王志昇 李夢(mèng)婷 姬勇敢 楊萌萌

寧夏醫(yī)科大學(xué)1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，2藥學(xué)院（銀川750004）

原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有85.4 萬(wàn)例新發(fā)患者，其中約50%發(fā)生在我國(guó)，并呈逐年上升趨勢(shì)，現(xiàn)有的治療手段如手術(shù)、放療、化療等都有不同的弊端，無(wú)法徹底根除［1-2］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因治療已成為治療腫瘤最具潛力的方法之一。基因治療要想成功實(shí)施，靶基因的選擇至關(guān)重要。眾所周知，原發(fā)腫瘤的發(fā)展以及轉(zhuǎn)移關(guān)鍵依靠新生血管的生成來(lái)提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)。因此，內(nèi)皮抑素、血管抑素基因等抗血管生成基因治療作為一種抗癌策略廣受關(guān)注［3］。內(nèi)皮抑素是膠原ⅩⅧ的C 末端水解片段，是研究最廣泛的內(nèi)源性血管生成抑制劑之一。血管抑素是纖溶酶原內(nèi)部蛋白水解片段的四個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域中的第一個(gè)，被認(rèn)為是一種有效的內(nèi)源性血管生成抑制劑。目前血管抑素和內(nèi)皮抑素已在不同的表達(dá)系統(tǒng)如慢病毒［4］、腺相關(guān)病毒［5］以及減毒鼠傷寒沙門氏菌［6］等獲得了表達(dá)，并在不同的腫瘤模型中表現(xiàn)出了一定的抗腫瘤潛力。然而，這些病毒或細(xì)菌載體在人體內(nèi)的生物安全性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。與這些病原體相比，桿狀病毒是一種昆蟲病毒，對(duì)哺乳動(dòng)物和人類無(wú)致病性，但能有效進(jìn)入多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞這一特點(diǎn)使其成為良好基因傳遞潛能的載體。因此，本研究為了提高抗血管生成基因治療的效果和安全性，擬以桿狀病毒為載體，表達(dá)由人內(nèi)皮抑素和血管抑素組成的融合蛋白（human endostatin and angiostatin，hEA），以此來(lái)評(píng)價(jià)桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 的抗血管生成功能和抗肝癌效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞pFastBac DUAL 質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；pUNO1-hEndo18Angio 質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)InvivoGen 公司；pEGFP-C1 質(zhì)粒、大腸埃希菌DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞、昆蟲Sf-9 細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞HepG2 和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC 由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心保存。Sf-9 細(xì)胞在含有10 %胎牛血清（FBS）的Grace 昆蟲培養(yǎng)基（含3.3 g/L 水解乳蛋白和3.3 g/L 酵母提取物）于27 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；HepG2 和HUVEC 細(xì)胞用含有10 % FBS的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4～6 周齡，體質(zhì)量為18～22 g，SPF 級(jí)雄性BALB/c 裸小鼠由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心標(biāo)準(zhǔn)化的SPF 級(jí)動(dòng)物屏障環(huán)境中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)審核并獲得批準(zhǔn)。

1.1.3 主要試劑各種內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、Taq DNA 聚合酶和dNTP 購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；DNA Marker 購(gòu)自南京諾唯贊生物公司；質(zhì)?；厥赵噭┖?、DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技公司；MTT 試劑盒、BCA 試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物；丁酸鈉購(gòu)自Sigma 公司；FBS、Grace 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基及Lipofectamine 2000 購(gòu)自Gibco 公司；Angiostatin ELISA 試劑盒購(gòu)自南京云克隆公司；Matrigel 基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)康寧公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器PCR 儀（T100，美國(guó)BIORAD 公司）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Multiskan FC，美國(guó)Thermo 公司）；倒置顯微鏡（Axio Vert.A1，德國(guó)蔡司公司）；高速冷凍離心機(jī)（Centrifuge 5430R，美國(guó)Eppendorf 公司）；CO2培養(yǎng)箱（Forma 311，美國(guó)Thermo 公司）。

