牛 博，李麗娜，龐廣昌，*，魯丁強

(1.天津商業(yè)大學 生物技術與食品科學學院，天津 300134； 2.天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134)

生物獲取營養(yǎng)首先需要識別并傳感到營養(yǎng)才可能根據自身對營養(yǎng)的需求情況吸收相應的營養(yǎng)。植物要平衡、調節(jié)其體內的營養(yǎng)，必須建立有效的傳感系統，用來迅速傳感各個營養(yǎng)素在根際土壤中是否存在及其濃度的信息，以應對土壤中可利用的養(yǎng)分在時間和空間上的劇烈波動[1]。氮是植物生長最重要的元素，尿素CO(NH2)2是全球最常用的氮肥[2]。尿素不僅相對含氮量高，而且是植物體內精氨酸循環(huán)的重要中間代謝產物，對植物體內的氮素循環(huán)和碳氮平衡起到重要作用。

高等植物對無機氮(銨態(tài)氮、硝態(tài)氮)和有機氮的傳感吸收能力各有不同，現有的研究表明，大多數植物都存在對不同種類氮源的低親和力和高親和力2種傳感轉運系統[3-5]。迄今為止，對于氮源傳感和吸收的研究主要集中在植物體內硝酸根離子轉運系統和銨根離子轉運系統，但對尿素傳感、吸收和轉運系統的鑒定和相關功能的研究還停留在尿素也可以作為植物快速吸收利用的氮源階段[6]。雖然已發(fā)現了2類轉運尿素的膜蛋白，即MIPs和DUR3，它們分別在低親和力、高親和力尿素吸收和運輸中發(fā)揮作用[7-8]，但是其確切的傳感受體和機制仍需進一步的研究。

尿素的大量施用雖有助于農作物提高產量，但是由于植物對氮的利用效率并不清楚，這種做法會因為氮營養(yǎng)過剩而嚴重危害環(huán)境。尋找適合植物的最佳施肥量，需要深入了解不同植物根系傳感和吸收營養(yǎng)的動力學規(guī)律[9-10]。植物根系對養(yǎng)分的傳感能力始終受到科學家的關注，現有的研究方法多為通過同位素標記檢測其相關的吸收動力學或是異源表達相關基因驗證其效果，但根系對營養(yǎng)的傳感能力應遠高于其吸收能力，而生物必須先傳感到營養(yǎng)才可以進一步吸收利用。本課題組經過多年研究，已經成功構建了動物受體傳感器和動物組織傳感器，并進行了相關物質的傳感動力學研究[11-14]。目前在植物組織或植物受體傳感器的研究方面尚未見報道，如果能夠成功構建植物根分生組織和受體傳感器，并對相應的營養(yǎng)物配體進行傳感動力學研究，一方面有助于解決當下過度施肥引起的土壤板結和水環(huán)境污染；另一方面有助于進一步采用生物技術方法提高植物氮素利用效率[15-17]。該傳感器的成功構建可為植物根系營養(yǎng)傳感及其吸收和調節(jié)機制研究、農業(yè)精準施肥提供一種新的研究方法。

本研究選擇玉米、辣椒、花椰菜和黃瓜4種植物的根尖分生組織組裝傳感器，定量化測定傳感配體——尿素。通過電化學工作站和時間—電流曲線法測定尿素與玉米、辣椒、花椰菜和黃瓜根尖分生組織相互作用所產生的配體—受體識別和聯動變構所產生的電化學信號，得到4種植物根尖對尿素的傳感范圍和相應的動力學參數，并通過相應的培養(yǎng)實驗驗證其真實的生物學作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米(ZeamaysL.)、辣椒(CapsicumannuumL.苗、花椰菜(BrassicaoleraceaL.var.botrytisL.)、黃瓜(CucumissativusL.)苗各10株?？扇苄缘矸?、無水CaCl2、尿素等均購自天津市贏達稀貴化學試劑廠(中國)。海藻酸鈉來自天津光復精細化工研究所(中國)。所有其他化學品均為分析純。去離子水來自Millipore公司的Milli-Q純水系統(Elix Essential 5，美國)，并被用在所有的實驗中。

