商志浩，潘成鎮(zhèn)，馬月輝，謝卓容，韋紫怡，羅偉生，彭 岳，岑妍慧,2*

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530000

原發(fā)性肝癌(HCC)是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，有流行廣、起病緩慢、出現(xiàn)癥狀后疾病進(jìn)展迅速、侵襲性強(qiáng)、病死率高[1]的特點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計，肝癌死亡率在惡性腫瘤城市死亡率中居于第二位，僅次于肺癌；農(nóng)村居于第二位，僅次于胃癌。目前我國每年約有11萬人死于肝癌，并且我國的肝癌發(fā)病率是全球最高，肝癌發(fā)病人數(shù)占全球的50%以上[2]，對我國人民的身體健康造成嚴(yán)重威脅。肝癌可發(fā)生于任何年齡，其中以35～55歲最多，男女之比約為1∶1～4∶1。早期切除是療效較好的治療方法之一，但大多數(shù)肝癌患者確診時已屬晚期，多數(shù)已錯過手術(shù)時機(jī)，所能采用的現(xiàn)代綜合治療方法常被限制在放化療和免疫治療上，而放化療對本病的治療毒副反應(yīng)大，適應(yīng)證少，療效往往難以令人滿意。目前，中西醫(yī)結(jié)合治療是本病的主要治療手段之一。

逍遙散，中醫(yī)方劑名。出自《太平惠民和劑局方》卷九。逍遙散為和解劑，具有疏肝解郁，養(yǎng)血健脾之功效，主治肝郁血虛脾弱證。目前，醫(yī)療工作者做了一定量的關(guān)于逍遙散治療原發(fā)性肝癌及其并發(fā)癥的臨床研究，如Xiong等[3]選取了72例原發(fā)性肝癌患者，將其分成三組分別使用西藥化療加苦參注射液、西藥單純化療、西藥化療加逍遙散加減進(jìn)行治療，結(jié)果用西藥化療加逍遙散治療組相較于其他對照組取得了較好療效，根據(jù)病人的各方面數(shù)據(jù)也顯示逍遙散具有改善原發(fā)性肝癌患者的肝功能、生活質(zhì)量、外周血白細(xì)胞等作用。但是由于逍遙散成分復(fù)雜多樣，其治療原發(fā)性肝癌的作用機(jī)制目前尚未有明確研究報道。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來新興的的一門學(xué)科，融合了系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、計算生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容，將生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)與藥物作用網(wǎng)絡(luò)整合，探究疾病及藥物的相互作用機(jī)理，與復(fù)雜疾病的治療理念相吻合[4]，已被廣泛用于中藥潛在活性成分和作用靶點(diǎn)的預(yù)測及中藥作用機(jī)制的闡述。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研、數(shù)據(jù)挖掘、統(tǒng)計推斷、生物信息學(xué)等方法，構(gòu)建逍遙散與原發(fā)性肝癌相互作用的藥物與生物分子復(fù)雜關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，發(fā)掘藥物作用靶點(diǎn)及藥物與內(nèi)源性蛋白及生物通路的作用關(guān)系，從而合理預(yù)測和科學(xué)推斷有效物質(zhì)成分的作用靶點(diǎn)及其調(diào)控的生物學(xué)過程和機(jī)制，力求更全面深入揭示逍遙散的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和治療原發(fā)性肝癌的療效機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 相關(guān)數(shù)據(jù)庫

使用GEO數(shù)據(jù)庫提取并分析得出HCC的差異基因；TCMSP數(shù)據(jù)庫用于獲取逍遙散中的有效成分及作用靶點(diǎn)；對應(yīng)逍遙散與HCC的交集基因，綜合BioGRID、BIND、MINT、HPRD、DIP、GRID數(shù)據(jù)庫分析得出PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；利用David數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行GO和KEGG富集分析；PDB數(shù)據(jù)庫用于下載關(guān)鍵蛋白的3D結(jié)構(gòu)。

1.2 基因芯片篩選

以“l(fā)iver cancer normal”作為檢索詞，從GEO數(shù)據(jù)庫篩選出同時含有肝癌組織和正常組織的人源基因芯片，并下載基因芯片的matrix文件，文件編號：GSE118916，以獲取樣本信息。

1.3 差異基因(DEGS)的篩選與處理

使用GEO2R在線分析工具,從基因芯片中篩選肝癌組織與正常組織的差異基因。并以adj.P.Val<0.05，2Ilog2(FC)I>1為條件，從中篩選出肝癌組織中較正常組織顯著上調(diào)、下調(diào)的差異基因，借助MEV4.9.0(Multi Experiment Viewer)繪制基因聚類熱圖及火山圖。

