邵 萌，吳 芳，張 杰，董江濤，吳江東，柳小玲，章 樂(lè)，趙海軍，張萬(wàn)江

結(jié)核病(TB)是世界范圍內(nèi)單一致病菌導(dǎo)致死亡率最高的慢性傳染性疾病，約有1/4的人口感染了結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)。2019年全球結(jié)核病報(bào)告顯示，2018年結(jié)核病死亡人數(shù)較2017年降低了150萬(wàn)，但仍有1 000萬(wàn)新發(fā)病例，且各國(guó)的發(fā)病率差別很大，從每年每10萬(wàn)人不足5例到超過(guò)500例，全球平均水平約為130例，其中負(fù)擔(dān)最重的為青壯年人群，所占比例高達(dá)89%[1]。目前預(yù)防結(jié)核病唯一廣泛使用的疫苗是1921年問(wèn)世的卡介苗(以下簡(jiǎn)稱(chēng)BCG)，研究證明，BCG的保護(hù)期只有10至15年，這可能解釋了TB的發(fā)病人群主要是青壯年[2]，且隨著B(niǎo)CG不斷的傳代及接種后時(shí)間的延長(zhǎng)，其保護(hù)作用逐漸減弱[3]，也與BCG RD1和RD2區(qū)域編碼的重要抗原缺失有關(guān)[4]，加上結(jié)核病的診斷和耐藥結(jié)核病治療面臨的挑戰(zhàn)，迫切需要一種比BCG更有效的疫苗預(yù)防結(jié)核病。

本課題組前期利用原生質(zhì)體技術(shù)及電穿孔技術(shù)，以BCG和結(jié)核分枝桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)無(wú)毒株H37Ra菌株(以下簡(jiǎn)稱(chēng)H37Ra菌株)為親本，構(gòu)建及選育的新型結(jié)核病疫苗菌株B/R菌株[5](以下簡(jiǎn)稱(chēng)B/R菌株)在使用的安全性、毒性、定植能力及傳代穩(wěn)定性方面表現(xiàn)出較好的候選結(jié)核病疫苗的潛能。疫苗接種的終極目標(biāo)是能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效且長(zhǎng)久的免疫保護(hù)力，這種保護(hù)依賴(lài)于穩(wěn)定的免疫記憶的建立及維持[6]。因此，研究免疫記憶特征將對(duì)新型結(jié)核病疫苗的設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)具有重要意義。

本研究將以B/R菌株為研究對(duì)象，比較研究BCG、H37Ra和B/R菌株分別免疫小鼠后，對(duì)T細(xì)胞免疫記憶建立的影響，探討B(tài)/R菌株作為結(jié)核病疫苗菌株的短期免疫保護(hù)效果，為B/R菌株作為新型結(jié)核病疫苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種 BCG和H37Ra菌株由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，B/R菌株由本研究室構(gòu)建，－80℃保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡，健康雌性C57BL/6小鼠，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。所有研究按國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)的指導(dǎo)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)石河子大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.3 主要試劑 Mouse IFN-γELISA Kit，Mouse IL-2 ELISA Kit購(gòu)自杭州聯(lián)科生物公司，小鼠脾臟淋巴分離液購(gòu)自天津?yàn)蠊?，Anti-Mouse CD4PE-Cy5、Anti-Human/Mouse CD44FITC、Anti-Mouse CD62L PE、Anti-Mouse CD8a PE-Cy5購(gòu)自eBioscience公司，7 H11干粉和OADC購(gòu)自BD Phar mingen公司。

1.2 方 法

1.2.1 菌株培養(yǎng)和菌懸液制備 取出并解凍保存的BCG、H37Ra菌株及B/R菌株，在生物安全柜中將各菌株分別接種至新鮮制備的無(wú)菌改良羅氏固體培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)中培養(yǎng)3周后，取適量菌株至細(xì)菌研磨管中研磨、稀釋、比濁儀檢測(cè)細(xì)菌濃度，最后將細(xì)菌濃度調(diào)整為1×107cf u/mL。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及免疫 將64只小鼠隨機(jī)分為4組即PBS組、BCG組、H37Ra組和B/R組，其中36只用于免疫記憶水平的檢測(cè)(每組9只)，另外28只用于比較各菌株的短期保護(hù)效應(yīng)(每組7只)。各取0.1 mL菌懸液(含菌量為1.0×106cf u/mL)，用背部皮下注射方式無(wú)菌免疫相應(yīng)各組小鼠，免疫1次[7-8]，PBS組注射等體積的PBS。

