景晶 王杉 劉欣 楊聲 鄧靜 張玉梅 楊志勇 張力思 張亦農(nóng)

國家體育總局反興奮劑中心（北京100029）

蛋白同化類固醇（anabolic androsgenic steroids）是一類能夠促進(jìn)肌肉和力量增長，加快訓(xùn)練后恢復(fù)的激素，因此常常被運(yùn)動(dòng)員使用來提高競技能力，但長期使用會(huì)對運(yùn)動(dòng)員的身體造成傷害[1-3]，并且是對體育競賽的公平公正原則的極大挑釁，1974 年國際奧委會(huì)規(guī)定體育運(yùn)動(dòng)中禁止使用該類物質(zhì)[4]。

上世紀(jì)60 至70 年代采用放射免疫方法檢測該類物質(zhì)[5]，這種方法因?yàn)樘禺愋圆?、適用范圍局限等原因很快就被氣相質(zhì)譜法取代[5-6]。目前，世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（World Anti-Doping Agency，WADA）對于蛋白同化激素檢出能力的要求（Minimum Required Perfor?mance Levels，MRPL）一般在2～5 ng/ml，對檢測能力提出了更高的要求。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，相對于單極質(zhì)譜而言，氣相串接質(zhì)譜具有去干擾能力更強(qiáng)、靈敏度更高等優(yōu)點(diǎn)，可以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、科學(xué)性。目前，WADA 認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室普遍采用氣相串接質(zhì)譜進(jìn)行外源性蛋白同化類激素的初篩和確證[7]。

與初篩目的不同，WADA在技術(shù)文件TD2015IDCR[8]中規(guī)定了確證方法需要滿足相對保留時(shí)間和離子豐度比的要求，對確證方法提出了更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)囊?。盡管如此，WADA 并沒有頒布統(tǒng)一的關(guān)于確證方法驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究結(jié)合興奮劑檢測實(shí)際需求，建立一種適應(yīng)常規(guī)檢測、符合技術(shù)文件TD2015IDCR 要求的外源性蛋白同化類激素的確證方法。該方法涵蓋WA?DA歷年陽性檢出率較高、WADA要求實(shí)驗(yàn)室必須檢測出（符合技術(shù)要求）的44種外源性蛋白同化類激素，能更好地為興奮劑檢測工作提供科學(xué)、準(zhǔn)確的保障。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

氣相串接質(zhì)譜（GC-MS/MS）:7693/7010Agilent Te?chonlogies；電熱恒溫水浴箱：HW1，北京醫(yī)療設(shè)備廠；離心機(jī)，Thermo fisher 公司；Vortex-2 渦旋混勻器：Sci?entific Industries 公司；氮吹儀：北京洼里醫(yī)療機(jī)械廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；冷凍機(jī)，Xutemp公司；10 mL螺紋試管：Corning公司。

1.2 材料與試劑

44 種外源性蛋白同化類激素對照品溶液：澳大利亞計(jì)量院（NMI）；甲睪酮對照品：美國Sigma公司；氘代內(nèi)標(biāo)d4-雄酮-葡萄糖醛酸和d5-本膽烷醇酮（d4-An?drosterone-glucuronid acid，d5-Etiocholanlone）對照品：澳大利亞計(jì)量院（NMI）；β-葡萄糖醛酸苷酶E. Coli IXA 型：美國Sigma 公司；叔丁基甲醚：美國Dikma 公司；N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA）：美國Sigma 公司；碘化銨（NH4I）：北京J&Kchemical 公司；乙硫醇（Ethanethiol）美國Sigma 公司；0.2M 磷酸鹽緩沖液、20%碳酸鈉:碳酸氫鈉（1∶1）緩沖液等試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 試劑與材料的制備