1.4 逍遙散的活性成分及靶點(diǎn)挖掘

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)是一個獨(dú)特的中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺，它能捕捉藥物、靶標(biāo)和疾病之間的關(guān)系，能夠從整體層面研究藥物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)和疾病網(wǎng)絡(luò)，揭示中藥性質(zhì)與作用機(jī)制[5-7]。從TCMSP在線平臺(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)獲取逍遙散(柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、茯苓、甘草)中各味中藥的化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度(OB)和類藥性(DL)篩選出符合條件的候選活性成分及其對應(yīng)靶點(diǎn)，將OB≥30%，DL≥0.18設(shè)為篩選條件[8]。借助美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(NCBI)和Uniprot數(shù)據(jù)庫，將物種限定為“人”，將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的基因。

1.5 “中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析

將中藥的預(yù)測靶點(diǎn)與HCC相關(guān)靶點(diǎn)取交集，所得交集靶點(diǎn)即為逍遙散作用于HCC的預(yù)測靶點(diǎn)。構(gòu)建中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape3.7.2軟件中的“Network Analyzer”功能對中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，節(jié)點(diǎn)(node)代表逍遙散中所含藥物化學(xué)成分與潛在作用靶點(diǎn)；邊(edge)展現(xiàn)了中藥活性成分和其作用靶點(diǎn)之間的聯(lián)系，根據(jù)活性成分與靶點(diǎn)連接情況篩選出逍遙散作用于HCC的關(guān)鍵成分。

1.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)繪制主要借助Cytoscape3.7.2軟件中的BisoGenet插件，其中BisoGenet由6種蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫構(gòu)成的，包括Biological General Repository for Interaction Datasets(BioGRID)、Biomolecular Interaction Network Database(BIND)、Molecular Interaction Database(MINT)、Human Protein Reference Database(HPRD)、Database of Interacting Proteins(DIP)和Biological General Repository for Interaction Datasets(GRID)。本研究將上述逍遙散的作用靶點(diǎn)和HCC相關(guān)的疾病靶點(diǎn)分別映射到蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中，借助 BisoGenet 插件對2個蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行繪制，同時利用 cytoscape3.7.2合并2個蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并對交集網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行抽取，抽取獲得的交集網(wǎng)絡(luò)即為逍遙散治療HCC的直接和間接靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，并借助自由度、緊密度、特征向量中心性、中心中介性、網(wǎng)絡(luò)中心性和局部邊連通性等指標(biāo)，采用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霾寮﨏ytoNCA進(jìn)行進(jìn)一步的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，篩選出邊數(shù)大于250的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)，即“Big hubs”；然后篩選網(wǎng)絡(luò)中介數(shù)中心度大于61的節(jié)點(diǎn)，即為蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因[9]。上述獲得的相關(guān)成分及靶點(diǎn)則有可能是直接、間接調(diào)控這些節(jié)點(diǎn)，發(fā)揮治療HCC的作用。

1.7 GO基因功能富集分析

通過R語言中的“DOSE”、“clusterProfiler”、“enrichplot”R包對交集基因進(jìn)行GO功能富集分析，進(jìn)一步闡釋中藥活性成分的靶點(diǎn)蛋白在基因功能中的作用。

1.8 KEGG通路富集分析

通過R語言中的“clusterProfiler”、“org.Hs.eg.db”、“enrichplot”、“ggplot2”R包對交集基因進(jìn)行KEGG功能富集分析，進(jìn)一步闡釋中藥活性成分的靶點(diǎn)蛋白在通路功能中的作用。

1.9 逍遙散核心成分與關(guān)鍵靶基因的分子對接驗(yàn)證

先用ChemOffice軟件構(gòu)建活性成分的3D結(jié)構(gòu)保存為mol2格式并使其能量最小化。從PDB數(shù)據(jù)(https://www.rcsb.org/)下載關(guān)鍵蛋白的3D結(jié)構(gòu)PDB格式，運(yùn)用PyMOL軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行去水、加氫等操作，利用AutoDock軟件將活性成分及靶蛋白格式轉(zhuǎn)換為pdbqt格式，最后運(yùn)行Vina進(jìn)行對接。結(jié)合能小于0說明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合，目前對于活性分子的靶點(diǎn)篩選尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，這里通過對“藥物—HCC”交集靶點(diǎn)與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，篩選出兩者共有且度值最高的兩個蛋白分別與藥物中與之作用的同樣度值最高的兩個分子進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 HCC相關(guān)差異基因表達(dá)分析

