蒲媛媛 鄭宏斌 李顯航 喻奇?zhèn)? 熊晶 夏忠文 羅家俊 李星悅 陳誼然 劉仁祥

摘?要：為了提高烤煙品種NC82葉片數(shù)改良的效率，本研究選用與NC82葉片數(shù)差異顯著的畢納1號分別作為母本和父本，構(gòu)建了P1、P2、F1、F2遺傳研究材料，采用“主基因+多基因”遺傳模型分析方法對烤煙葉片數(shù)進行了遺傳分析，并篩選了烤煙葉片數(shù)分子標記。結(jié)果表明：烤煙葉片數(shù)為非胞質(zhì)遺傳，受2對主效基因與多基因共同影響，最適遺傳模型為MX2-EA-AD，主基因+多基因遺傳率為92%，主基因和多基因加性效應(yīng)分別為-3.40、2.37;與葉片數(shù)連鎖的標記為標記TM20490和TM10102，遺傳距離分別是4.8cM和5.3cM。經(jīng)過試驗得知，烤煙葉片數(shù)為2對等加性主基因+加性-顯性多基因控制的數(shù)量性狀，主基因遺傳率大，采用回交技術(shù)結(jié)合分子標記輔助選擇可定向改良優(yōu)質(zhì)烤煙品種NC82的葉片數(shù)。

關(guān)鍵詞：烤煙;葉片數(shù);遺傳分析;SSR分子標記

中圖分類號：S572文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2020）03-0017-06?國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2020.03.003

The Genetic Analysig and Molecular Marker Screening of Leaf Number of Flue-cured Tobacco Varieries NC82 and Bina1

PU Yuanyuan.1，ZHENG Hongbin.2，LI Xianhang.1，YU Qiwei.3，XIONG Jing.3，XIA Zhongwen.3，LUO Jiajun.1，LI Xingyue.1，CHEN Yiran.1，LIU Renxiang.1 *

（1. College of Agriculture/Guizhou Key Laboratory of Tobacco Quality Research， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China; 2.China Tobacco Zhejiang Industrial Company， Hangzhou， Zhejiang 310000，China; 3. Bijie Branch of Guizhou Tobacoo Company， Bijie， Guizhou 551700， China）

Abstract：In order to improve the efficiency of improving the leaf number of flue-cured tobacco varieties NC82， this paper selected Bina 1 with a significant difference from the NC82 leaf number as the female and the male parent， respectively， and constructed P1， P2， F1， F2 genetic research materials The "main gene + polygene" genetic model analysis method was used to genetically analyze the leaf number of flue-cured tobacco and screen molecular markers of the leaf number of flue-cured tobacco. The results showed that the leaf number of flue-cured tobacco was non-cytoplasmic， which was affected by two pairs of major genes and polygenes. The optimal genetic model was MX2-EA-AD， and the inheritance rate of major gene+poly gene was 92%， and the additive effects of that were -3.40 and 2.37， respectively. The markers associated with leaf number were TM20490 and TM10102， and the genetic distances were 4.8 cM and 5.3 cM， respectively. In words， the leaf number of flue-cured tobacco was a quantitative trait controlled by 2 equally additive main genes+additive-dominant polygenes， and the main gene has a high heritability. Backcrossing technology combined with molecular marker-assisted selection can be directed to improve the number of leaves of NC82， a high-quality flue-cured tobacco.

Keywords：flue-cured tobacco; leaf number; genetic analysis; SSR molecular markers