CHI660E型電化學工作站購自上海辰華儀器有限公司(中國上海)；核微孔膜(孔徑0.22 μm，周長25 mm)購自Whatman公司(英國)。

1.2 電極預處理與效果表征

將玻碳電極(glassy carbon electrode, GCE)用不同粒徑的α-Al2O3漿(1.00、0.30、0.05 μm)在麂皮上拋光，每次拋光后在超聲波水浴中清洗30 s，重復2～3次，然后用超純水清洗玻碳電極。在1 mol·L-1H2SO4溶液中使用循環(huán)伏安法對玻碳電極進行活化，活化時電壓的掃描范圍是-1.0～1.0 V、掃描速率是100 mV·s-1，重復掃描直至出現穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線圖。

將活化的玻碳電極置于1×10-3mol·L-1K3Fe(CN)6溶液(含0.20mol·L-1KNO3)中對其進行循環(huán)伏安曲線掃描，電壓的掃描范圍為-0.1～0.6 V，掃描速度為50 mV·s-1。同時，使用交流阻抗法表征電子傳遞到電極表面所受到的阻抗大小，以達到間接表征電極預處理后的界面情況。最后置于氮氣環(huán)境中干燥待用。

1.3 電化學生物傳感器的制備

溶液配置：①1%的可溶性淀粉溶液：稱取1 g可溶性淀粉溶于99 mL超純水中，之后加入1 mL 10%的戊二醛，80 ℃水浴攪拌加熱30 min。室溫條件下放置過夜。②2%的海藻酸鈉溶液：稱取2 g海藻酸鈉溶于100 mL超純水中，攪拌過夜。③ 5%的CaCl2溶液：稱取5 g CaCl2溶于100 mL超純水中。④將1%的可溶性淀粉溶液與2%的海藻酸鈉溶液以體積比1∶1混勻在平皿中，另取一平皿吸取等體積的5%的CaCl2溶液。

固定化植物組織傳感器組裝：將新鮮的根尖分生組織用超純水清洗干凈，在細胞培養(yǎng)皿中用手術刀切碎，過程中保持根尖濕潤，立即儲藏在4 ℃冰箱中備用。

將準備好的0.25 cm2的植物根尖分生組織放置于一張直徑為25 mm、孔徑為0.22 μm的核微孔膜的圓心上，然后覆蓋另一張，迅速將1號培養(yǎng)皿中的混合液均勻涂抹在核微孔膜邊緣，再將其邊緣浸沒在2號培養(yǎng)皿中，使得海藻酸鈉與CaCl2完全交聯，得到穩(wěn)定的螯合物，然后用超純水沖洗組裝好的植物根尖分生組織測定膜，沖洗掉殘留在膜上的Cl-、Ca2+等離子，最后將組裝好的植物根尖分生組織測定膜用皮筋固定在玻碳電極上，植物根尖分生組織要完全覆蓋電極極芯，再用超純水沖淋電極制成生物傳感器(圖1)。

1.4 電化學生物傳感器對植物根尖分生組織的測定方法

采用三電極系統，以固定好的“三明治”式植物根尖分生組織膜的玻碳電極作為工作電極，以Ag/AgCl電極作為參比電極，以鉑絲電極作為對電極，以超純水作空白對照，在一定的電壓下通過電流—時間測定法測定尿素溶液與植物根尖分生組織作用的響應電流值，以響應電流的變化率作為檢測指標，每個濃度平行測定3次。按公式(1)計算響應電流的變化率ΔI。

(1)

式(1)中：I1表示空白對照的響應電流值/A，I2表示待測定尿素溶液的響應電流值/A。

2 結果與分析

2.1 電極預處理效果的電化學表征

由圖2-A可以看出，電位差在80 mV以下，峰電流比值趨近于1。由圖2-B可以看出，在不同掃描速率條件下(25、50、75、100、125、150、200 mV·s-1)，活化后的玻碳電極(GCE)還原峰和氧化峰電流均和掃描速率的平方根呈良好的線性關系，說明玻碳電極經過處理后其氧化還原峰電流僅受擴散條件控制，玻碳電極作為裸電極的預處理效果達標，可以進行后續(xù)的組裝研究。