通過對GEO芯片數(shù)據(jù)庫的基因芯片進(jìn)行挖掘分析，獲取HCC患者肝組織與正常人肝組織的基因表達(dá)譜中明顯影響和改變的基因共580個，其中上調(diào)基因280個，下調(diào)基因413個。差圖1,火山圖見圖2。

圖1 HCC差異基因熱圖Fig.1 The thermogram of HCC differential gene

2.2 化合物有效活性成分篩選

以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為條件，對TCMSP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，得到逍遙散中活性成分2 241個，其中來自柴胡的活性成分347個，來自當(dāng)歸的活性成分65個，來自白芍的活性成分118個，來自白術(shù)的活性成分22個，來自茯苓的活性成分29個，來自甘草的活性成分1 660個。

2.3 逍遙散有效活性成分—HCC網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析結(jié)果

將2 241個靶點(diǎn)與580個HCC差異基因取交集，得到27個交集基因，對應(yīng)逍遙散中99個候選活性成分，其中對應(yīng)甘草化合物77個，柴胡活性成分7個，茯苓活性成分4個，白術(shù)活性成分3個，白芍活性成分2個，混合活性成分6個。逍遙散有效活性成分見表1。借助軟件 Cytocsape3.7.2構(gòu)建中藥活性成分—靶點(diǎn)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中有127個節(jié)點(diǎn)(逍遙散活性成分節(jié)點(diǎn)100個，靶基因節(jié)點(diǎn)27個)和183條邊，見圖3。圖中度值最高的活性成分為槲皮素(quercetin)，其次為山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、甘草查爾酮A(licochalcone A)等。這些度值較高的活性成分可能是逍遙散治療HCC的關(guān)鍵活性成分。

表1 逍遙散干預(yù)HCC的有效分子成分

續(xù)表1(Continued Tab.1)

圖3 逍遙散有效活性成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Xiaoyaosan compound-target network注：綠色橢圓：甘草活性成分；綠色橢圓：白芍活性成分；藍(lán)色橢圓：柴胡活性成分；紅色橢圓：白術(shù)活性成分；灰色橢圓：逍遙散復(fù)合物活性成分；黃色橢圓：茯苓活性成分；粉色三角：靶基因。Note:Green ellipse:Gancao compound;Light green ellipse:Baishao compound;Blue ellipse:Chaihu compound;Red ellipse:Baizhu compound;Gray ellipse:Xiaoyaosan complex compound;Yellow ellipse:Fuling compound;Pink Triangle:Target gene.

2.4 逍遙散治療HCC的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

2.4.1 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，本研究發(fā)現(xiàn)逍遙散可以與1 375個靶點(diǎn)產(chǎn)生直接或間接作用，而這些靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互聯(lián)系多達(dá)24 942種。本研究利用蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步深入分析逍遙散影響HCC發(fā)生、發(fā)展中的靶點(diǎn)，繪制蛋白質(zhì)相互作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，為網(wǎng)絡(luò)分析和機(jī)制的探討提供了可能。

2.4.2 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

本研究使用Bisogenet插件，以DC≥61，BC≥250為條件，對逍遙散調(diào)控HCC的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選，旨在尋找網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，并在網(wǎng)絡(luò)中獲得更多節(jié)點(diǎn)的傳遞信息和更高的節(jié)點(diǎn)信息傳遞效率，充分發(fā)揮其在網(wǎng)絡(luò)中重要的作用。通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯狙芯抗舶l(fā)現(xiàn)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)50個，見表2，篩選策略示意圖見圖4。

圖4 逍遙散干預(yù)HCC核心靶點(diǎn)篩選策略示意圖Fig.4 Schematic diagram of Xiaoyaosan’s selection strategy for interfering with HCC core targets

表2 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點(diǎn)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

2.5 GO功能分析結(jié)果

27個逍遙散—HCC交集基因影響了271個生物學(xué)過程，選取P值排名20的功能信息，圖5～7。圖表顯示逍遙散活性成分主要富集在無機(jī)物質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)、細(xì)胞激素代謝過程金屬離子反應(yīng)、類固醇分解過程、伯醇代謝過程等生物過程中，在分子功能方面，主要涉及趨化因子活動、氧化還原酶活性、趨化因子受體結(jié)合等，細(xì)胞組成主要影響細(xì)胞周期蛋白復(fù)合物、蛋白激酶全酶復(fù)合物、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物等。

