戶(hù)晶晶，王瑞芳，王 力，丁小梅，李 月

(集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021)

0 引言

糖尿病是一種嚴(yán)重的慢性疾病，其標(biāo)志性異常是高血糖[1]。α-葡萄糖苷酶是治療糖尿病的一種靶酶，它可通過(guò)抑制α-葡萄糖苷酶的活性來(lái)降低餐后血糖水平。阿卡波糖是市面上常用的一種α-葡萄糖苷酶抑制劑，能有效控制餐后血糖水平的升高，但長(zhǎng)期服用會(huì)出現(xiàn)腹瀉、惡心、嘔吐等不良反應(yīng)[2-3]。近年來(lái)，通過(guò)大量科學(xué)研究，人們已篩選出多種抑制效果好、副作用低的α-葡萄糖苷酶抑制劑，如：Zhang等[4]從菠蘿蜜(Artocarpus heterophyllusLam.)果皮中提取的活性成分對(duì)α-葡萄糖苷酶具有較強(qiáng)的抑制作用；Yang等[5]從何首烏(Polygonummultiflorum)根中提取具有抑制α-葡萄糖苷酶活性成分物質(zhì)；Wang等[6]合成的新型色酮-靛紅衍生物對(duì)酵母α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用；Nguyen等[7]從發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)肉湯中分離并鑒定出5種新型α-葡糖苷酶抑制劑——腺嘌呤、3-羥基脯氨酸、肌酸酐、煙酸和煙酰胺，且3-羥基脯氨酸和煙酸對(duì)大鼠α-葡萄糖苷酶的活性抑制強(qiáng)度大于阿卡波糖。上述研究的都是有機(jī)化合物抑制劑，而關(guān)于無(wú)機(jī)化合物抑制劑的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)組CHI等[8]考察了Keggin型多金屬氧酸鹽對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)過(guò)渡金屬取代的Keggin型磷鉬酸中Na4PMo11VO40抑制效果最好，此研究為設(shè)計(jì)有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑提供了一個(gè)新視角。

多金屬氧酸鹽(polyoxometalates,POMs)是一類(lèi)高價(jià)多陰離子的金屬氧化物[9]，種類(lèi)豐富多樣，性質(zhì)獨(dú)特，在催化化學(xué)[10]、藥物化學(xué)[11]、材料化學(xué)[12]等領(lǐng)域均有研究。輪型鉬簇是一種納米尺寸的高核化多金屬氧酸鹽，在分子磁體、生物仿生及納米功能材料領(lǐng)域[13-14]具有可觀(guān)的應(yīng)用前景，是多酸研究的新熱點(diǎn)。此外，王川[15]研究發(fā)現(xiàn)3種球型高核鉬簇對(duì)HUVECs細(xì)胞的增殖、遷移起到抑制作用，這為治療阿爾莫茲海默癥提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)室小組曾研究純鉬簇和有機(jī)-無(wú)機(jī)鉬簇對(duì)酪氨酸酶的抑制作用[16]，并將其應(yīng)用于對(duì)蝦和蘋(píng)果的保鮮，而高核化輪型鉬簇的生物活性研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本文擬合成4種高核化的輪型鉬簇{(NH4)12[Mo36O108(NO)4(H2O)16]·33H2O，Na5(NH4)16[Mo57Mn6(NO)6O174(OH)3(H2O)24]·44H2O，(NH4)21[H3Mo57V6(NO)6O183(H2O)18]·65H2O，Na3(NH4)12(Mo57Fe6(NO)6O174(OH)3(H2O)24)·76H2O(以下分別簡(jiǎn)寫(xiě)為Mo36、Mo57Mn6、Mo57V6、Mo57Fe6)}，并考察其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，為開(kāi)發(fā)新型的α-葡萄糖苷酶抑制劑提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

釀酒酵母的α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)購(gòu)自Singma-Aidrich公司(St.Louis，MO，USA)；阿卡波糖購(gòu)自上海麥克萊恩生化科技有限公司(中國(guó)上海)；對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)和對(duì)硝基苯(pNP)購(gòu)自北京百靈威科技有限公司(中國(guó)北京)；二甲基亞砜、無(wú)水碳酸鈉，鉬酸鈉、偏釩酸銨、鹽酸、氯化羥胺購(gòu)自西隴化工股份有限公司；用于化合物合成和酶動(dòng)力學(xué)測(cè)試系統(tǒng)的試劑均為分析級(jí)，水為超純水。

