程鵬博，陸 灝，曹超越，蔣 南，張麗麗，趙月峨，鹿建春，周冬生，胡凌飛，楊文慧

鼠疫耶爾森菌是引起烈性傳染病鼠疫的病原菌，可以通過蚤類在鼠與鼠之間，鼠與人之間傳播，或通過氣溶膠在人與人之間傳播肺鼠疫[1]。自20世紀(jì)80年代以來，鼠疫進(jìn)入了一個(gè)活躍時(shí)期，自然疫源逐漸擴(kuò)大，動物間鼠疫重新活躍，人間鼠疫也經(jīng)常發(fā)生[2]。

現(xiàn)有研究表明，鼠疫耶爾森菌表面的莢膜蛋白抗原因子(fraction F1)是鼠疫耶爾森菌的免疫保護(hù)性抗原之一，是由p MT1質(zhì)粒攜帶的F1抗原操縱子編碼產(chǎn)生。F1抗原操縱子包括是caf 1 M(編碼分子伴侶)、caf 1A(錨定蛋白)和caf 1(編碼F1抗原)3個(gè)基因，此外，還有一個(gè)調(diào)控基因caf 1R[3]。F1抗原操縱子位于與編碼噬菌體T3連接酶基因高度同源的ORF2、IS100和與霍亂弧菌原噬菌體整合酶高度同源的ORF12之間[4]。表明F1抗原基因可能通過基因重組水平傳遞而來。其中caf 1是F1的結(jié)構(gòu)基因，編碼F1抗原的亞單位，其編碼的F1抗原是鼠疫耶爾森菌的毒力決定因子之一。F1抗原的主要作用是抗吞噬作用，通過掩蓋作用阻斷黏附素-受體相互作用，大大減少與吞噬細(xì)胞相互作用的細(xì)菌數(shù)，從而阻斷吞噬細(xì)胞的吞噬作用[5]。F1抗原的另一個(gè)作用是使被吞噬的鼠疫耶爾森菌存活并繁殖，產(chǎn)生致死量的細(xì)菌數(shù)，其機(jī)制可能是通過表達(dá)F1抗原產(chǎn)生的封閉作用完成的[6]。

鑒于此，本研究對鼠疫耶爾森菌的caf 1基因進(jìn)行探討，以期闡明caf 1基因的缺失對鼠疫耶爾森菌體外生物學(xué)功能的影響，并建立小鼠動物感染模型來比較caf 1基因缺失株對小鼠毒力的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)動物 鼠疫耶爾森菌201株(田鼠分離株，對人不致病菌，本室保存)，質(zhì)粒p AC-cr RNA、p KD46-Cas12a(本室保存)，SPF級6到8周齡雌性BALB/c小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號:SCXK(京)2016-0006)。

1.1.2 試劑 氨芐西林(MP，美國)、氯霉素(MP，美國)、BHI培養(yǎng)基(BD公司，美國)、LB培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)室自制)、血平板(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)、DNA Mar ker DL2，000(Ta Ka Ra BIOTECH 公司，大連)、QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen公司，德國)、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen公司，德國)、PrimeSTARTMHS DNA Polymerase(Ta Ka Ra BIOTECH公司，大連)、Taq DNA pol ymerase(Ta Ka Ra BIOTECH 公司，大連)、T4 polynucleotide kinase(NEB，美國)、10 T4 DNA ligase buffer(NEB，美國)、引物均合成自北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.1.3 儀器 手持式液體氣溶膠肺遞送裝置(北京慧榮和科技有限公司)，霉菌培養(yǎng)箱MJP-250型(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，UV-8000 A型紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)，Gene Amp PCR System 9700型PCR儀(美國ABI公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，電泳儀Power Pac 300(BIO RAD公司，美國)。

