史亞敏，裴京霞，許幼發(fā),3，顧永衛(wèi),3，武 鑫,3,陳建明,3*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，福州 350108；2.東部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院藥劑科，南京 210002；3.上海維洱實(shí)驗(yàn)室，上海 201712)

多西他賽是紫杉醇家族的一種強(qiáng)效抗癌藥物，通過促進(jìn)微管蛋白聚合和抑制微管解聚，形成穩(wěn)定的非功能性微管束，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[1]。多西他賽已被廣泛用于治療多種晚期和轉(zhuǎn)移性腫瘤，包括非小細(xì)胞肺癌和晚期胃癌等。與大多數(shù)化療藥物一樣，上市制劑多西他賽注射液(商品名 Taxotere)以吐溫80作為增溶劑，靜脈注射后易造成嚴(yán)重的中性粒細(xì)胞減少、白細(xì)胞減少、神經(jīng)毒性、脫發(fā)、乏力等多種不良反應(yīng)[2]。目前對市售多西他賽注射液的改造主要集中在前藥與新劑型上。前藥方面的研究主要有多西他賽-維生素E前藥[3]、在多西他賽7-OH位進(jìn)行修飾的糖基化多西他賽前藥[4]以及在2′-OH位進(jìn)行修飾的弱堿性多西他賽前藥[5]等。劑型方面的研究主要有多西他賽納米粒[6]、多西他賽泡囊[7]等。

棕櫚酸是一種脂肪酸，能作為能量物質(zhì)被癌細(xì)胞大量攝取，因此多用于脂溶性前藥的合成[8]。本研究將多西他賽制成多西他賽棕櫚酸酯(docetaxel palmitate,DTX-PA)前藥，可以改善多西他賽脂溶性差、毒副作用大的問題。脂質(zhì)體是一種納米載體，在延長體內(nèi)循環(huán)時間、提高穩(wěn)定性、增加藥物溶解度以及降低毒性等方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，成為了目前藥物新劑型研究的熱點(diǎn)[9]?，F(xiàn)階段針對多西他賽脂質(zhì)體的研究有很多，但均因包封率<80%而存在給藥劑量大、藥效差等問題[6,10]。本研究結(jié)合前藥和脂質(zhì)體的優(yōu)勢，制備成多西他賽棕櫚酸酯脂質(zhì)體(docetaxel palmitate liposome,DTX-PA-L)，可以顯著提高藥物的脂溶性，從而提高制劑成藥性，達(dá)到增效減毒的效果。

1 材 料

1.1 儀器 Centrifuge 5418離心機(jī)(德國艾本德公司)；BS124S電子分析天平(德國Sartorius 公司)；ADVIA2120i全自動血球分析儀(德國Siemens公司)；R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；NANO-ZS 90Zetasizer分析儀(英國Malvern公司)；Agilent 1260II高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。

1.2 藥品和試劑 多西他賽(純度≥99%，江蘇紅豆杉藥業(yè)有限公司)；棕櫚酸(純度>98%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；DTX-PA(純度≥95%，上海維洱實(shí)驗(yàn)室自制)；Lipoid EPCS蛋黃磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000，上海利寶德生物技術(shù)有限公司)；無水硫酸鈉(純度>99.0%)和檸檬酸(純度>99.5%)由上海泰坦科技有限公司提供；多西他賽注射液(商品名 Taxotere，賽諾菲制藥有限公司)；甲醇為色譜純；二氯甲烷、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)等試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞和動物 小鼠S180細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院)；雄性ICR小鼠，體質(zhì)量18～20 g(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司)，實(shí)驗(yàn)動物許可證號:SCXK(蘇)2018-0006。

2 方法和結(jié)果

2.1 DTX-PA的合成及鑒定 精密稱取1.06 g(1.24 mmol)多西他賽，適量EDC和DMAP、3.81 g(14.86 mmol)棕櫚酸，置于50 ml的茄型瓶中，加入適量無水二氯甲烷溶解，攪拌反應(yīng)30 min，N2保護(hù)下反應(yīng)過夜。用薄層色譜法(TLC)點(diǎn)板監(jiān)測反應(yīng)至結(jié)束，將反應(yīng)液分別用飽和檸檬酸、食鹽水洗至中性，用無水硫酸鈉干燥過夜。采用柱層析干法上樣法對目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，最終得到白色粉末狀固體DTX-PA。DTX-PA的合成路線如圖1所示。

