劉 睿，邵 瑾，趙 彤，何 蕾，馬慧萍，景臨林*

1聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院干部病房；2聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院藥劑科 全軍高原醫(yī)學(xué)重點實驗室，蘭州 730050

高原約占地球表面的五分之一，而世界上約有1.4億人生活在海拔超過2 500 m的高原，其中，我國約有800萬人生活在平均海拔4 000 m以上的青藏高原[1]。大量研究表明：暴露于高海拔引起的低壓低氧(hypobaric hypoxia，HH)環(huán)境下會對人體的病理生理變化產(chǎn)生嚴(yán)重影響[2]。其中，腦組織由于耗氧量大，是對缺氧最為敏感的器官之一[3]。隨著中國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，奔赴高原進(jìn)行工作、旅游和探險的人越來越多，如何改善低壓低氧誘導(dǎo)的腦組織損傷成為目前研究的熱點問題。

薺苧黃酮(5-羥基-6，7-二甲氧基黃酮；mosloflavone)(圖1)是首次從蘇州薺苧(MoslasoochowensisMatsuda)分離得到的一種黃酮化合物[4]。研究表明：薺苧黃酮具有抗氧化、抗炎和抗病毒等活性[5-7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：薺苧黃酮對缺氧PC12細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用[8]，進(jìn)一步通過動物實驗證明其還能夠改善高原缺氧誘導(dǎo)的小鼠腦組織損傷[9]，但是具體的作用機(jī)制尚不明確。有證據(jù)表明：急性低壓缺氧能夠誘導(dǎo)腦組織中活性氧(ROS)的增加[10]和炎性因子的釋放[11]，本研究將探究薺苧黃酮對低壓低氧誘導(dǎo)小鼠腦組織氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響，闡明其可能的作用機(jī)制。

圖1 薺苧黃酮的結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of mosloflavone

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

雄性清潔級BABL/c小鼠(4周齡，體重20±2g)，由聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院動物實驗科提供，許可證號:SYXK(軍)2014-0029。

1.2 藥物與試劑

薺苧黃酮按照文獻(xiàn)方法制備，純度>98%[8]；蘆丁購自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司，純度>98%。丙二醛(MDA，批號：20 150 812)測試盒、BCA法蛋白定量試劑盒(批號：20 150 921)、超氧化物歧化酶(SOD，批號：20 150 724)測試盒、過氧化氫酶(CAT，批號：20 150 613)測試盒和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px，批號：20 150 802)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)購自sigma公司；白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒購自Abcam公司。IL-1β、TNF-α、SOD1、CAT和β-actin等一抗購自Abcam公司；羊抗小鼠IgG-HRP抗體和羊抗兔IgG-HRP抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、ECL Plus超敏發(fā)光液和PVDF膜購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 主要儀器

FLYDWC50-IIC低壓低氧動物實驗艙(貴州風(fēng)雷航空軍械有限公司)；CriterionTM電泳槽(Bio-Rad公司)；Spectramax i3多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)；BPG-9 040精密鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；Microfuge 22R冷凍離心機(jī)(Beckman Coulter公司)；多樣品組織研磨儀Tissuelyser-24(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)。

2 方法

2.1 常壓密閉缺氧實驗

清潔級健康BABL/c雄性小鼠50只，隨機(jī)分為缺氧模型組、蘆丁組(500 mg/kg)和薺苧黃酮低(125 mg/kg)、中(250 mg/kg)、高(500 mg/kg)劑量組，每組10只，連續(xù)灌胃給藥5天，缺氧模型組給予等量生理鹽水，最后一次給藥后半小時后，將小鼠置于250 mL廣口瓶中(瓶中放置5 g鈉石灰用于吸收CO2)，密閉瓶塞后開始計時，以小鼠最后一次大喘氣為死亡指征，紀(jì)錄小鼠存活時間，計算存活率=(給藥組存活時間-模型組存活時間)/模型組存活時間。