烤煙是一種葉用經(jīng)濟作物，葉片數(shù)是煙葉產(chǎn)量的主要構(gòu)成指標之一，葉片數(shù)的多少直接影響煙農(nóng)經(jīng)濟收益和卷煙原料市場的供應(yīng)[1]。前人研究表明，烤煙葉片數(shù)遺傳率高[2]，單株葉片數(shù)與煙葉產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)[3-6]，對葉片性狀的遺傳分析結(jié)果表明，烤煙葉片數(shù)主要受基因加性效應(yīng)的影響[7]，同是受多基因共同作用[8-9]?？緹熑~片數(shù)加性、顯性效應(yīng)在不同的發(fā)育階段差異明顯，其互作效應(yīng)呈間斷性表達[10]。SSR分子標記因均勻覆蓋整個基因組，多態(tài)性高，操作簡單，是常用的提高目標性狀選擇效率和可靠性的輔助選擇方法，在烤煙分子標記研究方面，童治軍[11]等利用DH群體發(fā)現(xiàn)了10個有效葉片數(shù)相關(guān)QTL，宋健[12]等利用F1和F2群體發(fā)現(xiàn)3個葉片數(shù)動態(tài)的QTL，李茜[13]利用SSR和SRAP分子標記技術(shù)發(fā)現(xiàn)2個與烤煙有效葉片數(shù)相關(guān)的QTL，馮吉等[14]利用SSR分子標記建立煙草抗TMV分子標記輔助選擇育種體系，進一步加速抗TMV烤煙品種的培育，提高了煙草抗TMV的育種效率。本研究烤煙品種NC82品質(zhì)好，但自然葉片數(shù)較少，限制了NC82在煙葉生產(chǎn)中的應(yīng)用，改良NC82的葉片數(shù)對于促進該品種的應(yīng)用有重要意義;畢納1號是貴州省自育的烤煙品種，對貴州煙區(qū)的適應(yīng)性強，自然葉片數(shù)在32片左右[15]。因此，選用葉片數(shù)差異顯著的烤煙品種NC82和畢納1號為親本，構(gòu)建P1、P2、F1、F2遺傳研究材料，研究烤煙葉片數(shù)的遺傳及其SSR分子標記，可為定向改良NC82的葉片數(shù)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

以NC82為母本、畢納1號為父本，構(gòu)建了P1、P2、正反交F1、F2共4個世代的遺傳研究群體。

1.2?葉片數(shù)遺傳研究

1.2.1?材料種植

所有試驗材料于2018—2019年種植在貴州大學(xué)煙草育種科研基地。F2種植1600株，其他世代材料田間試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，三次重復(fù)，每小區(qū)三行，每行15株，株距為0.55m，行距為1.10m。其余栽培技術(shù)和田間管理方法按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)烤煙栽培技術(shù)方案實施。

1.2.2?葉片數(shù)的測定

參試材料煙株中心花開放時，按照煙草行業(yè)標準（YC/T 142-2010），測定所有煙株的葉片數(shù)。

1.2.3?葉片數(shù)遺傳統(tǒng)計方法

采用Microsoft Excel 2016軟件統(tǒng)計田間葉片數(shù)數(shù)據(jù);利用SPSS 23.0統(tǒng)計分析軟件進行葉片數(shù)差異顯著性分析、正態(tài)檢驗、卡方檢驗，采用“主基因+多基因”遺傳模型SEA軟件對烤煙葉片數(shù)進行遺傳模型選擇、檢驗及遺傳效應(yīng)分析。根據(jù)本研究中的葉片數(shù)調(diào)查數(shù)據(jù)，計算極大似然函數(shù)值和AIC（Akaike's Information Criterion）值。選擇相應(yīng)的G4F2（P1、P2、F1和F2）世代遺傳分析模型，依據(jù)最大熵值原則即AIC值最小的準則選擇最佳候選模型，采用均勻性（U.21、U.22、U.23）、Smirnov（nW.2）和Kolmogorov（Dn）等3種適合性檢驗，根據(jù)檢驗結(jié)果選擇統(tǒng)計量達到顯著水平個數(shù)最少的模型為最優(yōu)遺傳模型。采用最小二乘法從最優(yōu)遺傳模型的各成分分布參數(shù)估計各基因效應(yīng)值，分析各組合的遺傳效應(yīng)。

