張偉彪，顧亞萍*，曾定玲，王瑞，林慧純，尹義捐，方長發(fā)

1(深圳市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測中心，廣東 深圳，518040)2(廣東省市場監(jiān)督管理局食用農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳，518040)3(深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳，518055)

目前的農(nóng)藥殘留檢測(以蔬菜水果中農(nóng)藥殘留檢測為主)有兩個(gè)趨勢，即儀器檢測高通量化和樣品前處理簡便快速化，檢測時(shí)常用ESI源(或EI源)配合串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀，即液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS-MS)和氣相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀(gas chromatography mass spectrometry，GC-MS-MS)，而在前處理時(shí)常使用QuEChERS法[分散固相萃取法， quick(快速)，easy(簡單)，cheap(經(jīng)濟(jì))，effective(高效)，rugged(可靠)，safe(安全)]。以LC-MS-MS檢測為例，QuEChERS處理后的樣品，常用乙腈[1-4]、乙腈+水(體積比1∶1)[5-8]和甲醇+水(體積比1∶1)[9-10]作為樣品定容溶劑。在高通量檢測時(shí)，農(nóng)藥之間、農(nóng)藥和溶劑之間的相互作用勢必將成為制約樣品檢測穩(wěn)定性的一個(gè)重要因素。不同有機(jī)溶劑對溶質(zhì)穩(wěn)定性的影響，國內(nèi)僅有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室做過一些研究，大多在氣相色譜儀上，且針對的化合物較少[11-15]，對多種有機(jī)化合物在LC-MS-MS上的穩(wěn)定性研究幾乎為空白。本文首次將樣品定容溶劑作為檢測過程的一個(gè)關(guān)鍵控制點(diǎn)進(jìn)行分析探討，從檢測中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和加標(biāo)基質(zhì)的角度，考察LC-MS-MS分析檢測中定容溶劑對于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和加標(biāo)基質(zhì)長時(shí)間穩(wěn)定性的影響，在此基礎(chǔ)上探討標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定容溶劑對于樣品測定結(jié)果準(zhǔn)確度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用韭菜和橙子(韭菜中色素較多，橙子中有機(jī)酸較多，都屬于檢測中基質(zhì)效應(yīng)較高的蔬菜水果品種)經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測后得到的空白樣品，其中橙子中含有一定濃度的噻菌靈，實(shí)驗(yàn)時(shí)扣除樣品本底值后進(jìn)行計(jì)算。所有樣品經(jīng)打漿裝瓶后冷凍于-18 ℃條件下備用。

98種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(1 000 mg/L)：涕滅威亞砜、涕滅威砜、多菌靈、吡蟲啉、滅多威、啶蟲脒、涕滅威、3-羥基克百威、克百威、甲萘威、除蟲脲、滅幼脲、辛硫磷、阿維菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、烯酰嗎啉、嘧菌酯、噻蟲嗪、氟啶脲、咪鮮胺、甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧樂果、樂果、敵敵畏、三唑磷、二嗪磷、甲拌磷、甲拌磷亞砜、甲拌磷砜、伏殺硫磷、丙溴磷、毒死蜱、滅蠅胺、甲霜靈、霜霉威、多效唑、氯蟲苯甲酰胺、醚菊酯、蟲酰肼、吡唑醚菌酯、磷胺、蠅毒磷、滅線磷、敵百蟲、殺撲磷、硫環(huán)磷、茚蟲威、克螨特、殺蟲脒、霜脲氰、抗蚜威、仲丁威、內(nèi)吸磷、乙霉威、硫線磷、精甲霜靈、四螨嗪、噻嗪酮、氟硅唑、聯(lián)苯三唑醇、甲基硫菌靈、噻螨酮、啶氧菌酯、精氟吡甲禾靈、唑蟲酰胺、螺螨酯、唑螨酯、氟酰脲、多殺菌素、氟苯脲、氟蟲脲、噻蟲胺、噻蟲啉、丙環(huán)唑、殺線威、呋蟲胺、粉唑醇、甲基硫環(huán)磷、治螟磷、特丁硫磷、特丁硫磷亞砜、特丁硫磷砜、噻菌靈、纈霉威、異菌脲、氟蟲腈、氟蟲腈亞砜、氟甲腈、氟蟲腈砜、馬拉硫磷、亞胺硫磷、嗪胺靈、殺螟硫磷、稻豐散、喹硫磷、戊菌唑和氯唑磷，均購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測所；甲醇、乙腈(均為色譜純)，德國默克公司；NaCl(分析純)，西隴化工股份有限公司；甲酸、乙酸銨(均為優(yōu)級純)，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水；PSA粉(N-丙基乙二胺固相吸附劑)，購于安捷倫有限公司。

