■楊明容 李 達(dá) 江俊勇 許 彥 李安東

（江西生物科技職業(yè)學(xué)院，江西南昌330200）

腐植酸(humic acid, HA)是動(dòng)植物殘?bào)w經(jīng)過微生物的分解和轉(zhuǎn)化，以及地球物理化學(xué)的一系列作用形成的一類高分子有機(jī)物質(zhì)，成分復(fù)雜，不溶于水，存在于風(fēng)化煤、泥炭和褐煤及湖泊、海洋的沉積之中[1]。腐植酸作為一種能促進(jìn)動(dòng)物營養(yǎng)素利用、增強(qiáng)機(jī)體免疫力及抗應(yīng)激、改善動(dòng)物健康與生產(chǎn)性能的大分子天然產(chǎn)物[2-3]，在畜牧業(yè)、水產(chǎn)業(yè)中廣泛應(yīng)用。腐植酸用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，主要是三種形態(tài)，即腐植酸、腐植酸鈉(sodium humate)和黃腐酸(fulvic acid)[4]。腐植酸鈉是腐植酸的鈉鹽，為黑色無定形粉末或黑色有光澤顆粒，在空氣中穩(wěn)定，水溶液呈弱堿性，2013年增補(bǔ)進(jìn)入《飼料原料目錄》，具有綠色環(huán)保、無殘留、抗菌、抗病毒、消炎、抑制腐敗菌繁殖、促進(jìn)營養(yǎng)素吸收等優(yōu)點(diǎn)，可以提高水產(chǎn)動(dòng)物的產(chǎn)量，改善養(yǎng)殖環(huán)境水質(zhì)，減輕或防止重金屬對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的毒害，減少疾病和污染，促進(jìn)有益菌生長，增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物免疫力等[4-5]。研究表明，飼料中添加0.3%的腐植酸鈉，有效地改善了青蝦(Macrobrachium nipponense)的生產(chǎn)性能[6]；吉富羅非魚幼魚(Oreochromis niloticus, GIFT)投喂在基礎(chǔ)飼料中分別添加0、0.1%、0.2%、0.4%和0.6%的腐植酸鈉的飼料9 周，二階多項(xiàng)式回歸分析結(jié)果表明, 添加0.28%～0.37%的腐植酸鈉可提升吉富羅非魚幼魚的消化功能、改善其生長性能、增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力、強(qiáng)化機(jī)體的免疫力和促進(jìn)健康[7]。然而迄今為止，有關(guān)飼料中添加腐植酸鈉對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生長、抗氧化和免疫等影響及作用機(jī)理的研究較少。

臺(tái)灣泥鰍(Paramisgurnus dabryanus)是一種優(yōu)質(zhì)淡水雜食性經(jīng)濟(jì)魚類，肉鮮味美，富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪酸、多種礦物元素及B 族維生素，具有一定的醫(yī)療保健作用，深受消費(fèi)者青睞，是淡水魚中食藥兩用的佳品。由于臺(tái)灣泥鰍規(guī)?；别B(yǎng)殖技術(shù)的突破、配合飼料的開發(fā)，極大地推進(jìn)其養(yǎng)殖的綠色發(fā)展。本試驗(yàn)以臺(tái)灣泥鰍幼魚為研究對(duì)象，采用單因素飼養(yǎng)試驗(yàn)，探討飼料中使用腐植酸鈉對(duì)其生長性能和抗氧化的影響，以期為腐植酸鈉在臺(tái)灣泥鰍飼料中的應(yīng)用，降低其飼料成本提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物為臺(tái)灣泥鰍幼魚，購自江西省余江縣宏鑫特種水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，初始體長為(7.29±0.35) cm，初始體質(zhì)量為(3.03±0.15) g。

1.1.2 腐植酸鈉

來源于江西省萍鄉(xiāng)市安華生物科技有限公司，腐植酸含量≥45%，pH值7～8，水溶性≥85%，重金屬含量微量，低于國家標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試驗(yàn)飼料及分組

試驗(yàn)所用基礎(chǔ)飼料為江西格力特生物科技有限公司提供的泥鰍配合飼料，其原料組成包括：魚粉、豆粕、面粉、精煉魚油、豆油、礦物質(zhì)元素、維生素、免疫多糖、抗氧化劑。營養(yǎng)水平為粗蛋白質(zhì)38.5%、粗脂肪4.2%、粗纖維10.8%、粗灰分13.8%、總磷1.2%、賴氨酸2.3%。腐植酸鈉粉碎，過60 目篩，在臺(tái)灣泥鰍基礎(chǔ)飼料中分別使用0、5.0%、10.0%、15.0%和20.0%，混合均勻，制成5 組試驗(yàn)飼料，密封保存于-20 ℃冰箱中。在投喂前按需求稱量后添加適量水分制成軟飼料，分別飼喂對(duì)照組和試驗(yàn)組(見表1)。