2.2 電極組裝過程及電化學表征

由圖3可以看出，在掃描速率為50 mV·s-1，掃描范圍為-0.1～0.6 V的條件下，玻碳電極使用雙核微孔膜組裝后，由于核微孔膜阻礙了電子向電極表面的傳遞，所以峰電流值低于裸電極峰電流值；在兩層膜中間組裝上植物根尖分生組織后峰電流值進一步減小，這是由于植物根尖分生組織進一步阻礙了電子的傳遞。由圖3峰電流的變化可以看出，該組織傳感器組裝成功。

圖2 玻碳電極預處理效果的循環(huán)伏安法表征(A)及預處理后的玻碳電極的還原峰和氧化峰電流和掃描速率的關系(B)Fig.2 Cyclic voltammograms of bare GCE (A) and relationship between scan rate and electric current of oxidation peak or reduction peak of bare GCE (B)

圖3 循環(huán)伏安法對電極不同階修飾段的表征Fig.3 Characterized electrode at different modification stages by cyclic voltammetry

圖4 電位對生物傳感器響應效果的影響Fig.4 Effect of response potential on the biosensor

2.3 電流—時間測定法的電位優(yōu)化

將構建好的植物根尖分生組織傳感器置于超純水中，采用電流—時間法，在不同電位下測試。以加入1×10-6mol·L-1的尿素前后穩(wěn)態(tài)電流差去衡量不同電位對該傳感器電化學響應效果的影響。由圖4可知，該傳感器在-0.38 V時電流變化值最大，我們選擇-0.38 V為恒電位進行植物根尖分生組織傳感器對尿素傳感動力學特性的研究。

2.4 植物根尖分生組織傳感器對尿素濃度的檢測范圍

將固定好的植物根尖分生組織傳感器用不同濃度的尿素溶液刺激，濃度從低到高依次測定，時間—電流法掃描，掃描電位選擇-0.38 V，靜置10 s左右，使受體和尿素充分結合后，第100秒電流值為穩(wěn)態(tài)電流，每組實驗均平行測試3次，采用的數據是經儀器軟件平均化后的響應電流，以減少誤差。以電流在受體—配基結合前后電流的變化率△I為縱坐標，為方便后續(xù)計算以配基—尿素濃度C(mol·L-1)的對數值lg(C)為橫坐標作圖，結果如圖5，在低濃度范圍內，電流變化值呈線性增長，說明此時根尖對尿素的傳感能力遠大于尿素的量，后一部分呈曲線式緩慢增長，說明組織對尿素的傳感能力已接近上限。實驗目的是找到最小響應濃度，繼續(xù)增大尿素濃度對后續(xù)細分測試濃度和聯動變構常數的計算沒有影響。因此，無需繼續(xù)增加尿素濃度。

由圖5知，玉米、辣椒、花椰菜和黃瓜分別在10-9～10-3、10-16～10-6、10-19～10-10和10-20～10-10mol·L-1尿素的濃度范圍內，響應電流的變化率隨著濃度的增加呈現類似酶促反應動力學曲線。

2.5 植物根尖分生組織傳感器對尿素傳感作用的動力學曲線

由圖5對電流變化率ΔI呈線性變化的濃度范圍做進一步的細分，通過時間電流法測定，用Origin 2019軟件分別對得到的參數曲線進行雙曲線擬合，得出4種植物準確的受體—配體互作動力學參數[18]，如圖6。

根據受體—配體互作動力學方程

(2)

當組織上的受體飽和時：

(3)

設[RT]為受體的初始濃度，則[R]=[RT]-[RL]，設[LT]是總配基濃度，則[L]=[LT]-[RL]，將[L]=[LT]-[RL]和[R]=[RT]-[RL]代入(3)式，經整理得

[RL]2-[RL]{[RT]+[LT]+Kd}+[RT][LT]=0。

(4)

上式為以[RL]為變量的一個雙曲線一元二次方程。當[RT]、Kd為固定時，[RL]隨[LT]的變化而變化，開始上升地很快，以后逐漸趨向于水平，這就是受體—配體互作的飽和曲線[19]。該式說明了受體與配體的結合具有配體飽和的效應，和米氏酶促反應動力學有相似的特征。于是我們可以獲得類似于Km值的重要動力學參數Ka(配體—受體互作所產生的聯動變構激活常數)。

