王廣浩，高紅波，樊雙喜，李國(guó)輝，鐘其頂*，李艷

1(河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊，050018)2(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015)3(全國(guó)食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京，100015)

甘油，又名丙三醇，是葡萄酒中一種重要的組成成分。在發(fā)酵初期，葡萄汁中的糖含量較高，導(dǎo)致環(huán)境滲透壓較高，發(fā)酵過(guò)程不能正常進(jìn)行，因此酵母菌會(huì)產(chǎn)生甘油來(lái)消除這種不利因素的影響[1-2]。葡萄酒中甘油的含量受酵母菌種[3-5]、含糖量[6-7]、溫度[8-9]等因素的影響。在發(fā)酵過(guò)程中，葡萄汁中約有92%的糖經(jīng)過(guò)酒精發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，剩下8%發(fā)酵產(chǎn)生甘油[10]，因此除水和乙醇外，甘油是葡萄酒中含量最多的物質(zhì)[11-12]。葡萄酒中的甘油能改善葡萄酒的口感[13-14]，提高葡萄酒中的甘油含量能明顯改進(jìn)葡萄酒的質(zhì)量[15-16]。在利益驅(qū)動(dòng)作用下，人為添加甘油來(lái)提升葡萄酒質(zhì)量的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，這不僅擾亂了葡萄酒市場(chǎng)的良好秩序，對(duì)消費(fèi)者的利益也造成了損害。

目前檢測(cè)葡萄酒中甘油含量的方法有高效液相色譜法[17-18]、高碘酸鈉氧化法[19-20]、分光光度法[21]、甘油激酶法[22-23]等，通過(guò)測(cè)定甘油與乙醇的比例[24]或甘油與有機(jī)酸的比例[18]判斷葡萄酒中是否添加了外源甘油，但不能確定外源甘油的來(lái)源，對(duì)外源甘油摻假判定存在局限性。葡萄酒中的外源甘油可分為工業(yè)甘油和純化甘油[25]。用甲醇使動(dòng)植物中的甘油三酯發(fā)生酯交換生成的工業(yè)甘油中含有副產(chǎn)物3-甲氧基-1,2-丙二醇(3-methoxypropane-1,2-diol, 3-MPD)，石油化學(xué)品合成的工業(yè)甘油中會(huì)出現(xiàn)雜質(zhì)環(huán)二甘油(cyclic diglycerols，CycDs)(包括6種同分異構(gòu)體)[10]。因此，通過(guò)對(duì)3-MPD和CycDs的檢測(cè)，可以判定葡萄酒中是否添加外源工業(yè)甘油。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

碳酸鉀(分析純)、無(wú)水乙醇(分析純),北京化工廠；乙醚(分析純),北京市通廣精細(xì)化工公司；分子篩、丁烷-1，4-二醇-1，1，2，2，3，3，4，4-(2H)8(純度99%),美國(guó)Sigma-Aldrich；環(huán)二甘油混合物[純度89.3%，包括：順式-，反式-2，6-二(羥甲基)1，4-二氧雜六環(huán)；順式-，反式-2，5-二(羥甲基)1，4-二氧六環(huán)；順式-，反式-2-二(羥甲基)-6-羥基-1，4-二氧環(huán)庚烷]、比對(duì)葡萄酒樣品(編號(hào)1、2、3，其中1、3為干型白葡萄酒，2為甜型桃紅葡萄酒)，德國(guó)BfR實(shí)驗(yàn)室提供；3-甲氧基-1，2-丙二醇(純度98%),日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社。

1.2 儀器與設(shè)備

GC/MS-QP2010 Plus島津氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；XS205電子分析天平，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；MX-S渦旋振蕩器，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司；3K15高速離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取3-MPD標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg、丁烷-1，4-二醇-1，1，2，2，3，3，4，4-(2H)8標(biāo)準(zhǔn)品(內(nèi)標(biāo)，Internal Standard，IS)10.00 mg、CycDs標(biāo)準(zhǔn)品11.20 mg，分別轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加入無(wú)水乙醇定容至刻度，充分混勻，配制成S0儲(chǔ)備液(質(zhì)量濃度為1 000 mg/L)。

準(zhǔn)確移取1.00 mL上述 S0儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，充分混勻，配制成S1工作液(質(zhì)量濃度為100 mg/L)。

準(zhǔn)確移取0.10 mL上述 S0儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，充分混勻，配制成S2工作液(質(zhì)量濃度為10 mg/L)。

所需配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液如表1所示。

論電商平臺(tái)專利侵權(quán)中有效通知的法律要件——兼評(píng)最高人民法院第83號(hào)指導(dǎo)案例............................................................................................武善學(xué) 01.59

