)滸苔競(jìng)爭(zhēng)力不如石莼，目前對(duì)于滸苔暴發(fā)機(jī)制已有大量研究，主要是從滸苔漂浮氣囊結(jié)構(gòu)及其對(duì)光照和溫度的適應(yīng)性等方面進(jìn)行分析[16,24]，本研究從氮磷比值角度進(jìn)行綜合分析。氮磷比較大的N/P = 40∶1 組滸苔長(zhǎng)勢(shì)明顯比其他兩組要好，相反，增加磷濃度對(duì)石莼的生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用，其適應(yīng)較低的N/P，與表3 中他人研究結(jié)果一致。綜合年際調(diào)查數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，2010 年以前，黃海海域N/P 比值呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，到2010 年上升至最大值110，在2010 年后開(kāi)始出現(xiàn)急劇下降，可能與自2007 年以來(lái)出現(xiàn)的滸苔綠潮有關(guān)，滸苔對(duì)于氮的偏好可能是造成比值出現(xiàn)下降的原因[32]。在本研究調(diào)查期間，蘇北淺灘N/P 平均值在48 左右，可見(jiàn)該比值十分適宜滸苔生長(zhǎng)。但實(shí)驗(yàn)室共培養(yǎng)結(jié)果表明石莼具有更高的生長(zhǎng)速率，與實(shí)際海區(qū)情況相反，說(shuō)明在此設(shè)置條件下?tīng)I(yíng)養(yǎng)鹽可能不是決定二者競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果的單一因子，而是滸苔組織結(jié)構(gòu)及其對(duì)光照的適應(yīng)性等幾者耦合的結(jié)果。本研究證實(shí)了在營(yíng)養(yǎng)鹽因子方面，黃海海域N/P 水平確實(shí)更適合滸苔的生長(zhǎng)，這為滸苔大規(guī)模暴發(fā)提供了可能性。

圖 3 不同N/P 條件下單獨(dú)培養(yǎng)石莼的濕重（a、b）及直徑（c、d）變化Fig. 3 Changes in wet weight (a, b) and diameter (c, d) of U. lactuca under different N/P conditions of pure culture

表 2 單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)滸苔和石莼的相對(duì)生長(zhǎng)速率Table 2 Relative growth rate of U. prolifera and U. lactuca under pure culture and mixed culture

表 3 石莼屬生長(zhǎng)最適氮磷比歷史研究統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics on the optimum N/P for growth of Ulva

圖 4 不同N/P 條件下共培養(yǎng)滸苔的濕重和分枝長(zhǎng)度及石莼的濕重和直徑隨時(shí)間的變化情況Fig. 4 Changes in wet weight and branch length of U. prolifera, and wet weight and diameter of U. lactuca under different N/P conditions of pure culture

5 結(jié)論

（1）滸苔單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，在一定范圍內(nèi)高N/P 能促進(jìn)滸苔的生長(zhǎng)，氮對(duì)于滸苔的影響大于磷。

（2）石莼單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，低N/P 下石莼長(zhǎng)勢(shì)最好，但改變N/P 對(duì)石莼的影響并不顯著。

（3）滸苔和石莼共培養(yǎng)時(shí)，滸苔生長(zhǎng)受到了一定限制，低N/P 下滸苔生長(zhǎng)受限更顯著。

（4）蘇北淺灘海域高氮磷比值更適合滸苔的生長(zhǎng)，可能是滸苔綠潮能夠大規(guī)模暴發(fā)的原因之一。