從圖6可以看出，在較低濃度下，電流的變化率隨尿素濃度的增加而增加，表明此時根尖組織上的受體傳感能力遠高于檢測溶液中的配體濃度。當達到一定濃度時，隨著尿素濃度的持續(xù)增加，電流的變化率基本恒定或變化非常小，表明此時根尖組織上的受體傳感能力已達到飽和。上述過程表明，傳感器不僅反映了受體與配體的結合，還反映了受體與配體結合后的通過細胞內信號傳導和級聯放大導致的電化學信號的改變，如離子通道的開啟或關閉。

2.6 尿素與植物根尖分生組織上的受體互作所引發(fā)的聯動變構常數

對公式(4)變形，可以推導出

(5)

以1/[RL]為縱坐標，以1/[L]為橫坐標的雙倒數方程。直線的斜率為Kd/[RT]，橫軸截距為-1/Kd，縱軸截距1/[RT]。根據上述推導，再以尿素溶液濃度的倒數為橫軸，以電流變化率的倒數為縱軸通過Origin 2019軟件線性擬合。

得到擬合的線性回歸方程分別為：

圖5 玉米(A)、辣椒(B)、花椰菜(C)和黃瓜(D)在檢測范圍內的電流變化率Fig.5 Current changes of corn (A)， pepper (B)， broccoli (C)， and cucumber (D) in the detection range

由上述方程分別計算得出4種植物的根尖分生組織對尿素的聯動變構常數Ka，如表1所示。

表1 根尖組織對尿素的聯動變構常數

此處的聯動變構常數Ka和酶促反應參數Km值相似，定義為：達到組織上傳感受體飽和(電化學信號放大效應)一半時的配體濃度。顯然Ka越小，說明配體通過與受體互作所產生的電化學信號變化效應越高，傳感越靈敏。玉米的Ka值比其他3種植物至少高7個數量級?？梢酝茢嘤衩紫噍^于其他3種植物，對尿素的傳感能力很弱，或可判斷為：玉米在一定程度上存在對尿素的傳感缺陷。

2.7 植物組織傳感器的穩(wěn)定性及重現性

將制成的辣椒根尖組織傳感器在1×10-16mol·L-1的尿素溶液中連續(xù)測定10次，電流變化率的RSD為4.73%，表明該受體傳感器穩(wěn)定性能良好。取不同批次制備的電化學型組織傳感器5支，制成的玉米根尖組織傳感器在1×10-6mol·L-1的尿素溶液中連續(xù)測定10次，電流變化率的RSD為2.52%，表明該受體傳感器穩(wěn)定性能良好。

將構建好的根尖組織傳感器于4 ℃的超純水上方保存，每間隔24 h測定同一濃度的尿素溶液，第1～5天該傳感器的響應電流比較為穩(wěn)定，分別為100%、99.64%、88.32%、75.73%、70.01%；第6天的響應電流比為63.22%，表明該類型組織傳感器至少可穩(wěn)定使用5 d。

2.8 辣椒與玉米對尿素傳感動力學常數的比較與驗證

根據實驗結果，玉米與其他3種植物的傳感能力有顯著差距，辣椒根尖組織可以在10-15～10-10mol·L-1對尿素傳感，而玉米在該濃度范圍內應無明顯的傳感能力。為了驗證通過植物根尖分生組織傳感器所測定的動力學常數是否真實反映了植物根尖對尿素的傳感能力，我們以尿素為唯一氮源，在10-15～10-10mol·L-1的尿素培養(yǎng)液中，對玉米和辣椒苗進行培養(yǎng)實驗。

圖6 玉米(A)在10-8～10-4 mol·L-1、辣椒(B)在10-16～10-14mol·L-1、花椰菜(C)在10-19～10-4 mol·L-1和黃瓜(D)在10-20～10-18mol·L-1濃度范圍內電流變化率及雙曲線擬合Fig.6 Corn (A) at 10-8-10-4mol·L-1， pepper (B) at 10-16-10-14mol·L-1， cauliflower (C) at 10-19-10-4mol·L-1 and cucumber (D) at 10-20-10-18mol·L-1 current change rate and hyperbolic fitting in the concentration range