樣品提取液上機(jī)前經(jīng)0.22 μm的聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene，PTFE)濾膜過濾至2 mL HP小瓶中。

1.2 儀器與設(shè)備

XEVO TQ-S液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(軟件為Masslynx)，美國Waters公司；N-EVAP 112氮吹儀，美國Organomation Associates公司；Elix5純水機(jī)，美國Millipore公司；XH-B旋渦混合器，江蘇省姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司；TG16G臺式高速離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；AS30600BDT超聲波清洗器，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；濾膜和HP小瓶，安捷倫科技有限公司；HY-5回旋式振蕩器，江蘇省金壇市宏華儀器廠；自動勻漿機(jī)AUTO-HOMOGEZER，Hestix Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液A和B(20 mg/L)：將98種農(nóng)藥分為2組(A和B)，其中A組包括阿維菌素、多菌靈、除蟲脲、吡蟲啉、滅幼脲、辛硫磷、啶蟲脒、克百威、3-羥基克百威、滅多威、甲萘威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、涕滅威、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、烯酰嗎啉、嘧菌酯、噻蟲嗪、氟啶脲、咪鮮胺、甲拌磷亞砜、甲拌磷砜、殺螟硫磷、敵敵畏、甲拌磷、伏殺硫磷、乙酰甲胺磷、毒死蜱、丙溴磷、氧樂果、甲胺磷、樂果、二嗪磷、三唑磷、滅蠅胺、甲霜靈、霜霉威、多效唑、氯蟲苯甲酰胺、醚菊酯、蟲酰肼、吡唑醚菌酯和丙環(huán)唑；B組包括呋蟲胺、殺線威、甲基硫環(huán)磷、殺蟲脒、噻蟲胺、噻菌靈、敵百蟲、霜脲氰、噻蟲啉、硫環(huán)磷、磷胺、甲基硫菌靈、抗蚜威、嗪胺靈、粉唑醇、精甲霜靈、殺撲磷、亞胺硫磷、內(nèi)吸磷、仲丁威、特丁硫磷砜、特丁硫磷亞砜、乙霉威、馬拉硫磷、氯唑磷、丙森鋅、滅線磷、氟甲腈、異菌脲、氟硅唑、氟蟲腈、啶氧菌酯、稻豐散、氟蟲腈硫醚、喹硫磷、戊菌唑、治螟磷、氟蟲腈砜、蠅毒磷、多殺菌素、聯(lián)苯三唑醇、四螨嗪、茚蟲威、精氟吡甲禾靈、硫線磷、氟酰脲、特丁硫磷、氟苯脲、唑蟲酰胺、噻嗪酮、噻螨酮、氟蟲脲、克螨特、唑螨酯和螺螨酯。

2組各準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1.00 mL于50.00 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于-18 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液A和B各0.10 mL于25.00 mL容量瓶中，用甲醇+水(體積比1∶1)定容至刻度線，現(xiàn)配現(xiàn)用。

5 mmol/L乙酸銨+0.5%甲酸溶液：準(zhǔn)確稱取乙酸銨0.196 g，移取0.25 mL甲酸，加水稀釋到500 mL，經(jīng)超聲波清洗器脫氣5 min用于儀器流動相用。