2.2 低壓低氧誘導(dǎo)腦組織損傷模型

低壓低氧誘導(dǎo)腦組織損傷模型的構(gòu)建參照課題組先前報道的方法進(jìn)行[12]。清潔級健康BABL/c雄性小鼠84只，隨機(jī)分為正常對照組、缺氧模型組、蘆丁組(500 mg/kg)、薺苧黃酮組(500 mg/kg)，每組21只，連續(xù)灌胃給藥5天。正常對照組小鼠不給藥，缺氧模型組給予等量生理鹽水，最后一次給藥后，除正常對照組外，將其它三組小鼠置于低壓低氧動物實驗艙中，以10 m/s的速度升至海拔8 000 m并維持12 h，隨后以10 m/s的速度將實驗艙中氣壓升至于外界大氣壓，迅速處死小鼠，摘除腦組織，并按照測定要求對其進(jìn)行處理。

2.3 腦組織含水量測定

每組分別取12只小鼠的腦組織標(biāo)本，平均將其分成兩個半球。用精密電子天平稱量左半球的重量以獲得濕重。然后在80 ℃下干燥72 h，以達(dá)到恒定的干重。大腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

2.4 腦組織中ROS水平測定

每組分別取6只小鼠的腦組織右半球標(biāo)本，用RIPA裂解液處理后，14 000 rpm低溫(4 ℃)離心20 min取上清。將10 μM DCFH-DA的加入上清液中，37 ℃避光孵育15 min，測定激發(fā)波長535 nm，發(fā)射波長538 nm的吸光度值。ROS水平以相對于對照組的百分比表示。

2.5 腦組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測定

每組分別取6只小鼠的腦組織右半球標(biāo)本，稱重后加入9倍量冰生理鹽水，使用組織研磨儀制備腦組織勻漿，然后3 500 rpm低溫(4 ℃)離心10 min后取上清。MDA和GSH含量以及SOD、CAT和GSH-Px活性的按照相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行測定。MDA含量和GSH含量分別以nmol/mg protein和μmol/g protein表示，SOD、CAT和GSH-Px活性以U/mg protein表示。

2.6 腦組織中炎性因子含量測定

每組分別取6只小鼠的腦組織標(biāo)本，用RIPA裂解液處理后，3 500 rpm低溫(4 ℃)離心5 min。上清液中IL-1β，TNF-α和IL-6的濃度按照相關(guān)ELISA試劑盒說明進(jìn)行測定。炎性因子含量以pg/mL表示。

2.7 腦組織蛋白表達(dá)水平的測定

每組分別取3只小鼠的腦組織標(biāo)本，稱重后加入9倍量RIPA裂解液，使用組織研磨儀制備腦組織勻漿，然后12 000 rpm低溫(4 ℃)離心15 min，取上清，采用BCA法計算蛋白濃度。取等量蛋白樣品上樣，采用SDS-PAGE進(jìn)行分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，使用5%脫脂牛奶封閉2 h后，分別加入SOD1(1∶5 000)、CAT(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)、TNF-α(1∶3 000)和β-actin(1∶1 000)等一抗，4 ℃搖床孵育過夜，用TBST緩沖液漂洗4次，每次10 min。加入二抗，β-actin蛋白使用羊抗小鼠IgG-HRP(1∶2 000稀釋)，其余均用羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000稀釋)，室溫孵育2 h，ELC發(fā)光，暗室曝光，灰度值用Image-Pro Plus6.0軟件掃描測定。

2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 薺苧黃酮對常壓密閉小鼠腦存活時間的影響

與缺氧模型組相比，薺苧黃酮低、中、高三個劑量組均能延長小鼠在常壓密閉缺氧環(huán)境中的存活時間，且呈劑量依賴性，其中薺苧黃酮高劑量組的存活延長率達(dá)到49%，結(jié)果見表1。因此，后續(xù)實驗中薺苧黃酮的給藥劑量為500 mg/kg。

表1 薺苧黃酮對常壓密閉缺氧小鼠存活時間的影響

圖2 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織含水量的影響Fig.2 Effects of mosloflavone on brain water content in mice after HH 注：與正常對照組相比，##P<0.01；與缺氧模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。 Note: ##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs model group.