混合對照品工作液：將已稀釋成100 ng·μL-1的對照品工作液從保干器中取出，用移液器分別量取44種對照品工作液（100 ng·μL-1）20 μL至10 mL螺紋試管中，55℃下氮?dú)庀麓蹈?。加入甲醇定容? mL加蓋混勻，配制成混合對照品工作液。

內(nèi)標(biāo)溶液：取出安瓿瓶恢復(fù)至室溫，加入200 μL甲醇，分3次轉(zhuǎn)移至1.5 mL螺口小瓶中，置于55℃下氮?dú)庀麓蹈?。用移液器加?56 μL（說明書中質(zhì)量為0.956 mg）甲醇定容后密封混勻，配制成濃度為1 mg·mL-1的d4-雄酮-葡萄糖醛酸對照品母液。如上所述分別配制濃度為1 mg·mL-1的d5-本膽烷醇酮和甲基睪酮對照品母液。

用移液器分別量取上述母液64、40、20 μL 至10 mL 螺紋試管，加入甲醇定容至5 mL，混勻密封置于4℃冰箱保存。根據(jù)尿樣中內(nèi)標(biāo)d4-雄酮-葡萄糖醛酸/d5-本膽烷醇酮（結(jié)合/游離）判斷樣品酶解效率，確保葡萄糖結(jié)合型代謝產(chǎn)物酶解效果。

0.2 M 磷酸鹽緩沖液：稱取108 g 磷酸二氫鉀和240 g 十二水合磷酸氫二鈉，加入4000 mL 純水，振搖至完全溶解，pH在6.0～7.0之間。

β-葡萄糖醛酸苷酶工作液：取適量β-葡萄糖醛酸苷酶凍干粉，倒入50 ml 離心管，然后加入0.2M磷酸緩沖液配制成濃度為50 units/μl的工作液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

20%碳酸鈉∶碳酸氫鈉（1∶1）緩沖液：分別稱取碳酸鈉和碳酸氫鈉各500 g，加入4000 mL 純水，振搖至完全溶解，pH為9.0～10.0之間。

衍生化試劑：取適量MSTFA、NH4I 和Ethanethiol，配制成1000∶2∶6（w∶w∶v）的衍生化試劑。

2.2 樣品前處理

所有受試尿樣放置室溫下，取2 mL 尿樣置于10 mL 螺紋試管中，加入1 mL 磷酸鹽緩沖液和50 μl β-葡萄糖醛酸苷酶工作液，渦旋器混勻，置于55℃恒溫水浴中酶解2小時(shí)，取出?；謴?fù)至室溫后加入20%碳酸鈉︰碳酸氫鈉（1︰1）緩沖液500 μl，然后加入4 mL叔丁基甲醚，加蓋渦旋器混勻。將試管放入離心機(jī)3000 rpm/min離心3分鐘，取出試管置于－30℃冰浴中，充分冷凍后取上清液至潔凈試管中，置于55℃下氮?dú)庀麓蹈?。加?0 μl 衍生化試劑，渦旋器混勻，用移液器轉(zhuǎn)移至已在70℃電熱干燥箱中干燥1小時(shí)的1.5 mL的進(jìn)樣小瓶中。加蓋密封，于70 ℃下反應(yīng)30 分鐘后進(jìn)樣分析。

2.3 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：HP-1 毛細(xì)管色譜柱（25 m×0.2 mm i.d.×0.11 μm）；載氣：氦氣，進(jìn)樣口溫度：280℃；接口溫度：300℃；采用恒壓模式，柱壓20 psi；分流比：10∶1；進(jìn)樣量2 μl；升溫程序?yàn)椋浩鹗紲囟?77℃，以3℃/min 速率升至245℃，然后以17℃/min 的速率升至320℃，保持2.5 min。

質(zhì)譜離子源為EI 源，源溫度為230℃，電子能量70 eV，采集模式為MRM。各化合物硅烷化衍生物的檢測參數(shù)見表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 特異性和選擇性