1.2.3 ELISA檢測(cè)血清中IL-2和IFN-γ的水平分別在免疫小鼠后8周、12周和16周，每組取3只小鼠，眼球取血，將收取的小鼠外周血靜置30 min后低溫3 500 r/min離心10 min，收集血清，分裝－80℃保存。最后將所有時(shí)間點(diǎn)的各組血清，依據(jù)IL-2和IFN-γ的ELSA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 n m處檢測(cè)OD值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫記憶性淋巴細(xì)胞的分型及水平 在小鼠免疫后8周、12周和16周，小鼠眼球取血后，于無(wú)菌條件下提取各組小鼠的脾細(xì)胞，用移液器混勻并將脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，補(bǔ)充PBS至8 mL，混勻，4℃1 500 r/min離心10 min，棄上清;加3 mL PBS混勻，并將其緩慢加入另一盛有5 mL小鼠淋巴分離液的玻璃試管中，低速離心機(jī)，1 000 r/min，離心30 min;吸出淋巴細(xì)胞層，加PBS至8 mL，4℃1 500 r/min離心5 min，棄上清，2次;1 mL PBS重懸脾淋巴細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色觀察活細(xì)胞率98%，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)，取100μL至各組離心管中，加入CD4/CD8a PE-Cy5、CD44FITC、CD62LPE熒光標(biāo)記抗體(eBioscience，USA)，4℃避光孵育30 min;加1 mL PBS離心5 min，棄上清，2次;最后加300μL PBS重懸細(xì)胞準(zhǔn)備上機(jī)檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置空白管，單標(biāo)管。

結(jié)果分析時(shí)先以淋巴細(xì)胞設(shè)P1門(mén)，再分別以CD4＋、CD8＋細(xì)胞設(shè)P2門(mén)，以 CD62L，CD44的表達(dá)為分選標(biāo)記檢測(cè)TCM(CD62Lhi，CD44hi)及TEM(CD62Llo，CD44hi)的水平。

1.2.5 蘇木素伊紅染色(HE染色)及CFU計(jì)數(shù)評(píng)價(jià)免疫保護(hù)效果 小鼠免疫后8周，用減毒牛結(jié)核分枝桿菌BCG(5×106cf u/只)通過(guò)腹腔注射方式感染小鼠，攻擊后4周，每組取7只小鼠，其中3只小鼠肺臟做組織病理學(xué)分析，即取肺臟觀察整體病理變化，并保存在4%多聚甲醛溶液中固定72 h后進(jìn)行組織石蠟包埋、切片、烤片，用于HE染色。組織的病理?yè)p傷程度通過(guò)單盲法由病理醫(yī)生進(jìn)行觀察分析。每組其余4只做臟器菌落數(shù)計(jì)算，即無(wú)菌條件下取脾臟和肺臟分別置于研缽中充分研磨，加入含0.05%Tween80的無(wú)菌PBS(PBS-T)做倍比稀釋?zhuān)袷幤骰靹?，?個(gè)稀釋度的菌液100μL分別涂布于含10%OADC的7 H11培養(yǎng)基上，37℃恒溫倒置培養(yǎng)4周后計(jì)算各組脾和肺臟的cf u，結(jié)果以Log10cf u比較分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 用Graph Pad Pris m 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(ANOVA)的方法進(jìn)行多組間比較，使用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行事后兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，免疫小鼠8、12、16周，PBS對(duì)照組小鼠血清中的IL-2(F＝3.183，P＜0.05)、IFN-γ(F＝12.27，P＜0.05)水平均顯著低于實(shí)驗(yàn)組。免疫小鼠8周，B/R菌株組小鼠血清中IL-2(q＝4.709，P＜0.05))、IFN-γ(q＝5.477，P＜0.05)水平均高于BCG組，與H37Ra組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫小鼠12周，B/R菌株組小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平與BCG組和H37 Ra組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫小鼠16周，B/R菌株組小鼠血清IFN-γ水平高于BCG組(q＝4.243，P＜0.05)，與H37Ra組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;B/R菌株組小鼠血清IL-2水平與BCG組和H37Ra組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫小鼠8、12、16周，隨時(shí)間延長(zhǎng)，B/R菌株組，小鼠血清IFN-γ呈下降趨勢(shì)，但血清IL-2一直維持較高水平(表1，表2)。