3.2 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織含水量的影響

與正常對照組相比，缺氧模型組小鼠腦組織含水量明顯升高(P<0.01)，經(jīng)薺苧黃酮和蘆丁干預(yù)后，腦組織含水量較缺氧模型組顯著降低(P<0.01或P<0.05)。結(jié)果見圖2。

3.3 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織中ROS和MDA含量的影響

缺氧模型組小鼠腦組織中ROS和MDA含量較正常對照組顯著升高(P<0.01)，經(jīng)薺苧黃酮和蘆丁預(yù)處理可以顯著降低ROS和MDA水平(P<0.01)。結(jié)果見圖3。

圖3 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織中ROS和MDA含量的影響Fig.3 Effects of mosloflavone on the content of ROS and MDA in mice brain after HH 注：與正常對照組相比，##P<0.01；與缺氧模型組相比，**P<0.01。 Note: ##P<0.01 vs normal group;**P<0.01 vs model group.

3.4 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織中抗氧化體系的影響

缺氧模型組小鼠腦組織中GSH含量和SOD、CAT和GSH-Px活性較正常對照組顯著下降(P<0.01)，經(jīng)薺苧黃酮和蘆丁預(yù)處理可以顯著提高GSH含量(P<0.01)和SOD、CAT和GSH-P的活力(P<0.01)。結(jié)果見圖4。

圖4 薺苧黃酮對高原缺氧小鼠腦組織中GSH、SOD、CAT和GSH-Px的水平的影響Fig.4 Effects of mosloflavone on the level of GSH,SOD,CAT and GSH-Px in mice brain after HH 注：與正常對照組相比，##P<0.01；與缺氧模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。 Note:##P<0.01 vs normal group;*P<0.05,**P<0.01 vs model group.

3.5 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織炎性因子含量的影響

缺氧模型組與正常對照組相比，小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量顯著升高(P<0.01)；經(jīng)薺苧黃酮和蘆丁預(yù)處理能夠逆轉(zhuǎn)這種變化，降低促炎性因子的水平。結(jié)果見表2。

表2 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α和IL-6含量的影響

3.6 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織中SOD1和CAT蛋白表達(dá)的影響

與正常對照組相比，缺氧模型組SOD1和CAT的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，經(jīng)蘆丁和薺苧黃酮預(yù)處理可以顯著升高缺氧小鼠腦組織中SOD1和CAT的蛋白表達(dá)(P<0.01)。結(jié)果見圖5。

圖5 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織中SOD1和CAT蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of mosloflavone on the expression of SOD1 and CAT in mice brain after HH 注：與正常對照組相比，##P<0.01；與缺氧模型組相比，**P<0.01。 Note:##P<0.01 vs normal group;**P<0.01 vs model group.

3.7 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織中IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)的影響

與正常對照組比較，缺氧模型組小鼠腦組織中IL-1β和TNF-α蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.01)；經(jīng)蘆丁和薺苧黃酮預(yù)處理可顯著降低腦組織中IL-1β和TNF-α蛋白的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見圖6。

圖6 薺苧黃酮對低壓低氧小鼠腦組織中IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effects of mosloflavone on the expression of IL-1β and TNF-α in mice brain after HH 注：與正常對照組相比，##P<0.01；與缺氧模型組相比，**P<0.01。 Note:##P<0.01 vs normal group;**P<0.01 vs model group.

4 討論與結(jié)論

暴露于以低壓低氧為特征的高原環(huán)境是一種極端的生理應(yīng)激狀態(tài)，對機(jī)體多個臟器都會造成有害影響。其中，大腦由于耗氧量巨大，是對高原缺氧最為敏感的器官之一。先前的研究指出，低壓低氧誘發(fā)的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致腦組織損傷的因素之一[13]。體內(nèi)外實驗表明，低壓低氧能夠誘導(dǎo)細(xì)胞和組織中ROS的蓄積[10]。過量的ROS能夠攻擊腦組織中含量豐富的不飽和脂肪酸和生物大分子，誘發(fā)脂質(zhì)過氧化，使MDA含量顯著升高[3]。這與我們的實驗結(jié)果相一致：缺氧模型組小鼠腦組織中ROS和MDA含量較正常對照組顯著升高，而給予薺苧黃酮預(yù)處理能夠顯著降低腦組織中ROS和MDA的水平。以上結(jié)果說明薺苧黃酮可以顯著抑制低壓低氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化。