甲醇+水(體積比1∶1)。

乙腈+水(體積比1∶1)。

1.3.2 樣品處理

將冷凍樣品常溫下解凍，充分?jǐn)噭?。?zhǔn)確稱取樣品(10±0.1) g于50 mL尖底塑料離心管中，加入20 mL乙腈12 000 r/min勻漿2 min。再加入NaCl 3 g，置于搖床下振蕩30 min，使充分溶解。將該離心管置于高速離心機(jī)中在5 000 r/min離心5 min后，移取上清液2 mL于15 mL離心管中，加入0.1 g PSA置于旋渦混合器上混合1 min，再次置于高速離心機(jī)中在4 000 r/min離心1 min。

取上清液1 mL于氮吹儀上50 ℃條件下吹干，可得到各類樣品基質(zhì)。

1.3.3 三種溶劑中98種農(nóng)藥穩(wěn)定性的研究

準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液A和B(20 mg/L)各0.10 mL于25.00 mL容量瓶中，分別使用乙腈、乙腈+水(體積比1∶1)和甲醇+水(體積比1∶1)定容，得到3種混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(0.080 μg/mL)。

1.3.4 兩種基質(zhì)中3種溶劑對98種農(nóng)藥穩(wěn)定性的影響

韭菜和橙子樣品經(jīng)1.3.2處理后，分別用1.3.3的所得的3種混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液定容至2.00 mL，得到韭菜和橙子2種溶劑的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

所有的樣品上機(jī)時(shí)按照標(biāo)準(zhǔn)溶液、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的順序進(jìn)樣，整個(gè)樣品檢測過程中嚴(yán)格控制樣品瓶存放的溫度為4 ℃，以減少樣品瓶中溶劑的揮發(fā)。

1.4 儀器分析條件

1.4.1 液相色譜條件

Acquity UPLC HSS T3色譜柱(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量1 μL(其中乙腈作為溶劑的所有樣品進(jìn)樣量為0.5 μL)；柱溫 40 ℃；樣品室溫度：4 ℃；流動相：A鹽溶液(5 mmol/L乙酸胺+0.05%甲酸溶液)，B甲醇；流動相梯度：0～1 min ，B 10%～10%;2～3 min，B 25%～25%;5～6.5 min，B 45%～60; 7.5～8.5 min，B 60%～75%;9～10 min，B 80%～90%;11～12 min，B 90%～10%; 12～14 min，B 10%～10%。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離(electrospray ionization，ESI)：ESI+/ESI-電離模式；毛細(xì)管電壓:3.5 kV;干燥氣溫度：450 ℃;干燥氣流速:900 L/h:錐孔氣流速:150 L/h;霧化壓力:7 Bar;碰撞氣流速:0.15 mL/min。

98種農(nóng)藥質(zhì)譜檢測參數(shù)詳見表1。

表1 98種農(nóng)藥的液質(zhì)質(zhì)多離子掃描檢測參數(shù)

續(xù)表1

續(xù)表1

2 結(jié)果與分析

2.1 三種溶劑中98種農(nóng)藥穩(wěn)定性的研究

3種溶劑乙腈、乙腈+水和甲醇+水作為常用的定容溶劑，在LC-MS-MS檢測中都有廣泛的使用。

其中乙腈本身就是QuEChERS方法的提取溶劑，使用其作為樣品定容溶劑直接上機(jī)，可省去前處理的吹干和溶劑置換的步驟，因而常在檢測方法中被推薦使用。但在反相色譜系統(tǒng)中，樣品的溶劑乙腈洗脫強(qiáng)度高于作為流動相的甲醇和乙腈的水溶液，因此樣品在洗脫過程中會溶解在洗脫能力較弱的流動相中，這樣就會造成色譜峰的展寬或分叉，引起柱效降低等一系列問題，進(jìn)而導(dǎo)致分析方法準(zhǔn)確性和精密度下降。