表1 免疫后不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠血清中IL-2(pg/mL)的表達(dá)水平Tab.1 Levels of IL-2(pg/mL)in seru m of mice at different times after immunization

表2 免疫后不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠血清中IFN-γ(pg/mL)的表達(dá)水平Tab.2 Levels of IFN-γ(pg/mL)in serum of mice at different times after immunization

2.2 免疫后，T細(xì)胞免疫記憶的時(shí)相性變化 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，免疫小鼠8、12、16周，對(duì)于CD4＋T細(xì)胞，PBS組的TCM和TEM的數(shù)量均最低，這與我們預(yù)期結(jié)果相一致。隨免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，B/R菌株組的TCM，在12周時(shí)低于BCG組(q＝5.25，P＜0.05)和 H37Ra組(q＝6.132，P＜0.05)，但其TCM在16周時(shí)維持與BCG相當(dāng)?shù)乃?TEM的數(shù)量在8，12周時(shí)與BCG組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在16周時(shí)顯著高于BCG組(q＝31.5，P＜0.05)(圖1)。免疫小鼠8、12、16周，對(duì)于CD8＋T細(xì)胞，與PBS組相比較，除12周時(shí)B/R菌株組的TCM有所降低外，B/R菌株組均產(chǎn)生了高于PBS組的TCM(F＝16.86，P＜0.05)和TEM(F＝27.93，P＜0.05)。隨免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，B/R組的TCM維持與BCG相當(dāng)?shù)乃?TEM的數(shù)量在8周時(shí)與BCG組和H37Ra組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在12周時(shí)顯著高于BCG組(q＝15.5，P＜0.05)和 H37Ra組(q＝12.97，P＜0.05)，且較早期水平更高。16周時(shí)，B/R菌株組的TEM，數(shù)量仍高于BCG組(q＝16.08，P＜0.05)和 H37Ra組(q＝20.7，P＜0.05)(圖2)。

圖1 免疫后不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠脾細(xì)胞中CD4＋記憶性T細(xì)胞亞群的變化Fig.1 Changes of CD4＋TM subsets in mouse spleen cells of each group at different times after immunization

2.3 各菌株免疫小鼠后短期保護(hù)效果的評(píng)價(jià)BCG攻擊后4周，各組肺臟大體上未觀察到明顯病理變化。肺臟HE染色結(jié)果顯示，PBS組的肺組織病理學(xué)改變最嚴(yán)重，鏡下可見(jiàn)病變累及面積較大，肺泡結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重并融合成片，上皮樣細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較多，肺內(nèi)出血，肺泡炎。與PBS組比，H37Ra組小鼠的病理變化相似，但肺泡結(jié)構(gòu)損傷不嚴(yán)重，肺內(nèi)出血有所減少，肺泡間隔增厚，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)仍然較多。值得注意的是，與H37 Ra組比，B/R菌株組的病理?yè)p傷程度明顯減輕，肺泡結(jié)構(gòu)正常，紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞滲出減少，大部分肺泡腔清晰，并與在接種了BCG的小鼠中觀察的結(jié)果相似(圖3)。CFU結(jié)果顯示，PBS組脾和肺組織中的菌落數(shù)最高。B/R菌株組中脾(q＝11.64，P＜0.05)和肺(q＝17.0，P＜0.05)的載菌量比PBS組顯著降低，與BCG組結(jié)果相似(圖4，圖5)。

圖2 免疫后不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠脾細(xì)胞中CD8＋記憶性T細(xì)胞亞群的變化Fig.2 Changes of CD8＋TM subsets in mouse spleen cells of each group at different times after immunization