表1 試驗(yàn)分組

1.3 飼養(yǎng)管理

臺(tái)灣泥鰍幼魚運(yùn)回江西生物科技職業(yè)學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)訓(xùn)中心試驗(yàn)基地后，經(jīng)2 周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，挑選體格健壯、規(guī)格整齊的幼魚隨機(jī)分為5組，每組3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)30 尾，隨機(jī)分養(yǎng)于網(wǎng)目40 目、規(guī)格為1 m×1 m×0.5 m的圍箱中進(jìn)行為期66 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)，一個(gè)圍箱為一個(gè)重復(fù)，圍箱放置于10 m2的水泥池中，圍箱周圍水深0.5 m，以保持試驗(yàn)環(huán)境與自然環(huán)境的一致。

常規(guī)方法飼養(yǎng)管理，每天投喂2 次(上午9:00 點(diǎn)、下午5:00 點(diǎn))，上午投喂量為臺(tái)灣泥鰍幼魚體質(zhì)量的2.0%，下午投喂量為幼魚體質(zhì)量的3.3%，每天清除殘餌和糞便一次，投喂量視情況酌情增減。每天記錄投喂量、攝食和臺(tái)灣泥鰍幼魚死亡情況。飼養(yǎng)期間水保持流動(dòng)(1.41 m3/h)，水溫23～26 ℃，pH值為7.3±0.2，溶氧≥5.2 mg/l。

1.4 樣品采集

試驗(yàn)開始時(shí)和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)分別采集樣品。66 d飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，先24 h 饑餓處理，然后分別從各養(yǎng)殖圍箱中隨機(jī)取10 尾(每處理組取樣30 尾)臺(tái)灣泥鰍幼魚測(cè)量體長、體質(zhì)量，用于計(jì)算增重率、特定生長率、肥滿度、飼料系數(shù)；每重復(fù)取10 尾(每處理組取樣30 尾)幼魚，斷脊處死，冰盤上解剖取出肝臟，剔除脂肪組織，吸干水分，樣品集中冷凍保存-80 ℃的超低溫冰箱，以備肝臟中抗氧化指標(biāo)測(cè)定；各處理組分別整體計(jì)數(shù)，以計(jì)算其成活率。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 生長性能指標(biāo)計(jì)算

增重率、特定生長率、肥滿度、飼料系數(shù)、成活率的計(jì)算公式如下。

增重率(WGR，%)=100×[(Gt-G0)/G0]

特定生長率(SGR，%/d)=100×[ln(Gt)-ln(G0)]/t

肥滿度(CF，g/cm3)=100×{Gt(g)/[Lt(cm)]3}

飼料系數(shù)(FCR)=攝食量(g)/體重增加量(g)

成活率(SR，%)=100×[試驗(yàn)?zāi)~尾數(shù)(尾)/試驗(yàn)初魚尾數(shù)(尾)]

式中：Lt——試驗(yàn)結(jié)束時(shí)平均體長(cm)；

Gt——試驗(yàn)結(jié)束時(shí)平均體重(g)；

G0——試驗(yàn)開始時(shí)平均體重(g)；

t——試驗(yàn)天數(shù)。

1.5.2 肝臟抗氧化指標(biāo)測(cè)定

肝臟樣品用預(yù)冷的生理鹽水漂洗，除去血液后，濾紙拭干，稱取0.2 g，用準(zhǔn)備好樣品9 倍體積的預(yù)冷生理鹽水勻漿。先將肝臟樣品加入到2/3的預(yù)冷生理鹽水中，用眼科剪剪碎，移入玻璃勻漿機(jī)中，再用剩余1/3 的生理鹽水沖洗殘留的樣品，全部轉(zhuǎn)移入勻漿機(jī)中勻漿。勻漿液在低溫低速離心機(jī)中2 000 r/min 離心10 min，取上清液測(cè)定以下指標(biāo)：過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)等酶活性以及總抗氧化力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量。以上指標(biāo)的測(cè)定采用南京建成生物工程研究所研發(fā)的試劑盒，具體測(cè)定方法參照說明書。