而乙腈+水(體積比1∶1)和甲醇+水(體積比1∶1)作為定容溶劑時(shí)，能很好地降低極性化合物，如滅蠅胺、甲胺磷、乙酰甲胺磷和氧樂果的溶劑效應(yīng)，減少峰的展寬，提高色譜峰的對稱性，因而也常用于各類檢測方法[16]。

高通量檢測本身由于其能實(shí)現(xiàn)上百種農(nóng)藥的同時(shí)檢測，因此常被視為農(nóng)藥殘留檢測的發(fā)展方向，因此在參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢測時(shí)，上百種農(nóng)藥配制形成的標(biāo)準(zhǔn)溶液常被用于此[17-20]。

參照日常檢測過程對上述樣品分別進(jìn)行上機(jī)檢測，間隔11 h對3種溶劑中98種農(nóng)藥峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，考察溶劑在多農(nóng)藥檢測中的作用。

其中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣2次，取平均值，某時(shí)間段的穩(wěn)定性計(jì)算如公式(1)所示：

某時(shí)間段的穩(wěn)定性/%

(1)

3種溶劑中98種農(nóng)藥11 h的穩(wěn)定性如圖1所示。

圖1 三種溶劑中農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性比較(間隔11 h)

由圖1的結(jié)果可知，甲醇+水(體積比1∶1)中這98種農(nóng)藥的穩(wěn)定性最好，在11 h內(nèi)，除了四螨嗪、氟苯脲、殺撲磷和異菌脲以外，其他所有農(nóng)藥前后2次峰面積的比值都在10%以內(nèi)。4種不穩(wěn)定的農(nóng)藥中，呈現(xiàn)峰面積降低和上升2種趨勢，其中四螨嗪和殺撲磷分別降解60.8%和10.2%，異菌脲和氟苯脲分別上升12.6%和21.2%。

乙腈+水(體積比1∶1)中這98種農(nóng)藥的穩(wěn)定性次之，在11 h內(nèi)，農(nóng)藥前后2次峰面積的比值大于10%的有四螨嗪、殺撲磷、阿維菌素、殺螟硫磷、特丁硫磷和氟苯脲。其中，四螨嗪和殺撲磷分別降解29.1%和16.7%，阿維菌素、殺螟硫磷、特丁硫磷和氟苯脲分別上升10.5%、16.0%、38.2%和82.7%。

乙腈中這98種農(nóng)藥的穩(wěn)定性最差，在11 h內(nèi)，農(nóng)藥前后2次峰面積的比值大于10%的包括氧樂果、殺螟硫磷、乙霉威、螺螨酯和吡蟲啉等49種。其中氧樂果、殺螟硫磷、甲基硫菌靈、醚菊酯、伏殺硫磷、甲拌磷亞砜、霜霉威、甲胺磷、氟蟲腈、甲拌磷、氟蟲腈亞砜、四螨嗪、氟酰脲、乙酰甲胺磷、氟苯脲、氟蟲腈砜、滅蠅胺、噻嗪酮和甲拌磷砜分別降解12.2%、12.7%、12.8%、12.8%、13.4%、13.7%、14.6%、20.4%、22.6%、26.4%、27.0%、29.1%、29.3%、33.1%、38.2%、46.6%、47.1%、65.8%和76.1%，乙霉威、螺螨酯、吡蟲啉、氟啶脲、甲基硫環(huán)磷、特丁硫磷亞砜、喹硫磷、丙森鋅、噻螨酮、噻菌靈、氟甲腈、二嗪磷、滅線磷、噻蟲胺、辛硫磷、敵百蟲、茚蟲威、烯酰嗎啉、氟蟲脲、殺蟲脒、噻蟲啉、多菌靈、唑螨酯、霜脲氰、多殺菌素、馬拉硫磷、阿維菌素、蠅毒磷、特丁硫磷、異菌脲分別上升10.2%、10.5%、10.5%、10.6%、10.6%、10.6%、10.9%、11.2%、11.5%、12.0%、12.6%、13.0%、13.1%、13.3%、13.5%、14.3%、14.4%、15.2%、15.3%、15.9%、18.3%、20.0%、20.1%、20.9%、24.8%、27.7%、31.4%、34.8%、54.4%和58.3%。