如圖7所示，我們將玉米與辣椒共同培養(yǎng)在尿素濃度從左至右依次為1×10-10、1×10-11、1×10-12、1×10-13、1×10-14和1×10-15mol·L-1的培養(yǎng)液中。結果表明：玉米在10～15 d內相繼死亡，而辣椒在培養(yǎng)液中正常生長。證明了玉米在低于其傳感能力的尿素培養(yǎng)液中不能正常生長，而辣椒可以在該尿素濃度范圍內正常生長。說明我們通過根尖分生組織研制的傳感器及其對尿素的傳感參數的確真實地反映了根對尿素的識別、傳感和吸收能力，同時發(fā)現，和其他3種植物相比，玉米對尿素的傳感存在明顯的缺陷。

圖7 玉米和辣椒在從左至右10-10～10-15mol·L-1的尿素溶液中培養(yǎng)Fig.7 Corn and pepper cultured in 10-10-10-15mol·L-1 urea solution from left to right

3 討論

過去一些植物學的經典理論認為尿素作為氮肥發(fā)揮作用需通過土壤中微生物產生的脲酶水解為CO2和NH3，NH3再被植物吸收利用。但現在越來越多的研究表明：在無土壤微生物存在的條件下， 外源尿素也可以被植物根系直接吸收，并在未降解的情況下轉運至地上部分[6]。近年來的研究進一步表明：可能存在2類不同的轉運體系，即需要能量且逆尿素濃度梯度的主動吸收途徑和膜蛋白促進型的尿素跨膜擴散的被動運輸途徑，即依賴于膜蛋白的尿素低親和力傳感轉運體系和高親和力傳感轉運體系[20]。通過固定根尖分生組織制備的生物傳感器，首次定量化測定了玉米、辣椒、花椰菜和黃瓜根尖分生組織對尿素的識別和傳感規(guī)律，得到4種植物根尖分生組織與尿素的雙曲線動力學模型，并計算出4種植物的重要動力學參數(Ka)，分別為Ka玉米=7.179 0×10-9mol·L-1；Ka辣椒=4.537 0×10-16mol·L-1、Ka花椰菜=9.908 5×10-20mol·L-1和Ka黃瓜=6.462 8×10-21mol·L-1。通過對比發(fā)現：玉米對尿素的傳感能力遠低于其他3種植物。為了驗證這些參數的生物學意義，以尿素為唯一氮源，在10-15～10-10mol·L-1尿素的液體培養(yǎng)基中對玉米和辣椒苗進行了培養(yǎng)和驗證實驗，結果證明：玉米在10～15 d內葉片枯黃死亡，而辣椒則可以正常生長，證明所得到的動力學參數(聯動變構常數Ka)真實地反映了植物根系對尿素的傳感能力，同時證明：和其他3種植物相比，玉米對尿素的傳感存在明顯的缺陷，其具體受體及其傳感、吸收和控制機制有待進一步深入研究。

4 結論

本研究成功地構建了一種植物根尖組織生物傳感器，并通過該傳感器定量化測定了尿素對玉米、辣椒、花椰菜和黃瓜的根尖組織互作、識別與聯動變構常數Ka，通過研究4種植物對尿素的傳感動力學，驗證了植物根尖可以直接傳感尿素，且不同種類的植物傳感尿素的能力不同。通過對玉米和辣椒在尿素為唯一氮源的液體培養(yǎng)基上進行的培養(yǎng)實驗，證明這些參數的確能夠反映植物根系對尿素的識別、傳感和吸收能力，同時也發(fā)現玉米存在對尿素識別、傳感和吸收缺陷，為進一步深入研究植物對尿素的識別、傳感、吸收和調控機制奠定了基礎。該生物傳感器操作簡單、易行、成本低、穩(wěn)定性和重現性良好，為探尋植物根系對土壤中有效營養(yǎng)成分的傳感利用及其動力學研究，為合理施肥、提高作物產量等提供了一種新方法。