取適量DTX-PA樣品，采用ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)。(1)質(zhì)譜結(jié)果ESI-MS(m/z):1 046.6[M+H]+，1 068.60[M+Na]+(見圖2)。(2)氫譜結(jié)果1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6):δ 7.97[d,J=7.89 Hz,2H,OBz(o)]；7.81[d,J=9.20 Hz,1H,H-N(3′)]；7.70[t,J=7.36 Hz,1H,OBz(p)]；7.62[t,J=7.62 Hz,2H,OBz(m)]；7.38[t,J=7.62 Hz,2H,3′-Ph(m)]；7.35[d,J=7.62 Hz,2H,3′-Ph(o)]；7.15[t,J=7.29 Hz,1H,3′-Ph(p)]；5.75[t,J=8.90 Hz,1H,H-C(3′)]；5.07[m,2H,H-O(10),H-O(7)]；4.97[d,J=7.30 Hz,1H,H-C(13)]；4.88[brs,1H,H-O(1)]；4.87[d,J=2.92 Hz,1H,H-C(2′)]；4.39[s,1H,H-C(10)]；3.98～4.06[m,3H,H-C(20α,20β),H-C(5)]；3.62[d,J=7.13 Hz,1H,H-C(3)]；2.32～2.36[m,2H,H-C(2″)]；2.25～2.27[m,1H,H-C(6α)]；2.22[s,3H,H-C(OAc)]；1.78～1.84[m,1H,H-C(6β)]；1.67[s,3H,H-C(18)]；1.49[s,3H,H-C(19)]；1.35[s,9H,H-C(t-Bu)]；1.22～1.28[m，26H,H-C(CH2×13)]；0.96[s,6H,H-C(16,17)]；0.83[t,J=7.81 Hz,3H,H-C(16″)]。(3)碳譜結(jié)果13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6):δ 211.22,174.11,171.42,170.92,167.16,157.03,138.75,137.83,135.26,131.94,131.43,130.51,130.39,129.88,129.29,85.64,82.17,80.26,78.69,77.27,76.81,76.68,75.59,73.00,72.60,58.85,57.00,47.83,44.75,38.33,36.59,35.10,33.17,30.92,30.88,30.73,30.58,30.50,30.17,29.99,28.31,26.23,24.36,23.97,22.63,15.81,15.47,11.65。結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果表明，本研究成功合成了DTX-PA前藥。

2.2 DTX-PA-L的制備 采用薄膜分散法制備DTX-PA-L，精密稱取2.5 g磷脂、200 mg DTX-PA、0.21 g DSPE-PEG2000置500 ml圓底燒瓶中,加入適量無水乙醇溶解，55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，在燒瓶內(nèi)壁形成一層均勻透明的薄膜，加入55 ℃預(yù)熱的蒸餾水振蕩、水化得到DTX-PA-L制劑粗品。將得到的粗品用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得到成品DTX-PA-L。

2.3 DTX-PA-L的表征

2.3.1 粒徑和電位的測定 取適量DTX-PA-L，用去離子水按1∶20的比例稀釋，采用NANO-ZS 90Zetasizer分析儀對其粒徑和電位進(jìn)行測定。結(jié)果顯示3批DTX-PA-L均為單峰，平均粒徑為(110.66±0.75) nm，多分散系數(shù)(PDI)為0.11±0.01，平均zeta電位為(-30.79±1.51) mV(n=3)。DTX-PA-L的粒徑和zeta電位分布圖見圖3。

2.3.2 包封率的測定 (1)色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)； 流動相為甲醇∶水=95∶5； 柱溫30 ℃； 流速1.0 ml/min；進(jìn)樣量20 μl； 檢測波長230 nm。(2)檢測方法 采用超濾離心法對制備的DTX-PA-L的包封率進(jìn)行測定。精確吸取1 ml脂質(zhì)體置于超濾管中，以相對離心力2.134×103×g離心15 min，采用HPLC法測定濾液中的藥物濃度。另取200 μl DTX-PA-L，置5 ml容量瓶中，用100 μl異丙醇破乳，再用甲醇溶解并定容，進(jìn)樣測定。包封率計算公式如下：EE(%)=[(c總×V總-c水×V水)/(c總×V總)]×100%。式中，c總為1 ml脂質(zhì)體中藥物的總濃度，c水為超濾離心后水相中的藥物濃度，V總為脂質(zhì)體的總體積，V水為水相的體積。測得3份不同批次DTX-PA-L的平均包封率為(95.77±0.35)%。

2.3.3 形態(tài)學(xué)觀察 分別取適量DTX-PA-L溶液滴在噴碳銅網(wǎng)表面，使液體盡量鋪滿整個銅網(wǎng)，以2%的磷鎢酸溶液負(fù)染3 min后，在透射電鏡下觀察其形態(tài)。DTX-PA-L的電鏡圖見圖4，由圖4可觀察到脂質(zhì)體外觀圓滑，多為橢圓形或圓形。