圖3 各組小鼠肺組織蘇木素伊紅染色(HE染色)結(jié)果Fig.3 Results of hematoxylin and eosin staining(HE)in lung tissue,(100×)

3 討 論

機(jī)體在抗M.tuberculosis感染過(guò)程中，免疫細(xì)胞釋放的多種特異性細(xì)胞因子可啟動(dòng)殺菌機(jī)制，IL-2和IFN-γ是其中的代表因子。研究發(fā)現(xiàn)IL-2可激活體內(nèi)的CD4＋T細(xì)胞并與維持機(jī)體長(zhǎng)期的生存率相關(guān)[9]。在我們的研究結(jié)果中，小鼠免疫后的8至16周，B/R菌株組血清中的IL-2顯著高于PBS組，與BCG組相當(dāng)，并可穩(wěn)定保持較高水平，此外，這與記憶性T淋巴細(xì)胞維持較高水平的結(jié)果相一致，提示IL-2可能有助于機(jī)體記憶細(xì)胞的維持。雖然目前還不清楚IL-2水平的增加是否與疫苗更高的保護(hù)效力相關(guān)，但I(xiàn)L-2水平的升高已被證明與CD8＋記憶性T細(xì)胞的生成有關(guān)[10]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)記憶性T細(xì)胞(TM)存在異質(zhì)性，TCM可分泌較高水平的IL-2，TEM分泌IFN-γ的能力相對(duì)較強(qiáng)[11]。IFN-γ有助于單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的募集，并激活巨噬細(xì)胞的抗菌活性，防止TM的耗竭[12]。本結(jié)果中，隨時(shí)間延長(zhǎng)，各疫苗組血清中IFN-γ的水平整體有減弱跡象，但與PBS組比，疫苗組血清中IFN-γ的水平是顯著升高的，說(shuō)明各疫苗組均可刺激小鼠機(jī)體釋放免疫保護(hù)因子。其中，16周時(shí)，B/R菌株血清IFN-γ的水平高于BCG組，這與16周時(shí)B/R菌株組產(chǎn)生TEM水平高于BCG組TEM水平的結(jié)果相一致。

圖4 各組小鼠脾組織中的菌落數(shù)(CFU)Fig.4 CFUin spleen tissue of mice in each group

圖5 各組小鼠肺臟組織中的菌落數(shù)(CFU)Fig.5 Colony count(CFU)in lung tissue of mice in each group