1.2 方法

1.2.1 pBac-ChEA 質(zhì)粒的構(gòu)建以質(zhì)粒pFastBac DUAL 為骨架，將pPh 啟動(dòng)子替換為CMV 啟動(dòng)子，CMV 啟動(dòng)子從pEGFP-C1 質(zhì)粒通過引物CMV-F：5′-CGCGGTATACTAGTTATT AATAGTAATCAA-3′和CMV-R：5′-GCGGGATCCGGATCTGACGGTTCACTAAAC-3′擴(kuò)增獲得（下劃線為分別引入的BST Z17I和Bam HI 酶切位點(diǎn)），獲得的重組質(zhì)粒命名為pBac-CMV。以質(zhì)粒pUNO1-hEndo18Angio 為模板，設(shè)計(jì)引物hEA-F：5′-TCAGGATCCCGCCACCA-TGTAC AGGATGCAACTC-3′和hEA-R：5′-GCGAAGCTTTCATACAACACTCGCTTCTGT-3′（下劃線為分別引入的Bam HI 和Hind III 酶切位點(diǎn)），用于擴(kuò)增hEndo18Angio（hEA）基因，將hEA PCR 產(chǎn)物雙酶切回收后插入同樣位點(diǎn)酶切后的pBac-CMV 質(zhì)粒中，獲得的重組質(zhì)粒命名為pBac-ChEA。

1.2.2 重組病毒粒子的獲得重組病毒的獲得按照Bac-to-Bac（Invitrogen）表達(dá)系統(tǒng)說明書操作。將pBac-ChEA 轉(zhuǎn)化DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)三抗（卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素）篩選，提取桿狀病毒DNA，經(jīng)由Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染Sf-9 細(xì)胞，27 ℃培養(yǎng)，待細(xì)胞大部分從瓶底脫落時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心取上清液，作為原毒種P1 代毒，再以1 MOI 的重組病毒量繼續(xù)感染Sf-9 細(xì)胞，完成重組病毒的增殖，直至P3 代毒，分裝，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。?duì)照質(zhì)粒pBac-CMV 按照同樣方法處理。經(jīng)PCR 鑒定正確的重組病毒分別命名為Bac-ChEA和Bac-CMV，病毒的滴度通過噬斑實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

1.2.3 在HUVEC 細(xì)胞中的表達(dá)將Bac-ChEA 和Bac-CMV 以MOI 400 轉(zhuǎn)導(dǎo)HUVEC 細(xì)胞，所加入的病毒先用昆蟲培養(yǎng)基稀釋，然后與不含NaHCO3的DMEM 培養(yǎng)基配成1∶4 的比例，然后將混合培養(yǎng)液加入細(xì)胞中，使其完全覆蓋細(xì)胞，于27 ℃，搖床上孵育5～6 h，吸出培養(yǎng)液，加入含有3 mmol/L 丁酸鈉的DMEM 完全培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，第2 天更換為不含丁酸鈉的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直到第3 天收集細(xì)胞，按照Angiostatin ELISA 試劑盒說明書的方法進(jìn)行操作，最后用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)各孔的吸光度值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各組hEA 蛋白的濃度。

1.2.4 對(duì)HUVEC 細(xì)胞增殖能力的影響將HUVEC 細(xì)胞接種于96 孔板中（4 × 103個(gè)/孔），待細(xì)胞貼壁后，將Bac-ChEA 和Bac-CMV 以MOI 400 轉(zhuǎn)導(dǎo)HUVEC 細(xì)胞，對(duì)照組為不含病毒的空轉(zhuǎn)導(dǎo)組。直到第3 天，每孔加入50 μL 1×MTT 試劑繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后吸出上清液，加入150 μL DMSO，立即通過酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值。細(xì)胞存活率（%）=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%