1.3?葉片數(shù)連鎖SSR標記篩選

測定植株葉片數(shù)后，取參試材料煙株的幼嫩葉片提取基因組DNA;親本和F1分別選取10株，F(xiàn)2全部按單株分別提取基因組DNA。DNA提取方法參照天根高效提取DNA試劑盒方法進行。采用瓊脂糖凝膠電泳法和微量分光光度法檢測DNA質(zhì)量和濃度。參照BINDER等[12]和童治軍[13]公布的煙草圖譜SSR標記序列信息，從兩張圖譜中隨機均勻選取了1000對引物，引物均由上海生工合成。PCR擴增體系為10μL體系（2xT5SuperPCRMix（PAGE）4μL，正向引物0.5μL反向引物0.5μL，模板DNA1μL，ddH2O 4μL）;擴增程序為：98℃預(yù)變性-98℃變性-58℃退火-72℃延伸，相應(yīng)時間為3min、10s、10s、10s，共34個循環(huán)，然后72℃延伸2min。擴增產(chǎn)物用10%聚丙烯酰胺進行凝膠電泳，然后進行銀染分析，采用“a、b、h”記錄方法統(tǒng)計出現(xiàn)與親本一致的帶型，最后使用JoinMapv4.0進行連鎖不平衡分析，篩選與烤煙葉片數(shù)緊密連鎖標記，構(gòu)建烤煙葉片數(shù)連鎖分子標記圖。

2?結(jié)果與分析

2.1?葉片數(shù)遺傳分析

2.1.1?遺傳類型分析

由表1可知，NC82平均葉片數(shù)為22.2片，畢納1號平均葉片數(shù)為31片，相差8.8片，兩者平均葉片數(shù)之間差異性極顯著（P<0.01）。正、反交F1平均葉片數(shù)分別為24.5片和25.7片，兩者之間差異不顯著（P>0.05），說明葉片數(shù)為細胞核遺傳，受細胞質(zhì)遺傳影響小。

由F2分離群體葉片數(shù)正態(tài)檢驗（圖1）可知，F(xiàn)2分離群體偏離正態(tài)分布，說明葉片數(shù)遺傳存在微效多基因作用。經(jīng)卡方檢驗，卡方值6.05

2.1.2?葉片數(shù)最適遺傳模型篩選

從表2、表3可知，MX2-EA-AD、MX2-AD-AD、MX2-A-AD、MX2-CD-AD、MX2-EAD-AD這5個模型的AIC值較小，作為備選模型。根據(jù)AIC準則，MX2-EA-AD模型的AIC值最小，為419.5469，MX2-EA-AD（2對等加性主基因+加性-顯性多基因）模型即為最適遺傳模型。

2.1.3?葉片數(shù)最適遺傳模型的遺傳參數(shù)

表4可知，最適模型MX2-EA-AD的群體平均數(shù)（m）為26.62，第1、2對主基因加性效應(yīng)值（da（d））均為-3.40，多基因加性效應(yīng)值[d]為2.37，多基因顯性效應(yīng)值[h]為-2.15，加性效應(yīng)>顯性效應(yīng)。主基因遺傳率為（h.2mg）87.41%，多基因遺傳率（h.2pg）為4.37%，主基因+多基因遺傳率（h.2mg+h.2pg）為91.78%。說明葉片數(shù)遺傳率大，受父本畢納1號影響較大，通過采用雜交育種、回交技術(shù)結(jié)合分子標記輔助選擇，以畢納1號為供體可定向改良優(yōu)質(zhì)烤煙品種NC82的葉片數(shù)。

2.2?葉片數(shù)SSR標記篩選

2.2.1?葉片數(shù)差異標記篩選

通過1000對SSR標記在親本間初篩選，在親本間共篩選出144對有差異且多態(tài)性、重復(fù)性和穩(wěn)定性都較好標記。為較好控制葉片數(shù)遺傳背景，消除遺傳背景影響，在F2分離群體中隨機挑選10株葉片數(shù)在19～22片和15株葉片數(shù)在31～34片的煙葉DNA，分別等量混合形成少葉、多葉葉片數(shù)的葉片數(shù)近等基因池，最后對親本間有差異的144對SSR標記進行逐一篩選后表明，PT50001、TM10588、TM20490和TM10240 4對SSR標記在葉片數(shù)近等基因池擴增條帶間具有差異。在少葉群體和多葉群體中分別挑選10株、20株……60株煙株，構(gòu)建6個等梯度葉片數(shù)近等基因池，結(jié)果表明，4對標記在近等基因池數(shù)量為40株以上時擴增差異條帶不明顯，10～30株之間的近等基因池均能擴增出差異條帶，說明在10～30株范圍內(nèi)構(gòu)建葉片數(shù)近等基因池較好，4個標記與葉片數(shù)性狀連鎖。