正常生理條件下，ROS不斷生成并被體內(nèi)的抗氧化酶和非酶抗氧化體系清除并維持在較低的水平。SOD、CAT和GSH-Px是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶。SOD將超氧陰離子轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫，CAT將過氧化氫轉(zhuǎn)化為水和氧氣，而GSH-px將脂質(zhì)過氧化物還原為它們相應(yīng)的醇類，并將游離的過氧化氫還原成水[14]。GSH是細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的非酶抗氧化劑，能夠通過直接清除自由基從而保護(hù)生物大分子免受自由基的攻擊，同時GSH-px還利用GSH作為電子供體，將其轉(zhuǎn)化為谷胱甘肽二硫化物(GSSG)，后者又被谷胱甘肽還原酶(GSSG-red)再生為GSH[15]。低壓低氧誘導(dǎo)ROS大量產(chǎn)生的同時，還會破壞抗氧化體系，進(jìn)而加劇氧化應(yīng)激損傷[13]。在本研究中，急性低壓低氧導(dǎo)致小鼠腦組織中GSH水平以及SOD、CAT和GSH-Px的活性顯著降低，而薺苧黃酮能夠提高GSH的含量，維持抗氧化酶的活性。同時研究還發(fā)現(xiàn)，急性低壓低氧能夠?qū)е滦∈竽X組織中SOD1和CAT蛋白表達(dá)顯著下降，經(jīng)薺苧黃酮預(yù)處理能夠顯著提高兩個抗氧化蛋白的水平，改善腦組織的氧化應(yīng)激失衡。

氧化應(yīng)激和炎癥是相互依存，相互關(guān)聯(lián)的過程。一方面，炎性細(xì)胞在炎癥部位釋放大量的ROS，導(dǎo)致過度的氧化損傷。另一方面，許多ROS和氧化應(yīng)激產(chǎn)物能夠增強(qiáng)炎性反應(yīng)[16]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)在高原缺氧損傷中具有非常重要的作用。Hartmann等[17]研究發(fā)現(xiàn)：健康志愿者在高海拔(>3 400 m)環(huán)境暴露三天，血液中IL-1和IL-6等炎癥細(xì)胞因子水平顯著升高。Song等[18]研究表明：人體內(nèi)TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎性因子水平與急性高山病(AMS)的癥狀呈正相關(guān)。這些促炎性因子能夠誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，導(dǎo)致其它炎性介質(zhì)的釋放并導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)[19]。炎性介質(zhì)可以通過刺激花生四烯酸的代謝使自由基釋放增加，加重氧化應(yīng)激損傷，通過增加水通道蛋白及其下游靶基因的表達(dá)，損傷腦微血管基膜、增加血管通透性、破壞血腦屏障進(jìn)而造成血管原性腦水腫，加重腦組織損傷。我們的研究結(jié)果也顯示：低壓低氧小鼠腦組織中IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎性因子水平顯著增加，Western bolt實驗進(jìn)一步證明，低壓低氧能夠顯著上調(diào)小鼠腦組織中TNF-α和IL-1β蛋白水平，給予薺苧黃酮預(yù)處理能夠降低腦組織中促炎性因子含量，下調(diào)TNF-α和IL-1β蛋白水平。以上結(jié)果表明：薺苧黃酮對低壓低氧誘導(dǎo)腦組織損傷的保護(hù)作用可能與其介導(dǎo)炎性因子的表達(dá)相關(guān)。

綜上所述，薺苧黃酮對高原缺氧小鼠腦組織的保護(hù)作用機(jī)制與其清除過量自由基，緩解機(jī)體氧化應(yīng)激，抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。