1.2.5 對(duì)HUVEC細(xì)胞遷移能力的影響將HUVEC細(xì)胞接種于6 孔板中（7 × 105個(gè)/孔），待細(xì)胞貼壁 后，將Bac-ChEA 和Bac-CMV 以MOI 400 轉(zhuǎn) 導(dǎo)HUVEC 細(xì)胞，對(duì)照組為不含病毒的空轉(zhuǎn)導(dǎo)組，過夜培養(yǎng)后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用槍頭在每孔中筆直劃一條線，使其成為無(wú)細(xì)胞區(qū)域，用PBS 清洗后加入含有1 % FBS 的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃，5 % CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別于培養(yǎng)開始時(shí)和培養(yǎng)24 h 時(shí)在倒置顯微鏡下拍照，最后用Image J 軟件統(tǒng)計(jì)劃痕縮小的面積。

1.2.6 對(duì)HUVEC 細(xì)胞血管形成能力的影響將Bac-ChEA 和Bac-CMV 以MOI 400 轉(zhuǎn) 導(dǎo)HUVEC 細(xì)胞，對(duì)照組為不含病毒的空轉(zhuǎn)導(dǎo)組，72 h 后消化并收集細(xì)胞。用Matrigel 基質(zhì)膠包被96 孔培養(yǎng)板，37 ℃孵育30 min，然后將重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞制成懸液（5×105cell/mL），每孔加入100 μL，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h，然后用倒置顯微鏡觀察血管網(wǎng)絡(luò)形成并拍照，每孔任意選取5 個(gè)視野，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，通過Image J 軟件統(tǒng)計(jì)分析血管網(wǎng)絡(luò)總主段長(zhǎng)度。

1.2.7 體內(nèi)抗腫瘤效果評(píng)價(jià)取200 μL 生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2 細(xì)胞懸液（1 × 107cell/mL）接種在BALB/c 裸小鼠背部左側(cè)皮下，當(dāng)腫瘤體積長(zhǎng)至100 mm3時(shí)，隨機(jī)分為3組，每組5只，分別在瘤內(nèi)注射200 μL Bac-ChEA 和Bac-CMV（1 × 108pfu/mL）以及等體積的PBS，每隔5 d 注射1 次，共注射3 次。每2 d 測(cè)量小鼠腫瘤體積，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到1 500 mm3時(shí)，認(rèn)定小鼠死亡，記錄小鼠的死亡情況。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過Kaplan-Meier 和Log-rank 檢驗(yàn)分析小鼠的存活率；計(jì)量資料兩組對(duì)比采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)結(jié)果以（）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組桿狀病毒Bac-ChEA 的PCR 鑒定將重組質(zhì)粒pBac-ChEA 轉(zhuǎn)化DH10Bac 細(xì)胞，提取重組病毒Bac-ChEA DNA，轉(zhuǎn)染Sf-9 細(xì)胞3 d 后，細(xì)胞大量從瓶底脫落，倒置顯微鏡下觀察可見細(xì)胞核膨大，胞內(nèi)顆粒增多，部分細(xì)胞裂解、死亡。此時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)堿裂解法提取病毒DNA，經(jīng)PCR 和核酸瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在預(yù)期位置處出現(xiàn)了特異性條帶，結(jié)果見圖1，證明hEA 基因已成功整合入病毒基因組中。

圖1 重組桿狀病毒Bac-ChEA PCR 鑒定Fig.1 PCR identification of recombinant baculovirus Bac-ChEA

2.2 在HUVEC細(xì)胞中的表達(dá)經(jīng)Angiostatin ELISA試劑盒檢測(cè)，Bac-ChEA 在HUVEC 細(xì)胞中能有效表達(dá)hEA 蛋白，其平均濃度達(dá)到了（223±20）pg/mL，而在轉(zhuǎn)導(dǎo)Bac-CMV 的細(xì)胞中基本檢測(cè)不到hEA 蛋白（圖2）。結(jié)果表明桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得了表達(dá)。