對(duì)于慢性感染性疾病，機(jī)體的免疫記憶主要由記憶性T淋巴細(xì)胞負(fù)責(zé)，免疫記憶細(xì)胞具有干細(xì)胞樣自我更新的能力，可長(zhǎng)期存在，從而保護(hù)機(jī)體免受相同病原的入侵[13-14]。本研究中，我們用流式細(xì)胞術(shù)比較不同疫苗免疫小鼠后，在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)記憶性T細(xì)胞反應(yīng)的影響。我們的檢測(cè)結(jié)果顯示，CD4＋和CD8＋的記憶細(xì)胞分群有所不同，這與Stephen Abolins等人的研究結(jié)果一致[15]。免疫后8、12、16周，除12周時(shí)CD8＋TCM有所降低外，B/R菌株組誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4＋、CD8＋T細(xì)胞中TCM及TEM數(shù)均顯著高于PBS組。說(shuō)明給小鼠接種B/R菌株后能刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的免疫記憶。研究證明，當(dāng)抗原重復(fù)暴露時(shí)，TCM的增殖能力強(qiáng)于TEM，并可迅速分化為效應(yīng)T細(xì)胞和TEM，介導(dǎo)長(zhǎng)期的免疫保護(hù)[16]。從結(jié)果中我們注意到，12周時(shí)B/R菌株組的CD4＋、CD8＋TCM的水平較其他疫苗組有所下降，而此時(shí)的TEM卻相對(duì)其他疫苗組有所升高，我們考慮這種現(xiàn)象與B/R菌株組刺激脾臟中TCM分化成較多的TEM有關(guān)。此外，12周時(shí)B/R菌株組CD8＋TCM低于正常水平，到了16周時(shí)又恢復(fù)到較高水平，而CD8＋TEM的比例卻相對(duì)較高，可能是此時(shí)機(jī)體對(duì)CD8＋TCM的調(diào)節(jié)尚未穩(wěn)定。CD4＋Th1細(xì)胞在抗結(jié)核病中起核心作用，并可影響CD8＋記憶細(xì)胞的分化[17-18]。目前，CD8＋T記憶細(xì)胞在抗慢性感染性疾病中的作用也日益突顯，它可阻止體內(nèi)潛伏M.tubercul osis的再激活[19]，對(duì)再次入侵的病原可快速啟動(dòng)免疫應(yīng)答，通過(guò)分泌穿孔素、顆粒酶等直接殺死胞內(nèi)寄生的M.tubercul osis[20]，也可啟動(dòng)凋亡相關(guān)信號(hào)通路，介導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡[21]。一個(gè)驚喜的發(fā)現(xiàn)是，無(wú)論是CD4＋T細(xì)胞還是CD8＋T細(xì)胞，與BCG和H37Ra組比，隨免疫時(shí)間延長(zhǎng)，B/R菌株組均可維持更高水平的TEM，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尤其是以CD8＋TEM細(xì)胞表現(xiàn)更為明顯，提示B/R菌株在免疫記憶特征方面，隨免疫后時(shí)間的推移，較其親本BCG和H37Ra菌株可能更具有一定的優(yōu)勢(shì)。造成這種差異的原因:一方面與菌株來(lái)源的種類(lèi)有關(guān)，另一方面考慮與不同菌株含有的抗原豐富度有關(guān)。B/R菌株含有雙親菌株高頻率重組的基因，可能表達(dá)種類(lèi)多樣的抗原。研究表明，抗原表達(dá)的豐富度和持續(xù)時(shí)間決定了小鼠和人類(lèi)T細(xì)胞的功能[22]。另有研究發(fā)現(xiàn)，記憶性T細(xì)胞來(lái)源于效應(yīng)T細(xì)胞[23]，而抗原刺激會(huì)通過(guò)影響影響T細(xì)胞的代謝水平進(jìn)而影響效應(yīng)記憶T細(xì)胞的命運(yùn)[24-25]。因此，我們猜想B/R菌株能夠刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生更多的TEM可能與其本身是由原生質(zhì)體融合形成的融合細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有關(guān)，具體機(jī)制以及對(duì)其蛋白組學(xué)的檢測(cè)分析也將是我們進(jìn)一步探究的方向。

B/R菌株免疫小鼠后刺激機(jī)體建立的免疫記憶是否能真正起到抗M.tuberculosis感染的效果我們還不確定，因此，我們初步探究了用BCG攻擊各組小鼠后各菌株的短期保護(hù)效果。通過(guò)觀察臟器的病理改變及計(jì)算菌落數(shù)是評(píng)價(jià)疫苗保護(hù)效果的客觀指標(biāo)[26]。本實(shí)驗(yàn)中，B/R菌株組的肺組織病理?yè)p傷程度以及脾肺器菌落數(shù)較PBS組顯著降低，與BCG組比無(wú)差異，結(jié)合CD4＋、CD8＋記憶細(xì)胞及血清中IL-2和IFN-γ的檢測(cè)結(jié)果，提示B/R菌株對(duì)機(jī)體的免疫保護(hù)性可能與免疫記憶的建立有關(guān)，其短期免疫保護(hù)效果與BCG相當(dāng)。由于生物安全設(shè)備的限制，我們選擇BCG感染小鼠來(lái)研究免疫保護(hù)效果，存在一定的局限性，可能缺乏說(shuō)服力，但用來(lái)評(píng)價(jià)結(jié)核病疫苗誘導(dǎo)的免疫記憶是可行的[27]。

綜上所述，我們的研究揭示，B/R菌株繼承了親代BCG和H37Ra菌株的優(yōu)勢(shì)，即免疫小鼠后可建立較高水平的免疫記憶，以TEM為主，其免疫記憶水平可維持近數(shù)月，同時(shí)具有較好的短期免疫保護(hù)效果，為B/R菌株作為較好的候選結(jié)核病疫苗提供了理論依據(jù)。36(8):611-617.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.101