圖5 GO富集功能分析柱狀圖(CC富集結(jié)果)Fig.5 Histogram of GO enrichment function analysis(CC enrichment results)

圖6 GO富集功能分析柱狀圖(BP富集結(jié)果)Fig.6 Histogram of GO enrichment function analysis(BP enrichment results)

圖8 KEGG富集通路氣泡圖Fig.8 Bubble diagram of KEGG enrichment pathway注：圓點(diǎn)越大，富集基因數(shù)目越多；圓點(diǎn)顏色越紅，P值越小；逍遙散治療HCC的關(guān)鍵靶點(diǎn)參與的通路信息。Note:The larger the dot,the greater the number of enriched genes.The redder the dot,the smaller the P value;Pathway information on the involvement of key targets of Xiaoyaosan in the treatment of HCC.

2.6 KEGG富集通路分析結(jié)果

KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，27個交集靶點(diǎn)基因顯著富集在17條通路上(P<0.05，F(xiàn)DR<0.01)，見圖8，其中最有意義的10條通路包括細(xì)胞衰老信號通路、甾類激素生物合成信號通路、p53信號通路、化學(xué)性致癌信號通路、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、視黃醇新陳代謝信號通路、藥物代謝-細(xì)胞色素P450信號通路、代謝細(xì)胞色素P450的外源性物質(zhì)信號通路、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎信號通路，提示逍遙散通過作用以上多條通路來發(fā)揮治療HCC的作用。

2.7 逍遙散核心成分作用于CYP1A2、PTGS2和CDK1的分子對接驗(yàn)證

對“逍遙散有效成分—靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析可知，山奈酚、槲皮素與β-谷甾醇是逍遙散作用于HCC最為關(guān)鍵的核心成分，CYP1A2、PTGS2和CDK1不僅作為疾病的靶點(diǎn)，也同樣出現(xiàn)在最終所得的PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)之中且度值較高。一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時能量越低，發(fā)生的作用可能性越大。分子對接結(jié)果顯示槲皮素與CYP1A2和PTGS2，β-谷甾醇與PTGS2和CDK1，山奈酚與PTGS2和CYP1A2的分子對接結(jié)合能均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0 kJ/mol，由此表明二者之間具有較好的結(jié)合活性，結(jié)果見表3和圖9～14。

表3 逍遙散中部分核心活性成分與CYP3A4、PTGS2和CDK1的結(jié)合能

圖9 槲皮素-PTGS2Fig.9 Quercetin-PTGS2

圖10 β-谷甾醇-PTGS2Fig.10 β - sitosterol-PTGS2

圖12 β-谷甾醇-CDK1Fig.12 β-Sitosterol-CDK1

圖13 山奈酚-CYP1A2Fig.13 Kaempferol-CYP1A2

圖14 山奈酚-PTGS2Fig.14 Kaempferol-PTGS2

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過分析大數(shù)據(jù)來進(jìn)行藥物研究的新模式。將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與傳統(tǒng)的中醫(yī)藥有機(jī)結(jié)合，其整體性、系統(tǒng)性、動態(tài)性的特點(diǎn)與中醫(yī)整體觀念、辨證論治的理論相一致[10]。使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究中藥復(fù)方的作用機(jī)制是當(dāng)下藥理學(xué)研究的一個熱點(diǎn)[11]。逍遙散具有疏肝解郁，養(yǎng)血健脾，調(diào)和肝脾之功，是和解劑的代表方之一，臨床中常用以治療原發(fā)性肝癌。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，初步挖掘、分析逍遙散在干預(yù)HCC中多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的治療機(jī)制。