2.3 對(duì)HUVEC 細(xì)胞增殖能力的影響MTT 結(jié)果表明（圖3），Bac-CMV 組和空白對(duì)照組對(duì)細(xì)胞的增殖基本無(wú)影響，而Bac-ChEA 組能有效抑制HUVEC細(xì)胞的增殖，細(xì)胞平均存活率下降到了65%左右，與Bac-CMV組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），證明重組桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白能有效抑制HUVEC 細(xì)胞的增殖，而桿狀病毒本身對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)影響。

圖2 桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白在HUVEC 細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 Baculovirus mediated hEA protein expression in HUVEC cells

圖3 桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白對(duì)HUVEC 細(xì)胞增殖能力的影響（n=3）Fig.3 Effects of baculovirus-mediated hEA protein on the proliferation of HUVEC cells（n=3）

2.4 對(duì)HUVEC 細(xì)胞遷移能力的影響通過劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估其對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果見圖4，Bac-ChEA 組與Bac-CMV 和空白對(duì)照組相比，細(xì)胞遷移速度減慢，進(jìn)一步通過計(jì)算劃痕傷口面積，發(fā)現(xiàn)Bac-ChEA 組與Bac-CMV 組相比能顯著抑制HUVEC細(xì)胞傷口愈合（P＜0.05），而Bac-CMV組與空白組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白能夠有效地抑制HUVEC 細(xì)胞的遷移。

2.5 對(duì)HUVEC 細(xì)胞血管形成能力的影響通過體外成管實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白是否具備抑制HUVEC 細(xì)胞血管形成的能力。結(jié)果如圖5所示，空白對(duì)照組和Bac-CMV 組中HUVEC 細(xì)胞相互聚集，形成清晰可見的小管網(wǎng)絡(luò)，而Bac-ChEA 組的細(xì)胞較分散，抑制了小管形成。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)血管網(wǎng)絡(luò)主段長(zhǎng)度發(fā)現(xiàn)，與Bac-CMV 組相比，Bac-ChEA組的成管抑制能力更為顯著（P＜0.001）。說明重組桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白能有效抑制HUVEC 細(xì)胞血管的形成。

2.6 體內(nèi)抗腫瘤效果評(píng)價(jià)為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白體內(nèi)抗腫瘤效果，建立裸鼠皮下HepG2 腫瘤模型。結(jié)果表明（圖6a），PBS 組和Bac-CMV 組的平均腫瘤體積分別在給藥后24 d迅速增長(zhǎng)至1 500 mm3，而Bac-ChEA 組明顯抑制了腫瘤體積的增長(zhǎng)，直至第38 天才達(dá)到1 500 mm3。小鼠存活率結(jié)果（圖6b）證實(shí)，小鼠的壽命（中位生存期）從Bac-CMV 組的24 d 顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）至Bac-ChEA 組的36 d。這些結(jié)果共同證實(shí)桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白能夠在體內(nèi)有效地抑制腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了其生存期。

圖4 桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白對(duì)HUVEC 細(xì)胞遷移能力的影響（n=3）Fig.4 Effect of baculovirus-mediated hEA protein on the migration of HUVEC cells（n=3）

3 討論

桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)較其他病毒載體如腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒等具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：如對(duì)人類和哺乳動(dòng)物不引起致病，能在I 級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制缺陷，沒有預(yù)先存在的抗體；能容納大片段外源基因插入；重組病毒的構(gòu)建及純化操作簡(jiǎn)單等［7］。這些優(yōu)點(diǎn)使得桿狀病毒在疫苗生產(chǎn)［8］、表面展示真核蛋白［9］等方面得到了廣泛的應(yīng)用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)桿狀病毒攜帶含有目標(biāo)細(xì)胞功能啟動(dòng)子時(shí)，能有效地將基因轉(zhuǎn)移到目標(biāo)細(xì)胞中，使得桿狀病毒作為基因傳遞載體在基因治療方面表現(xiàn)出了很大的潛力［10-11］。