SynergyH1全功能酶標(biāo)記儀器(UnitedStatesBioTekInstrumentCo.，Ltd.，USA)；pH211C型酸度計(jì)(北京HanakeTechnologyCo.，Ltd.)；HWS-24電熱恒溫水浴(上海恒世儀器有限公司，中國(guó)上海)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 輪型鉬簇化合物的合成及表征

化合物Mo36的合成參考文獻(xiàn)[17]稍作修改：11.92g鉬酸鈉、7.68g鹽酸羥胺、4.36g氯化銨、15.2mL3.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸和150mL水于300mL錐形瓶中混合均勻，70～75 ℃下水浴16h后，反應(yīng)液趁熱過(guò)濾，紅色濾液冷卻后于20 ℃下靜置一周，有紅色的晶體析出。化合物Mo57Mn6的合成參考文獻(xiàn)[18]稍作修改：2.43g鉬酸鈉、3.68g醋酸錳和0.347g鹽酸羥胺溶于100mL水中混合均勻，調(diào)pH值至3.0～3.5。室溫下攪拌反應(yīng)3～4h后，過(guò)濾反應(yīng)液，濾液20 ℃下靜置半個(gè)月，有深紅色塊狀晶體析出。化合物Mo57V6的合成根據(jù)文獻(xiàn)[17]稍作修改：7.46g鉬酸鈉、1.19g偏釩酸銨、12.83g鹽酸羥胺、9.5mL3.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸和200mL水于300mL錐形瓶中混合均勻，90 ℃下水浴20h后，過(guò)濾反應(yīng)液，濾液20 ℃下靜置一周，有藍(lán)紫色晶體析出?；衔颩o57Fe6的合成根據(jù)文獻(xiàn)[19]稍作修改：12.00g鉬酸鈉、9.50g硝酸鐵、16.00g鹽酸羥胺、12.5mL3.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸和250mL水?dāng)嚢杈鶆?，回流加熱，直至冷凝管中有棕色蒸汽回流。反?yīng)液趁熱過(guò)濾，將米色-棕色沉淀物分離出去，濾液保存于敞口的400mL燒杯中，2d后再次過(guò)濾，濾液于錐形瓶中5 ℃下密封保存，3～4d后析出褐色晶體。通過(guò)紅外和紫外/可見(jiàn)光譜對(duì)合成的4種輪型鉬簇進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

1.2.2 α-葡萄糖苷酶測(cè)活體系的建立

α-葡萄糖苷酶測(cè)活體系的制備參考文獻(xiàn)[20]稍作修改：取10μL配制于磷酸鹽緩沖液中的酶液加入133μL0.1mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)中，再加入溶于DMSO的效應(yīng)物7μL，混合均勻后，37 ℃下孵育10min。然后加入20μL溶于磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)的5mmol/L底物pNPG，37 ℃下再孵育20min后，用170μL的0.1mmol/LNa2CO3淬滅反應(yīng)，反應(yīng)液于405nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。

1.2.3 4種輪型鉬簇對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果

效應(yīng)物(Mo36，Mo57Mn6，Mo57V6，Mo57Fe6)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果是在測(cè)活體系中，固定α-葡萄糖苷酶為5U/mL，底物pNPG濃度為5mmol/L，測(cè)定效應(yīng)物在不同濃度下對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，測(cè)定效應(yīng)物在不同濃度下對(duì)應(yīng)的相對(duì)剩余酶活力。以效應(yīng)物濃度為橫坐標(biāo)、相對(duì)剩余酶活力為縱坐標(biāo)作圖，當(dāng)相對(duì)酶活力為50%時(shí)，所對(duì)應(yīng)的抑制劑濃度即為IC50值。剩余酶活力隨抑制劑濃度變化的計(jì)算公式為：抑制/%=(Ab-As)/Ab×100。式中：Ab為空白組沒(méi)有添加抑制劑時(shí)反應(yīng)體系測(cè)得的吸光度值；As為樣品組不同濃度抑制劑下反應(yīng)體系測(cè)得的吸光度值。