1.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel表進(jìn)行處理，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)”表示。采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件的one-way ANOVA 程序進(jìn)行方差分析，P＜0.05 即認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 腐植酸鈉對(duì)臺(tái)灣泥鰍幼魚生長性能的影響（見表2）

表2 腐植酸鈉對(duì)臺(tái)灣泥鰍幼魚生長性能的影響

從表2 中可見，幼魚的增重率(WGR)和特定生長率(SGR)，D5、D10、D15 組均高于C 組(P＞0.05)，其增重率分別高于C組30.56%、30.17%和40.13%，特定生長率分別高于對(duì)照組19.55%、19.55%和24.06%；D20 組幼魚的增重率高于對(duì)照組57.02%(P＜0.05)，特定生長率高于對(duì)照組33.08%(P＜0.05)。幼魚肥滿度(CF)，D5、D10 組高于 C 組(P＞0.05)，分別比 C 組高 8.96%和7.46%，D15、D20組顯著高于C組(P＜0.05)，分別比C組高11.94%和17.91%。飼料系數(shù)(FCR)，D5、D10、D15組低于 C 組(P＞0.05)，分別比 C 組下降了 27.33%、27.33%和30.80%，D20 組顯著低于C 組(P＜0.05)，比C組下降了38.41%。各組幼魚的成活率(SR)差異不顯著(P＞0.05)，均在 90% 以上，以 C 組 最高，達(dá)到97.78%。

2.2 腐植酸鈉對(duì)臺(tái)灣泥鰍幼魚抗氧化能力的影響（見表3）

表3 腐植酸鈉對(duì)臺(tái)灣泥鰍幼魚抗氧化指標(biāo)的影響

由表3可知，幼魚肝臟CAT活性，D5、D10、D15組和D20組均顯著高于C組(P＜0.05)，D15、D20組顯著高于 D5 組和 D10 組(P＜0.05)。幼魚肝臟 GSH-Px 活性，D10、D15、D20 組顯著高于 C 組(P＜0.05)，D5 組與 C 組差異不顯著(P＞0.05)。D5、D10、D15 組和 D20 組幼魚肝臟SOD 活性和T-AOC 含量均高于C 組，但均差異不顯著(P＞0.05)；腐植酸鈉組的幼魚肝臟中MDA 水平均下降，其中D20 組肝臟中MDA 含量顯著低于D5 和C組(P＜0.05)。

3 討論

3.1 腐植酸鈉對(duì)臺(tái)灣泥鰍幼魚生長性能的影響

腐植酸鈉分子上含有多種酚基、醌等活性基團(tuán)，具有較強(qiáng)的絡(luò)合能力和吸附作用，能增加動(dòng)物食欲、刺激動(dòng)物消化功能，提高飼料營養(yǎng)成分的吸收率，從而促進(jìn)動(dòng)物生長[8]。有關(guān)飼料中添加腐植酸及其鈉鹽生物學(xué)作用的研究與應(yīng)用在家畜和家禽上做了大量的工作，結(jié)果表明，飼料中添加的腐植酸及其鈉鹽可以促進(jìn)畜禽生長，提高飼料利用率，改善腸道健康，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，提升機(jī)體免疫力，維持機(jī)體健康[9-19]。近幾年來，對(duì)腐植酸及其鈉鹽在水產(chǎn)動(dòng)物中的應(yīng)用也開展了一系列有益的探討。研究表明，飼料中添加180～360 mg/kg 的腐植酸[20]、0.8%～1.0%腐植酸[21]和1.0%腐植酸[22]顯著提高了鯉魚(Cyprinus carpio Linn.)的生長速度和飼料利用率。莫桑比克羅非魚(Oreochromis mossambicus)飼料中添加富含腐植酸的Shilajit產(chǎn)品0.4%～0.6%，能顯著提升羅非魚的生長性能和飼料利用[23]，吉富羅非魚幼魚飼料中添加0.28%～0.37%的腐植酸鈉可顯著提升吉富羅非魚幼魚腸道消化酶活性、改善其生長性能(增重、DGC)和飼料利用率(PR、ER)[7]，但是歐洲鱸魚(Dicentrarchus labrax)飼料中添加0.25%～1.5%腐植酸[24]、虹鱒飼料中添加腐植酸0.3%～1.2%[25]或富含腐植酸產(chǎn)品FARMARIN XP?0.1%～0.4%[26]卻均未表現(xiàn)出改善魚生長性能的效果。本試驗(yàn)結(jié)果表明，臺(tái)灣泥鰍幼魚飼料中使用20.0%的腐植酸鈉，能顯著提高其生長性能。這些研究之間的明顯差異可能是由于腐植酸及其鈉鹽的化學(xué)結(jié)構(gòu)、來源和用量不同、以及魚類種類(如雜食性與肉食性)、階段不同以及試驗(yàn)飼料的差異造成的，具體原因有待于進(jìn)一步系統(tǒng)研究。此外，本試驗(yàn)條件下，使用腐植酸鈉組的幼魚增重率升高，而腐植酸鈉較便宜，飼料配方優(yōu)化后不僅不會(huì)增加泥鰍養(yǎng)殖的飼料成本，還會(huì)提高泥鰍的養(yǎng)殖效益。