圖5 桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白對(duì)HUVEC 細(xì)胞血管形成能力的影響Fig.5 Effect of baculovirus-mediated hEA protein on the angiogenesis of HUVEC cells

圖6 桿狀病毒介導(dǎo)的hEA 蛋白體內(nèi)抗腫瘤效果評(píng)價(jià)Fig.6 Evaluation of antitumor effect of baculovirus-mediated hEA protein in vivo

本研究以桿狀病毒載體pFastBac DUAL 為骨架，將桿狀病毒pPh 啟動(dòng)子替換為哺乳動(dòng)物CMV啟動(dòng)子，然后在其作用下表達(dá)hEA 基因。通過PCR 和ELISA 檢測(cè)hEA 基因成功插入桿狀病毒基因組中，并成功在HUVEC 細(xì)胞中獲得表達(dá)。盡管CMV 是廣譜型哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子，但SINN 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，CMV 在胚胎干細(xì)胞（ESCs）中的表達(dá)活性很低，因此應(yīng)根據(jù)靶細(xì)胞的類型選擇合適的啟動(dòng)子。由于血管生成涉及到內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移以及隨后血管的形成，因此為了證實(shí)hEA 蛋白的抗血管生成活性，本研究以HUVEC 細(xì)胞為模型，驗(yàn)證hEA 蛋白的功能活性。結(jié)果表明，Bac-ChEA能有效抑制HUVEC 細(xì)胞的增殖、遷移以及血管網(wǎng)絡(luò)的形成，裸鼠肝癌腫瘤模型結(jié)果進(jìn)一步表明，Bac-ChEA 能有效抑制肝癌腫瘤體積的增長(zhǎng)，小鼠壽命（中位生存期）從Bac-CMV 組的24 d 顯著延長(zhǎng)至Bac-ChEA 組的36 d。盡管抗血管生成蛋白表現(xiàn)出了一定的抑制腫瘤生長(zhǎng)的潛力，但其主要是通過抑制腫瘤血管生成而非直接針對(duì)腫瘤細(xì)胞達(dá)到抗腫瘤目的。有學(xué)者將內(nèi)皮抑素與促凋亡蛋白TRAIL 或與化療藥吉西他濱或與放射療法聯(lián)合應(yīng)用，都表現(xiàn)出了增強(qiáng)的協(xié)同作用［13-15］。因此，為了提高抗血管生成治療效果，聯(lián)合化療或放療以及在桿狀病毒載體中插入多種抗血管生成基因、免疫刺激和腫瘤靶向自殺基因等的雞尾酒療法，成為腫瘤基因治療今后的發(fā)展方向。盡管桿狀病毒作為基因傳遞載體表現(xiàn)出了一定的潛力，但桿狀病毒介導(dǎo)的外源蛋白在宿主細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)以及在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)載體易被補(bǔ)體系統(tǒng)滅活，極大地影響了蛋白的表達(dá)效率。為此，研究者們開發(fā)了一系列的桿狀病毒嵌合系統(tǒng)，如AAV ITR［16］，Sleeping Beauty［17］系統(tǒng)等，這些系統(tǒng)都可不同程度的延長(zhǎng)外源基因的表達(dá)。為了抵抗血清補(bǔ)體系統(tǒng)滅活，通過在桿狀病毒表面展示補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子，如DAF［18］、CD46-DAF-CD59 融合蛋白［19］等手段可以有效地抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的攻擊。在筆者最近的研究中，借助SB 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和表面展示技術(shù)，成功構(gòu)建了既能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中長(zhǎng)效穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白又能有效抵抗補(bǔ)體系統(tǒng)攻擊的重組桿狀病毒載體［20］。

總之，盡管桿狀病毒作為基因傳遞載體仍有不足，但桿狀病毒的安全性以及操作的簡(jiǎn)便性使得其作為基因傳遞載體擁有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，通過對(duì)桿狀病毒改造，可以極大地改善其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。