曾祥亮，余冬冬，黃星鋒，李永軍

(1.龍港市信實莊稼醫(yī)院，浙江 龍港 325800； 2.浙江農(nóng)藝師學院，浙江 杭州 310021)

辣椒是中國五大蔬菜作物之一，有很高的營養(yǎng)價值、藥用價值和經(jīng)濟價值。辣椒病毒病又稱辣椒花葉病，是辣椒的主要病害之一，春、秋兩季均有發(fā)生，嚴重影響辣椒的產(chǎn)量和質(zhì)量。引起辣椒病毒病的病毒有多種，但主要為煙草花葉病毒(TMV)和黃瓜花葉病毒(CMV)?；疾±苯分饕憩F(xiàn)為花葉、黃化、矮化、壞死、畸形等癥狀，其中“三落”(落葉、落花、落果)現(xiàn)象最為嚴重。據(jù)不完全統(tǒng)計，每年因病毒病危害，辣椒可減產(chǎn)30%～50%。

已有研究發(fā)現(xiàn)，種子可攜帶病毒，辣椒煙草花葉病毒和黃瓜花葉病毒的鈍化溫度在55 ℃以上，而辣椒種子溫湯處理的耐溫閾限在55 ℃以下，常規(guī)熱處理無法鈍化上述2種病毒。常規(guī)種子消毒法、化學處理法對辣椒煙草花葉病毒和黃瓜花葉病毒的處理效果較差。

本試驗采用莖尖培養(yǎng)結(jié)合熱處理，旨在研究辣椒種子脫毒的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗辣椒品種為大果早豐。

1.2 方法

挑選粒大飽滿的早豐1號辣椒種子浸泡6～8 h，用自來水沖洗1～2 h，75%的酒精處理2 min，無菌水沖洗2～3次，0.1%氯化汞消毒5～7 min，再用無菌水沖洗5～6次，播于1/2 MS無激素固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為光照∶黑暗14 h∶10 h，光照強度2 000 lux，白天溫度(26±1)℃，夜晚溫度(23±1)℃，待無菌苗出現(xiàn)2片以上真葉時，用汁液摩擦接種進行指示法病毒檢測，無菌水處理的作為對照。

以MS為基本培養(yǎng)基，加入3%的蔗糖，0.7%的瓊脂，pH 5.8～6.0，并在培養(yǎng)基中添加不同濃度的生長調(diào)節(jié)劑，建立適宜辣椒生長的離體培養(yǎng)技術體系[1]。取病毒檢測為陽性的試材，待無菌苗有2～3片真葉時，切取其上端接種在上述培養(yǎng)基上進行繼代增殖培養(yǎng)，分別采用辣椒的子葉、胚軸、真葉接種在上述培養(yǎng)基上進行誘導再生培養(yǎng)[2]。

經(jīng)初代培養(yǎng)后，根據(jù)分化程度配不同的繼代培養(yǎng)基以促莖、葉和根的生長或愈傷組織分化成苗。將培養(yǎng)獲得的辣椒試管苗移栽到盛有消毒營養(yǎng)土的花盆中，上扣小燒杯，溫室內(nèi)培植數(shù)日后，移栽防蟲網(wǎng)室,采用植物指示檢測脫毒效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒繼代培養(yǎng)影響因素

以辣椒無毒苗切段(每節(jié)至少1個腋芽)為外殖體進行快速繁殖，找出適宜辣椒繼代增殖的激素組分和培養(yǎng)條件。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，在其中分別添加吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、奈乙酸(NAA)、6-芐基氨基嘌呤(6-BA)、赤霉素(GA)等不同生長激素。

如表1所示，培養(yǎng)基中僅加生長素IAA、NAA，或添加高濃度的IAA，低濃度BA，易形成愈傷組織，但不能分化成苗，說明生長素在適宜濃度區(qū)間可以促進組織分化，但濃度過大時便會抑制根的發(fā)生。高濃度BA與低濃度IAA有利于誘導出芽，但伸長較慢，且生根也很慢，需將伸長的苗轉(zhuǎn)到根誘導培養(yǎng)基中。

表1 培養(yǎng)基中添加NAA、IAA、BA對辣椒切斷培養(yǎng)的影響

如表2所示，IBA濃度越高，越容易形成愈傷組織，同時也促進生根，GA的濃度越高，有利于促進芽的萌發(fā)。培養(yǎng)基中加入0.25 mg·L-1GA和0.1 mg·L-1IBA后，較適合辣椒的繼代增殖，可一次成苗，成苗率高。

表2 培養(yǎng)基中添加GA、IBA對辣椒切斷培養(yǎng)的影響

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對辣椒子葉離體培養(yǎng)的影響

如表3所示，6-BA/IBA在11.25～12.5時器官分化率較高，6-BA/IBA在11.7～15時器官分化率較低。

表3 不同6-BA、IBA濃度對辣椒子葉器官分化的影響

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑對辣椒胚軸離體培養(yǎng)的影響

采用大果早豐辣椒品種的下胚軸，分別離體培養(yǎng)在附加不同種類和濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上，研究其對辣椒胚軸愈傷組織的誘導及再生情況[3]。試驗結(jié)果顯示，在培養(yǎng)基中添加5 mg·L-16-BA和0.8 mg·L-1IBA后，培養(yǎng)基對芽的誘導率較高(表4)。

表4 不同6-BA、IBA濃度對芽誘導的影響

2.4 熱處理溫度對脫毒效果的影響

如表5所示，隨著處理溫度的增加和處理時間的延長，處理植株的成活率逐步降低。當溫度高于40 ℃時，植株均不能長時間存活；當溫度低于38 ℃時，植株均能較好生長。在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，病毒的鈍化效果越好。在不影響辣椒存活的前提下，隨著熱處理溫度的升高，植株的脫毒效果也就越好。實驗結(jié)果表明，38 ℃的熱處理4～6周時，辣椒脫毒效果最佳。

表5 不同處理溫度對植株成活率的影響

3 討論

由于辣椒外植體中不具有足夠的內(nèi)源激素，只有附加不同濃度的激素，才能促進辣椒外植體芽分化和芽伸長[4]。培養(yǎng)基中添加的激素種類、不同激素配比及其他生長因子對辣椒外植體分化和再生芽伸長影響較大。已有研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加4～6 mg·L-16-BA對辣椒外植體芽誘導效果最好[5]。本研究結(jié)果表明，較高的6-BA與IBA比值有利于不定芽的誘導和分化。影響辣椒再生植株的關鍵問題是分化的芽不能進一步伸長，大多只能見到一團葉片，由于選材及其他原因的影響，多數(shù)試驗中植株再生頻率低，不定芽生長能力差，有的甚至停留在芽誘導階段，不能進一步生長，這主要與外植體的不同生理狀態(tài)及培養(yǎng)基成分有關。隨著處理溫度的增加和處理時間的延長，處理植株的成活率逐步降低。38 ℃的熱處理4～6周時，辣椒脫毒效果最佳。