3.2 腐植酸鈉對(duì)臺(tái)灣泥鰍幼魚抗氧化的影響

眾所周知，魚類的抗氧化防御系統(tǒng)包括抗氧化酶和非抗氧化酶，是機(jī)體防御氧化應(yīng)激的重要物質(zhì)?？偪寡趸芰?T-AOC)指體內(nèi)抗氧化酶體系和抗氧化物質(zhì)體系二者抗氧化能力的總和，丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化作用形成的脂質(zhì)過氧化物，機(jī)體MDA 含量的測(cè)定可以反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度，即機(jī)體受到自由基攻擊的損傷程度，MDA 含量是衡量機(jī)體抗氧化功能的一個(gè)重要因子。機(jī)體抗氧化酶主要包含SOD、CAT、GSH-Px、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)等，非抗氧化酶物質(zhì)是指具有抗氧化作用的小分子化合物，如谷胱甘肽(GSH)、蝦青素、金屬蛋白質(zhì)以及氨基酸、維生素E(Vitamin E，VE)、維生素 C(Vitamin C，VC)、硒、銅等營養(yǎng)素等[27]。任何有關(guān)抗氧化能力的改善的措施都可能增加魚類抗環(huán)境脅迫的能力。腐植酸及其鈉鹽含有官能團(tuán)，包括羥基和酚羥基等大量活性氧基團(tuán)，可激活機(jī)體內(nèi)的SOD、CAT、GSH-Px等，提高機(jī)體的抗氧化能力及免疫功能，減少疾病的發(fā)生[8]。研究表明，吉富羅非魚飼料中添加0.28%～0.37%的腐植酸鈉，通過調(diào)節(jié)抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px、GST)活性和抗氧化物質(zhì)(GSH)含量來調(diào)控羅非魚的抗氧化和抗應(yīng)激防御系統(tǒng)，從而提高羅非魚的抗氧化能力、強(qiáng)化機(jī)體的免疫力和促進(jìn)健康[7]。腐植酸能保護(hù)褐鱒(Salmo truttafario)抗氧化防御系統(tǒng)免受鎘等有毒金屬的損傷，維護(hù)其抗氧化能力[28]，鯉魚飼料中添加腐植酸，可增強(qiáng)其抗氧化能力和免疫力，從而增強(qiáng)機(jī)體抗感染能力[29]。大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus Sauvage)飼料中添加黃腐酸，可以有效增強(qiáng)器官抗應(yīng)激、抗氧化能力，從而維持腸道的健康[30]。鯽魚(Carassius aumtus)飼料中添加0.3%黃腐酸，其血清中的超氧化物歧化酶、溶菌酶和堿性磷酸酶活性顯著提高，有效地提高了其抗氧化能力[31]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，臺(tái)灣泥鰍幼魚飼料中腐植酸鈉能有效增強(qiáng)肝臟CAT、GSH-Px、SOD 等抗氧化酶的活性，提升總抗氧化能力(T-AOC)，降低肝臟中MDA 含量，腐植酸鈉添加10.0%及以上，機(jī)體抗氧化效果提升顯著。由此可見，適量添加腐植酸鈉能有效提升魚類的抗氧化能力。

4 結(jié)論

飼料中適量使用腐植酸鈉可以提高臺(tái)灣泥鰍幼魚的生長性能和抗氧化能力。在本試驗(yàn)條件下，飼料中使用20.0%腐植酸鈉提高泥鰍生長性能效果最好(P＜0.05)；使用量為15%～20%時(shí)，可顯著提高臺(tái)灣泥鰍的抗氧化能力(P＜0.05)。