1.2.4 4種輪型鉬簇對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理

效應(yīng)物(Mo36，Mo57Mn6，Mo57V6，Mo57Fe6)對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制機(jī)理研究是在上述α-葡萄糖苷酶測(cè)活系統(tǒng)中，以5mmol/LpNPG作為底物，將α-葡萄糖苷酶的濃度分別配制為5，4，3，2，1U/mL，監(jiān)測(cè)不同濃度的效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶和底物的水解反應(yīng)的影響。

1.2.5 4種輪型鉬簇對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類(lèi)型

效應(yīng)物(Mo36，Mo57Mn6，Mo57V6，Mo57Fe6)對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類(lèi)型研究，同樣在上述的α-葡萄糖苷酶測(cè)活體系中，固定酶為5U/mL，將底物pNPG的濃度分別配制為5，3.9，2.8，1.7，1.1mmol/L，監(jiān)測(cè)不同濃度的效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶和底物的水解反應(yīng)的影響。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)及處理采用SPSSStatistics17.0軟件，圖形的繪制采用OriginPro8.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種輪型鉬簇的表征結(jié)果

表1 化合物(Mo36，Mo57Mn6，Mo57V6，Mo57Fe6)的紅外表征數(shù)據(jù)

紫外光譜測(cè)定結(jié)果顯示，4種化合物在209 nm 和232 nm波長(zhǎng)處均出現(xiàn)了多金屬氧酸鹽特征峰，這符合雜多酸化合物約在200 nm和260 nm處有特征吸收峰的特點(diǎn)。

4種鉬簇化合物的三維晶體結(jié)構(gòu)以Polyhedral結(jié)構(gòu)形式顯示[17,19]，如圖1所示。4種輪型鉬簇化合物分別有不同的結(jié)構(gòu)形式，Mo36是同核簇，Mo57Mn6、Mo57V6、Mo57Fe6是異核簇。

2.2 效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

以Mo36、Mo57Mn6、Mo57V6、Mo57Fe6為效應(yīng)物，隨效應(yīng)物濃度的增加相對(duì)剩余酶活力逐漸下降。Mo36、Mo57Mn6、Mo57V6、Mo57Fe6對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50值分別為(0.229±0.002 48)，(0.212±0.001 07)，(0.039 4±0.001 67)，(0.025 9±0.000 328)mmol/L，阿卡波糖的IC50=64.309 mmol/L，故4種效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶均表現(xiàn)為高效，且對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果依次為Mo57Fe6>Mo57V6>Mo57Mn6>Mo36。4種化合物中的輪型Mo57鉬簇外部框架相對(duì)于Mo36較大，這可能是導(dǎo)致Mo57Mn6、Mo57V6、Mo57Fe6對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制效果好于Mo36的原因之一。Prudent等[22]研究發(fā)現(xiàn)，多金屬氧酸鹽對(duì)蛋白激酶CK2抑制作用主要取決于POM結(jié)構(gòu)，隨著POM大小和電荷的增大，抑制效果增加；同時(shí)指出，屬于同一POM家族的化合物具有類(lèi)似的活性，此結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有相似性。然而，過(guò)渡金屬取代的3種輪型鉬簇表現(xiàn)不同的抑制效果，可能是金屬離子對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性具有一定的影響。

2.3 效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理

4種鉬簇化合物(Mo36、Mo57Mn6、Mo57V6、Mo57Fe6)對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制機(jī)理的判定是以體系中反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)，酶活力為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖2所示。可見(jiàn)4種效應(yīng)物的機(jī)理圖具有高度相似性。然而，在每組圖中，5條曲線(xiàn)對(duì)應(yīng)的效應(yīng)物濃度隨效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制效果的不同而改變。圖2中的曲線(xiàn)均經(jīng)過(guò)原點(diǎn)，隨著效應(yīng)物濃度的增加，每組曲線(xiàn)的斜率均逐漸減小。綜上所述，Mo36、Mo57Mn6、Mo57V6、Mo57Fe6對(duì)α-葡萄糖苷酶均是可逆抑制機(jī)理，此結(jié)果與謝樂(lè)芳等[23]報(bào)道的Dawson型多金屬氧酸鹽對(duì)酪氨酸酶的機(jī)理型研究結(jié)果具有一致性。效應(yīng)物分別與α-葡萄糖苷酶以非共價(jià)形式結(jié)合，從而降低酶的活性。此外，可以通過(guò)透析、過(guò)濾等物理方法除去效應(yīng)物，從而使酶的活性恢復(fù)[24]。