選擇10份男女性別各半、比重分布在1.001～1.035之間、pH分布在5.5～9之間、不同色澤與渾濁度的空白尿樣2mL，按照2.2的前處理方法進(jìn)行處理，然后用2.3所述方法檢測，確認(rèn)10份尿樣中在目標(biāo)化合物出峰處無明顯干擾，說明該方法選擇性良好。在這些尿樣中添加WADA要求的MRPL濃度下44種目標(biāo)化和物。按照2.2 和2.3 所述方法進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示10 份樣品中目標(biāo)化合物的相對保留時(shí)間和離子豐度比均符合TD2015IDCR的要求，說明在MRPL濃度下該方法特異性良好。結(jié)果見表1。

表1 44種外源性蛋白同化激素的MRM參數(shù)

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

3.2 提取回收率

本驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)在高（5倍MRPL）、中（MRPL）和低（1/2倍MRPL）三種濃度下進(jìn)行。按照3.1所述原則選擇10份空白尿樣，每個(gè)濃度平行取2 份尿樣，1 份在前處理之前加入上述3個(gè)濃度的待測目標(biāo)化合物（峰面積用A表示），在萃取液中添加內(nèi)標(biāo)；1份在前處理之后的萃取液中加入上述3 個(gè)濃度的目標(biāo)化合物（峰面積用B 表示）和內(nèi)標(biāo)；按照2.2 和2.3 所述方法進(jìn)行檢測。2 份樣品的相對峰面積之比，即為回收率。按照下述公式進(jìn)行計(jì)算：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，44 種外源性蛋白同化激素的提取回收率較好，能夠滿足常規(guī)檢測的需要。

3.3 基質(zhì)效應(yīng)

按照3.1 所述原則選擇10 份空白尿樣，按照2.2 所述方法進(jìn)行前處理，在獲得提取液中加入MRPL 水平濃度的待測物質(zhì)，吹干，衍生化上機(jī)進(jìn)行檢測得到峰面積A。另外，在上述方法衍生化步驟之前加入上述濃度的目標(biāo)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)，吹干，衍生化，上機(jī)檢測得到峰面積B。基質(zhì)效應(yīng)可用下述公式計(jì)算：

基質(zhì)效應(yīng)=[ peak area（A）/ ISTD（A）] / [peak area（B）/ ISTD（B）]

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，尿樣基質(zhì)不會(huì)對檢測造成顯著影響。

3.4 穩(wěn)定性

按照3.1 所述原則選擇10 份空白尿樣，在這些尿樣中添加MRPL 濃度的44 種目標(biāo)化合物。按照2.2 和2.3所述方法進(jìn)行檢測，10份樣品中目標(biāo)化合物的相對保留時(shí)間和離子豐度比均符合TD2015IDCR 的要求，分析完成后將小瓶重新密封置于－20℃冰柜保存，7天后再次檢測，目標(biāo)化合物能檢出并且符合2015IDCR的要求，說明樣品衍生化后在－20℃條件下密封保存，7天內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5 攜帶污染

攜帶污染主要是體現(xiàn)樣品之間的污染程度，對定量物質(zhì)的檢測結(jié)果會(huì)產(chǎn)生較大影響，一般要求攜帶污染的信號(hào)強(qiáng)度應(yīng)低于最低定量限的20%。

取本方法驗(yàn)證中添加5 倍MRPL 濃度目標(biāo)化合物的樣品，同一序列中隨行1個(gè)空白尿樣作為陰性質(zhì)控，未發(fā)現(xiàn)攜帶污染。

4 結(jié)論

采用氣相色譜串接質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立了一種檢測人尿中44 種外源性蛋白同化類激素的檢測方法。經(jīng)過方法驗(yàn)證，篩選出特異性和選擇性良好的檢測參數(shù)，能有效降低基質(zhì)對待測物質(zhì)的影響，穩(wěn)定性良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法可檢測人尿中44 種外源性蛋白同化類激素。