本研究分析了原發(fā)性肝癌與正常人相比其致癌的差異基因，得到明顯影響和改變的基因共580個，其中上調(diào)基因280個，下調(diào)基因413個，并將此作為疾病干預(yù)的靶基因。接著系統(tǒng)分析了逍遙散6味中藥(柴胡、白芍、甘草、白術(shù)、當(dāng)歸、茯苓)的有效成分，構(gòu)建有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，分析化合物與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。其中槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚等是有效成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵。槲皮素是甘草中的有效成分，β-谷甾醇是當(dāng)歸中的有效成分，山柰酚是甘草中的有效成分。已有研究表明，槲皮素具有良好的抑制細(xì)胞增殖，調(diào)控血管新生的作用，能夠抑制體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(EVC304)生長[12]；具有抗腫瘤，抑制Eca109細(xì)胞的遷移、侵襲及血管新生[13]，下調(diào)VEGF[14]的作用；同時還可以降低毛細(xì)血管脆性、擴(kuò)張冠狀動脈、增加冠脈血流量等。β-谷甾醇主要是抑制血管新生，其通過調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，對H22荷瘤小鼠具有一定的抑瘤作用[15]，還能夠調(diào)節(jié)人肺癌A549細(xì)胞增殖及凋亡[16]。山柰酚是一種有抗炎、抗氧化作用的黃酮類化合物；具有明顯的抗腫瘤作用，高攝入山柰酚可降低晚期大腸腺瘤的復(fù)發(fā)，體外實(shí)驗(yàn)表明山柰酚對小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16具有增殖抑制作用[17]；還能通過抑制銅離子誘導(dǎo)低密度脂蛋白氧化，成為氧化低密度脂蛋白，能降低單核巨噬細(xì)胞表面CD36蛋白的表達(dá)，阻止該細(xì)胞對氧化低密度脂蛋白的攝取，有效預(yù)防動脈粥樣硬化。除此之外，化合物中的多個成分具有抑制血管生長、減低細(xì)胞侵襲力、下調(diào)VECF表達(dá)等抗腫瘤機(jī)制作用。

對逍遙散的靶點(diǎn)進(jìn)行PPI映射并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，對網(wǎng)絡(luò)分析后發(fā)現(xiàn)了多個與多種復(fù)雜疾病緊密相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，如TP53、HSP90AB1、HSP90AA1、VCP、TOP2A、ITGA4、VCAM1、ESR1、HSPA8、MDM2等。研究將有效成分中的核心成分槲皮素、β-谷甾醇與關(guān)鍵靶基因進(jìn)行了分子對接驗(yàn)證，證明了其具有良好的親和力，進(jìn)一步佐證了本次研究的科學(xué)性。為了說明作用靶點(diǎn)在基因功能和信號通路中的作用，本研究進(jìn)行了 GO 功能富集和KEGG 通路富集分析。發(fā)現(xiàn)逍遙散能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞對無機(jī)物的反應(yīng)、細(xì)胞激素代謝、細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物、趨化因子活性及受體結(jié)合、激素代謝等功能，大多數(shù)基因富集到了與癌癥有直接或間接關(guān)系的通路上，包括甾體激素生物合成通路、P53信號通路、細(xì)胞衰老通路、化學(xué)致癌通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、視黃醇代謝通路、藥物代謝-細(xì)胞色素p450通路、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟通路等。已有研究表明P53信號通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、活化凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其通路中的p53蛋白大量表達(dá)時，可以上調(diào)Bcl-2的表達(dá)水平、下調(diào)Bax的表達(dá)來共同完成細(xì)胞凋亡的調(diào)控[18]。Zhu等[19]發(fā)現(xiàn)TNF信號通路激活時可提高了人肝癌細(xì)胞株MHCC-97L中的VEGF及MMP9的表達(dá)，使得癌細(xì)胞的侵襲能力得到增強(qiáng)。據(jù)此，可以推斷逍遙散可能通過抑制該通路來達(dá)到延緩HCC發(fā)生發(fā)展的目的。IL-17通路是一條與炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號通路，近年來研究發(fā)現(xiàn)，IL-17在抗腫瘤治療中同樣發(fā)揮著重要作用。當(dāng)IL-17通路被激活時，荷瘤小鼠體內(nèi)的 MHCⅠ、MHCⅡ和LFA-1大量表達(dá)，同時促進(jìn)了IFN-γ、IL-12的分泌、進(jìn)而發(fā)揮CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[20]。

已有研究表明逍遙散能夠抑制實(shí)體腫瘤的生長，并且對荷瘤造成的脾和胸腺指數(shù)具有一定的恢復(fù)作用[21]；通過引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化，誘導(dǎo)肝癌 SMMC-7721細(xì)胞凋亡[22]；提高機(jī)體免疫功能和調(diào)節(jié)癌基因的表達(dá)[23]；抑制MCF-7的細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性死亡等[24]。但對于其所影響的具體蛋白，具體信號通路的研究尚少，根據(jù)本次研究分析結(jié)果可以推斷其影響與肝癌直接或間接相關(guān)的蛋白及通路對肝癌組織進(jìn)行抑制，從而達(dá)到一定的治療目的。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步探究了逍遙散多成分、多靶點(diǎn)、多通路的復(fù)雜機(jī)制過程，對進(jìn)一步理解藥物—靶點(diǎn)相互作用機(jī)制提供了重要信息，為后續(xù)從逍遙散中提取有效藥物成分治療HCC提供了依據(jù)，也對未來論證中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論的科學(xué)性提供了參考。