2.4 效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類(lèi)型

酶反應(yīng)速率倒數(shù)對(duì)底物pNPG濃度倒數(shù)作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，通過(guò)Lineweaver-Burk圖測(cè)定每種測(cè)試效應(yīng)物對(duì)酶的抑制類(lèi)型。Mo36對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類(lèi)型如圖3a所示，直線(xiàn)1-5相交于Y軸，隨著Mo36濃度變大，米氏常數(shù)(Km)變大，最大反應(yīng)速率(vmax)不變，表明效應(yīng)物Mo36對(duì)α-葡萄糖苷酶是競(jìng)爭(zhēng)型抑制。效應(yīng)物Mo36和底物(pNPG)競(jìng)爭(zhēng)型地與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合部位結(jié)合，從而影響了底物和酶的正常結(jié)合[25]。通過(guò)繪制Dixon圖計(jì)算抑制常數(shù)KI=0.100 mmol/L。

Mo57Mn6對(duì)α-葡萄糖苷酶的雙倒數(shù)圖以及Dixon圖如圖3b所示。圖3中的曲線(xiàn)相交于第Ⅱ象限，隨著Mo57Mn6濃度的增加，曲線(xiàn)的斜率逐漸增大。同時(shí)，曲線(xiàn)相交于Y軸的縱向截距(1/vmax)逐漸增加，相交于X軸的橫向截距(1/Km)逐漸減少。表明Mo57Mn6對(duì)α-葡萄糖苷酶是混合型抑制，通過(guò)計(jì)算得出抑制常數(shù)KI值和KIS值分別為0.156，0.319 mmol/L。抑制常數(shù)越小，抑制劑對(duì)酶的結(jié)合親和力越強(qiáng)。結(jié)果顯示KI值小于KIS值，表明效應(yīng)物Mo57Mn6主要是以與游離酶結(jié)合的方式與α-葡萄糖苷酶結(jié)合[26]。

Mo57V6、Mo57Fe6兩種效應(yīng)物對(duì)α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖具有相似性，如圖3c、圖3d所示。每組圖中的5條曲線(xiàn)交點(diǎn)即不在X軸也不在Y軸。Mo57V6、Mo57Fe6對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類(lèi)型均表現(xiàn)為混合型抑制。通過(guò)二次作圖，得出Mo57V6抑制常數(shù)分別為KI=0.042 9 mmol/L，KIS=0.026 7 mmol/L。Mo57Fe6的抑制常數(shù)分別為KI=0.017 2 mmol/L、KIS=0.008 11 mmol/L。兩種效應(yīng)物的KI值均大于KIS值，表明Mo57V6、Mo57Fe6主要是與酶-底物復(fù)合物結(jié)合。

3 結(jié)論

通過(guò)酶動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：4種輪型鉬簇Mo36、Mo57Mn6、Mo57V6、Mo57Fe6對(duì)α-葡萄糖苷酶均具有較好的抑制效果，且Mo57Fe6的抑制效果最好，其IC50=(0.025 9±0.000 328)mmol/L；4種輪型鉬簇對(duì)α-葡萄糖苷酶均為可逆性抑制，其中Mo36是可逆競(jìng)爭(zhēng)型抑制，Mo57Mn6、Mo57V6、Mo57Fe6為可逆混合型抑制。在了解了4種輪型鉬簇對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果、抑制機(jī)理及抑制類(lèi)型的基礎(chǔ)上，接下來(lái)還需進(jìn)一步研究抑制劑與酶蛋白之間的結(jié)合模式，進(jìn)而為研究開(kāi)發(fā)新型的α-葡萄糖苷酶抑制劑提供理論基礎(chǔ)。