2.2 兩種基質(zhì)中3種溶劑對98種農(nóng)藥穩(wěn)定性的影響

參照日常檢測過程對上述樣品分別進(jìn)行上機(jī)檢測，間隔3 h對韭菜和橙子中3種溶劑中98種農(nóng)藥峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

各溶劑中某時(shí)間段的基質(zhì)標(biāo)樣穩(wěn)定性計(jì)算公式如公式1所示。

韭菜和橙子基質(zhì)中，乙腈、乙腈+水(體積比1∶1)和甲醇+水(體積比1∶1)中98種農(nóng)藥3 h的穩(wěn)定性如圖2和圖3所示。

圖2 韭菜基質(zhì)中3種溶劑的98種農(nóng)藥穩(wěn)定性比較(間隔3 h)

圖3 橙子基質(zhì)中3種溶劑的98種農(nóng)藥穩(wěn)定性比較(間隔3 h)

韭菜基質(zhì)中3種溶劑中絕大部分3 h內(nèi)農(nóng)藥穩(wěn)定性偏差都在10%以內(nèi)，穩(wěn)定性較差的農(nóng)藥分別如下：甲醇+水(體積比1∶1)中殺螟硫磷和四螨嗪分別降解10.3%和19.8%。乙腈+水(體積比1∶1)中四螨嗪降解18.4%，殺螟硫磷、特丁硫磷和氟苯脲分別上升19.3%、18.5%和58.9%。乙腈中阿維菌素、氟蟲腈和四螨嗪分別降解10.5%、13.3%和17.3%，氟苯脲和殺螟硫磷分別上升31.3%和32.5%。

橙子基質(zhì)中3種溶劑中絕大部分3 h內(nèi)農(nóng)藥穩(wěn)定性偏差都在10%以內(nèi)，穩(wěn)定性較差的農(nóng)藥分別如下：甲醇+水(體積比1∶1)中殺螟硫磷降解27.0%，氟蟲腈和氟蟲腈砜分別上升15.8%和13.6%。乙腈中殺撲磷和四螨嗪分別降解11.5%和20.3%，異菌脲和阿維菌素分別上升12.5%和15.4%。

3 結(jié) 論

本文從溶劑入手，考察不同溶劑配制混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、2種農(nóng)作物基質(zhì)中不同溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中多種農(nóng)藥峰面積的穩(wěn)定性。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)3種常用的溶劑穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甲醇+水(體積比1∶1)作為溶劑在樣品定容時(shí)穩(wěn)定性更佳，在11 h內(nèi)能使絕大多數(shù)農(nóng)藥峰面積變化保證在10%以內(nèi)，保證定量結(jié)果的相對可靠。乙腈本身就是QuEChERS方法的提取溶劑，而其作為上機(jī)溶劑可省去前處理的吹干和溶劑置換的步驟，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙腈作為溶劑配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液，檢測結(jié)果穩(wěn)定性最差，在檢測過程中應(yīng)注意觀察其穩(wěn)定性。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在不同溶劑中不穩(wěn)定的原因較為復(fù)雜，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的物理性質(zhì)、溶劑pH等性質(zhì)等都有可能影響其穩(wěn)定性，本文未對其原理進(jìn)行研究。

2種基質(zhì)(韭菜和橙子)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性結(jié)果表明，檢測時(shí)間和基質(zhì)對農(nóng)藥的穩(wěn)定性也有作用，與韭菜基質(zhì)相比，橙子基質(zhì)對農(nóng)藥穩(wěn)定性的幫助更大。

從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性出發(fā)，為保證檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，建議檢測時(shí)應(yīng)結(jié)合實(shí)際注意檢測時(shí)長和樣品溶劑，并使用基質(zhì)標(biāo)樣對樣品進(jìn)行分類檢測，以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。