表1 所需標(biāo)準(zhǔn)溶液

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

在不含目標(biāo)物質(zhì)的葡萄酒樣品中加入配制好的不同質(zhì)量濃度、不同體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入的標(biāo)準(zhǔn)溶液編號(hào)、體積及每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)(matrix calibration level, ML 0～5)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度如表2所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

1.3.3 樣品前處理

準(zhǔn)確移取10 mL葡萄酒樣品和100 μL內(nèi)標(biāo)S1工作液(標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的配制過(guò)程已加入等量?jī)?nèi)標(biāo)，無(wú)需進(jìn)行此步驟)至50 mL離心管中。加入10 g K2CO3，渦旋混勻，待K2CO3完全溶解后，冷水降溫至20 ℃左右，加入1 mL乙醚，渦旋5 min。4 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min，取上清液，加入約120 mg分子篩，加蓋保持2 h，期間不時(shí)搖勻。取上清液至氣相色譜進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)分析。

1.3.4 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：ZB-Wax plus毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm，0.15 μm膜厚)；升溫程序：90 ℃保持2 min，以10 ℃/min升溫至158 ℃，保持6 min，再以4 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min，總采集時(shí)間為42.8 min，進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為氦氣，流速1 mL/min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；離子源溫度230 ℃；選擇離子檢測(cè)模式：0～25 min，m/z75，m/z78，m/z61；25～40 min，m/z57，m/z117。

3-MPD定量離子為m/z75，內(nèi)標(biāo)定量離子為m/z78，CycDs定量離子為m/z117。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱選擇

分析對(duì)比DB-Wax plus毛細(xì)管柱(60 m×0.32 mm，0.25 μm膜厚)、ZB-Wax plus毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm膜厚)、ZB-Wax plus毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm，0.15 μm膜厚)3種色譜柱的分離性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種色譜柱對(duì)3-MPD和內(nèi)標(biāo)的分離效果良好，便于定量，但對(duì)CycDs的6種組分的分離效果有顯著差異：使用前2種色譜柱時(shí)不能將CycDs的6個(gè)組分完全分離，使用ZB-Wax plus毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm，0.15 μm膜厚)能夠?qū)⒛繕?biāo)物質(zhì)完全分離，峰形良好，如圖1所示。

a-DB-Wax(60 m×0.32 mm×0.25 μm);b-ZB-Wax(60 m×0.25 mm×0.25 μm);c-ZB-Wax(60 m×0.25 mm×0.15 μm)圖1 不同色譜柱CycDs(10.00 mg/L)色譜圖

2.2 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 線性方程和檢出限

以3-MPD峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比作為縱坐標(biāo)，以葡萄酒中3-MPD質(zhì)量濃度作橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；以CycDs峰面積之和與內(nèi)標(biāo)峰面積之比作為縱坐標(biāo)，以葡萄酒中CycDs質(zhì)量濃度作橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程與R2如表3所示。由表3可

表3 3-MPD和CycDs線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、LOD和LOQ

知，3-MPD和CycDs線性方程分別是y=1.057 2x、y=1.490 3x，R2均>0.999。以3倍信噪比計(jì)算儀器的檢出限(limit of detection,LOD)，10倍信噪比計(jì)算儀器的定量限(limit of quantitation,LOQ)，3-MPD的檢出限和定量限為0.02、0.06 mg/L，CycDs的檢出限和定量限為0.08、0.28 mg/L。

2.2.2 回收率

在實(shí)驗(yàn)室選擇一款不含3-MPD和CycDs的空白葡萄酒樣品。按照0.20、0.40、0.60 mg/L 3個(gè)水平在空白葡萄酒樣品中加入3-MPD標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照 0.50、1.00、1.50 mg/L 3個(gè)水平在空白葡萄酒樣品中加入CycDs標(biāo)準(zhǔn)工作液。每個(gè)水平進(jìn)行了6次測(cè)定，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表4所示。由表4可知，當(dāng)樣品中3-MPD加標(biāo)水平在0.20～0.60 mg/L時(shí)，平均回收率為97.50%～101.11%，RSD為1.70%～6.28%；當(dāng)樣品中CycDs加標(biāo)水平在0.50～1.50 mg/L時(shí)，平均回收率為100.33%～104.67%，RSD為1.46%～7.09%，表明該方法回收率良好。

表4 樣品加標(biāo)回收率(n=6)

2.2.3 精密度分析

選取比對(duì)葡萄酒樣品1，經(jīng)1.3.3處理后，同一天重復(fù)測(cè)定5次，取平均值，分析方法的日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定5 d，每天測(cè)定5次取平均值，分析方法的日間精密度，結(jié)果如表5所示。由表5可知，對(duì)于3-MPD，方法的日內(nèi)精密度和日間精密度分別為 2.05%和4.14%；對(duì)于CycDs，方法的日內(nèi)精密度和日間精密度分別為1.18%和2.82%。