2.3.4 穩(wěn)定性研究 將3份DTX-PA-L樣品放置于4 ℃冰箱，分別在0、2、4、8、12、24 h測定DTX-PA-L的含量、粒徑和PDI，考察DTX-PA-L的穩(wěn)定性，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，在4 ℃條件下，DTX-PA-L可穩(wěn)定保存24 h。

表1 DTX-PA-L的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of stability test of DTX-PA-L

2.4 藥效學(xué)研究

2.4.1 S180腹水移植瘤小鼠模型的構(gòu)建 將處于對數(shù)生長期的S180細(xì)胞注入ICR小鼠腹腔。選取健康狀態(tài)良好、腹水形態(tài)明顯的2代腹腔荷瘤小鼠，在無菌條件下抽取腹水，用生理鹽水稀釋細(xì)胞濃度至1×107個/ml，得到S180細(xì)胞懸液，并按劑量0.2 ml/只接種于小鼠右側(cè)腋下，選取腫瘤形成明顯的小鼠用于實(shí)驗(yàn)。

2.4.2 DTX-PA-L的抗腫瘤作用 待腫瘤長到適當(dāng)體積后，將ICR小鼠稱重，并隨機(jī)分為生理鹽水組、陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只。采用尾靜脈注射方式給藥，生理鹽水組給予0.2 ml生理鹽水，陽性對照組給予多西他賽注射液(商品名 Taxotere，給藥劑量按多西他賽計10 mg/kg)，實(shí)驗(yàn)組給予DTX-PA-L(給藥劑量按多西他賽計10 mg/kg)，隔天給藥一次，共給藥4次。停藥48 h后，稱取小鼠體質(zhì)量，處死小鼠，剝瘤并稱重，計算給藥后抑瘤率。抑瘤率=[(mC-mT)/mC]×100%，式中mC表示生理鹽水組小鼠的平均瘤重，mT表示給藥組小鼠的平均瘤重。生理鹽水組、陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠的平均瘤重分別為(1.29±0.27)、(0.46±0.04)和(0.26±0.05) g。與生理鹽水組相比，多西他賽注射液和DTX-PA-L對S180肉瘤均有抑制作用(P<0.001)，但同等劑量下實(shí)驗(yàn)組的抑瘤率達(dá)到79.96%，而陽性對照組只有64.15%。結(jié)果表明，與市售多西他賽注射液相比，DTX-PA-L能顯著提高藥物的體內(nèi)抗腫瘤活性(P<0.001)。

2.5 DTX-PA的初步安全性評價 在體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中，觀察各組小鼠的生存情況和生理狀態(tài)。各組小鼠的存活率為100%，但Taxotere給藥后小鼠出現(xiàn)呼吸急促、抽搐等毒副作用。在停藥48 h后，取小鼠眼眶血進(jìn)行血常規(guī)檢測。以中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板為評價指標(biāo)，初步對DTX-PA-L的安全性進(jìn)行考察。小鼠血常規(guī)檢測結(jié)果見表2，結(jié)果表明，與陽性對照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠的中性粒細(xì)胞、血小板、白細(xì)胞均顯著升高(P<0.001)，表明DTX-PA-L的血液毒性低于多西他賽注射液(商品名 Taxotere)。

表2 S180荷瘤小鼠血液指標(biāo)的比較Table 2 Comparison of hematological parameters of S180 bearing mice

3 討 論

本研究采用一步酯化法合成了DTX-PA前藥，且成功將其包載于脂質(zhì)體中。與已上市的多西他賽注射液(商品名 Taxotere)相比，DTX-PA-L能顯著提高抗腫瘤效果。這可能是由于棕櫚酸與多西他賽制備成DTX-PA前藥后，增加了DTX的脂溶性，進(jìn)而能提高制劑的成藥性；同時，棕櫚酸是一種脂肪酸，可以作為能量物質(zhì)被癌細(xì)胞或癌組織大量攝取，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對其的攝?。淮送?，以脂質(zhì)體為載體制備的DTX-PA-L利用腫瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect,EPR)，更多地聚集于腫瘤內(nèi)，在腫瘤組織酯酶的作用下，前藥緩慢代謝出母藥，達(dá)到靶向腫瘤、增強(qiáng)療效的目的[11]。多西他賽毒性較大，制備成前藥包載于脂質(zhì)體后，可顯著降低其血液毒性，這可能是由于制備成DTX-PA-L后，DTX-PA在血液中會緩慢釋放出多西他賽，血液中多西他賽的累積量減少，從而降低了多西他賽的生物毒性[12]。本研究制備的DTX-PA-L納米給藥系統(tǒng)在降低毒性和提高抗腫瘤效果上具有獨(dú)特的優(yōu)勢，為多西他賽新制劑的研制提供了一種新的研究思路。