2.2.2?F2分離群體SSR標記篩選

圖2可看出，4對標記在F2分離群體的擴增條帶清晰、主帶明顯，分離正常。采用“a、b、h”記錄F2葉片數(shù)分離群體的擴增結(jié)果（表5），經(jīng)c2檢驗（c2（2，0.05）=5.99），4對標記基因型分離比均符合3：1理論分離比，4對標記與葉片數(shù)性狀相關(guān)。由已知的煙草遺傳連鎖標記圖可知，PT50001位于第7染色體上，其他3個標記位于第4染色體上。連鎖不平衡分析表明，TM10588、TM20490和TM10240 3對標記與葉片數(shù)性狀緊密連鎖，說明篩選到與烤煙葉片數(shù)連鎖的TM10588、TM20490和TM10240 SSR標記。

2.2.3?葉片數(shù)分子標記連鎖程度分析

由圖3可知，以標記TM10588為起始點，TM20490和TM10102相對TM10588遺傳距離分別為4.2cM和5.3cM，遺傳距離均小于10cM，表明獲得了與葉片數(shù)緊密連鎖的TM20490和TM10102標記。

3?結(jié)論與討論

大量研究表明，煙草葉片數(shù)屬于多基因控制的數(shù)量性狀[11，18-19]。本研究以NC82和畢納1號為親本，通過構(gòu)建P1、P2、正反交F1、F2 4世代遺傳研究群體，進行遺傳分析表明，烤煙葉片數(shù)最適遺傳模型為MX2-EA-AD，受2對等加性主基因+加性-顯性多基因控制的性狀，遺傳以加性效應(yīng)為主，加性效應(yīng)大于顯性效應(yīng)，與牛佩蘭等[10]和姚志敏等[20]研究結(jié)果類似，與張興偉等[8]和許明輝等[19]研究結(jié)果存在差異，說明烤煙葉片數(shù)受主基因和多基因共同作用影響。本研究烤煙葉片數(shù)主基因遺傳率（87.4107%）﹥多基因遺傳率（4.3701%），與張興偉等[8]研究結(jié)果一致，葉片數(shù)主要受主基因遺傳控制，說明葉片數(shù)性狀遺傳以父本畢納1號為主，可為NC82葉片數(shù)的改良提供優(yōu)質(zhì)有效的輪回親本。

本研究利用SSR標記篩選到的4個（PT50001、TM10588、TM20490和TM10102）與烤煙葉片數(shù)連鎖的標記，與童治軍等[17，21]公布的12個葉片數(shù)的相關(guān)標記不一致（其中在2012年對烤煙產(chǎn)量相關(guān)的6個農(nóng)藝性狀進行QTL定位分析中檢測到10個（TM10470、TM22123、TM10315a等）與葉片數(shù)相關(guān)的標記，2017年利用231份烤煙材料對其進行農(nóng)藝性狀和化學(xué)成分的關(guān)聯(lián)分析，檢測到2個（TM10846和PT607282）與葉數(shù)相關(guān)標記），標記產(chǎn)生差異的原因可能是所采用的親本、以及所構(gòu)建的遺傳研究群體不同導(dǎo)致的。4個標記中TM20490和TM10102與葉片數(shù)基因緊密連鎖，遺傳距離分別為4.8cM和5.3cM，說明標記TM20490和TM10102與葉片數(shù)性狀緊密連鎖，與前人在烤煙抗病性方面的結(jié)論類似[14，22-23]。

本研究表明，烤煙葉片數(shù)為2對等加性主基因+加性-顯性多基因控制的數(shù)量性狀，主基因遺傳率大，標記TM20490和TM10102與葉片數(shù)性狀緊密連鎖，采用回交技術(shù)結(jié)合分子標記輔助選擇，可進一步提高選擇準確性與選擇效率，實現(xiàn)NC82的葉片數(shù)的定向改良。

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