表5 方法日間與日內(nèi)精密度(n=5)

2.3 實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果比對(duì)

德國(guó)聯(lián)邦風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究所(Bundesinstitut für Risikobewertung，BfR)是德意志聯(lián)邦共和國(guó)公法認(rèn)定的聯(lián)邦直屬有權(quán)利能力的機(jī)構(gòu)，其主要研究領(lǐng)域?yàn)槭称钒踩?、產(chǎn)品安全以及化學(xué)品安全，與多個(gè)國(guó)際性組織和機(jī)構(gòu)展開科研合作。本實(shí)驗(yàn)室與BfR對(duì)同樣的3個(gè)葡萄酒樣品(編號(hào)1、2、3)中可能存在的兩類外源工業(yè)甘油副產(chǎn)物3-MPD、CycDs進(jìn)行了定量測(cè)定，按照1.3進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品溶液和標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制，3個(gè)比對(duì)樣品經(jīng)過(guò)前處理后連續(xù)測(cè)定3次，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算2種物質(zhì)的含量，結(jié)果如表6所示。

由表6可知，1號(hào)樣品和3號(hào)樣品均檢出3-MPD和CycDs，2號(hào)樣品兩類目標(biāo)物質(zhì)均未檢出。1號(hào)樣品3-MPD平均含量為0.21 mg/L，CycDs平均含量為0.47 mg/L。3號(hào)樣品3-MPD平均含量為0.80 mg/L，CycDs平均含量為0.98 mg/L。2個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異(P>0.05)，表明該方法能夠?qū)崿F(xiàn)葡萄酒中3-MPD和CycDs含量的準(zhǔn)確測(cè)定。此外，本實(shí)驗(yàn)室與BfR對(duì)不同顏色、不同含糖量的葡萄酒樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示該方法適用于不同顏色、不同含糖量的葡萄酒中外源工業(yè)甘油副產(chǎn)物的檢測(cè)。

表6 實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)結(jié)果 單位：mg/L

3 結(jié)論

本研究驗(yàn)證了一種氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定葡萄酒中外源工業(yè)甘油副產(chǎn)物3-MPD和CycDs含量的方法。方法學(xué)評(píng)價(jià)顯示，3-MPD在0.10～2.00 mg/L線性良好，方法檢出限為0.02 mg/L，加標(biāo)回收率為97.50%～101.11%，日內(nèi)精密度與日間精密度分別為2.05%與4.14%；CycDs在0.50～4.00 mg/L線性良好，方法檢出限為0.08 mg/L，加標(biāo)回收率為100.33%～104.67%，日內(nèi)精密度與日間精密度分別為1.18%與2.82%，方法精密度和準(zhǔn)確度良好；與BfR對(duì)比，2個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異(P>0.05)，表明該方法能夠?qū)崿F(xiàn)3-MPD和CycDs含量的準(zhǔn)確測(cè)定。

本研究實(shí)現(xiàn)了國(guó)內(nèi)首次對(duì)葡萄酒中外源工業(yè)甘油副產(chǎn)物的定量檢測(cè)，由于外源工業(yè)甘油中3-MPD和CycDs的含量尚不明確，無(wú)法通過(guò)兩類副產(chǎn)物的含量反映葡萄酒中非法添加的外源工業(yè)甘油的含量，但葡萄酒的發(fā)酵過(guò)程中不會(huì)產(chǎn)生3-MPD和CycDs，因此該方法仍是檢驗(yàn)葡萄酒中甘油真實(shí)性強(qiáng)有力的工具[10]。國(guó)外已有研究表明，葡萄酒釀造過(guò)程中酶處理時(shí)所使用的試劑中可能含有工業(yè)甘油，會(huì)導(dǎo)致成品葡萄酒中含有一定量的3-MPD或CycDs，基于此情況，德國(guó)葡萄酒管理部門對(duì)于葡萄酒中外源工業(yè)甘油副產(chǎn)物3-MPD的強(qiáng)制執(zhí)行限量規(guī)定為0.10 mg/L，對(duì)CycDs強(qiáng)制執(zhí)行限量規(guī)定為0.50 mg/L。分析表明，我國(guó)仍需健全葡萄酒真實(shí)性分析方法，進(jìn)一步完善葡萄酒真實(shí)性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系，加強(qiáng)國(guó)內(nèi)葡萄酒的生產(chǎn)管理和中國(guó)葡萄酒市場(chǎng)管理，防范摻假葡萄酒進(jìn)入國(guó)內(nèi)市場(chǎng)，保護(hù)消費(fèi)者合法權(quán)益，營(yíng)造良好的國(guó)內(nèi)葡萄酒市場(chǎng)環(huán)境。