1.2 方 法

1.2.1 caf 1基因缺失株的構(gòu)建 通過前期建立的CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的基因編輯方法構(gòu)建F1抗原編碼基因caf 1的缺失株[7]。首先合成靶向的cr RNA引物caf 1 del cr RNA-F、caf 1 del cr RNA-R(表1)，退火克隆到cr RNA表達(dá)質(zhì)粒p AC-cr RNA上，同時(shí)設(shè)計(jì)并合成重組引物caf 1 del oligo(表1)。之后將λRed重組酶及核酸酶Cas12a表達(dá)質(zhì)粒p KD46-Cas12a轉(zhuǎn)入鼠疫耶爾森菌201株，誘導(dǎo)重組酶表達(dá)，制備其感受態(tài)細(xì)胞。向感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)入約300 ng靶向caf 1基因的cr RNA表達(dá)質(zhì)粒和500 ng重組oligo，加1 mL LB培養(yǎng)基復(fù)蘇2 h，40 μL/400μL梯度涂布于雙抗LB平板(氨芐西林60 μg/mL，氯霉素30μg/mL)培養(yǎng)2天。挑選單菌落到雙抗板上劃線，PCR(預(yù)變性95℃/5 min;變性94℃/40 s;退火50℃/40 s;延伸72℃/1 min;再延伸72℃/5 min)、測序篩選重組正確克隆后，在含7%蔗糖的LB平板及42℃培養(yǎng)丟掉輔助質(zhì)粒，獲得最終的caf 1基因缺失株，標(biāo)記為201Δcaf 1，保藏菌株(BHI培養(yǎng)液含30%甘油，保存于－80℃)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Tab.1 Primers of experiment

1.2.2 caf 1基因缺失株的鑒定 將獲得的基因缺失株201Δcaf 1和鼠疫耶爾森菌201株進(jìn)行10 min的熱裂解獲得其DNA模板，并以表1的JD-caf 1-F和JD-caf1-R作為鑒定引物對DNA進(jìn)行鑒定。通過瓊脂凝膠電泳技術(shù)，驗(yàn)證基因缺失株201Δcaf1構(gòu)建成功。

1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng) 鼠疫耶爾森菌201株與基因缺失株201Δcaf1均轉(zhuǎn)接三代培養(yǎng)。接種甘油菌種接種于20 mL的BHI肉湯中，26℃200 r/min培養(yǎng)36 h至平臺期(OD600≥2.5)后收取菌液，20倍稀釋并轉(zhuǎn)接于20 mL的BHI肉湯中，26℃200 r/min培養(yǎng)至OD600≈1.0時(shí)再次收菌，而后100倍稀釋轉(zhuǎn)接于20 mL的BHI肉湯中，26℃下200 r/min培養(yǎng)至對數(shù)中期(OD600≈1.0)后轉(zhuǎn)入37℃200 r/min培養(yǎng)3 h，獲得最終培養(yǎng)菌液。

1.2.4 菌落形態(tài)觀察 鼠疫耶爾森菌201株與基因缺失株201Δcaf1均通過1.2.2所述方法進(jìn)行培養(yǎng)，隨后采用分區(qū)劃線法，將菌液接種于血平板，26℃培養(yǎng)72 h，最后觀察比較2株菌在血平板上的菌落形態(tài)。

1.2.5 生長曲線測定 鼠疫耶爾森菌201株與基因缺失株201Δcaf1參照1.2.2所述方法培養(yǎng)至第二代，同等比例轉(zhuǎn)接第三代后在26℃下200 r/min持續(xù)培養(yǎng)，并在培養(yǎng)后的第0～36 h內(nèi)每2 h取1次200μL的菌液，菌液樣本使用終濃度為5%的甲醛固定，取樣結(jié)束后用紫外分光光度計(jì)測定所有菌液樣本的吸光值(600 n m)，繪制生長曲線。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次，取平均值。

1.2.6 菌株自凝聚率測定 將培養(yǎng)好的鼠疫耶爾森菌201株與基因缺失株201Δcaf1菌液以3 000 r/min離心10 min，收集菌體，用生理鹽水洗滌2次，然后懸垂于生理鹽水中，以生理鹽水為空白對照，調(diào)節(jié)菌液使之在600 n m波長下OD值約為1.0，記為OD1。取5支型號一致的試管，每支試管加入2 mL調(diào)整好濃度的同一株菌的菌懸液，分別室溫靜置0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，然后各吸取200μL上層溶液測得其OD600吸光值，重復(fù)3次，取平均值，記為OD2。通過不同時(shí)間吸光值的差異，可分別計(jì)算出2株菌的自凝聚率，計(jì)算公式如下:

菌株自凝聚率＝(OD2/OD1)×100%

1.2.7 氣溶膠肺遞送途徑感染小鼠LD50測定 使用含有0.05%泊洛沙姆的生理鹽水將菌液配制成理論感染劑量(2 000 CFU/50μL、500 CFU/50μL、200 CFU/50μL、100 CFU/50μL、50 CFU/50μL、25 CFU/50μL、10 CFU/50μL、2 CFU/50μL)。選取SPF級6到8周齡雌性BALB/c小鼠160只，隨機(jī)分成16組，每組10只小鼠。1到8組分別肺遞送不同劑量的鼠疫耶爾森菌201株菌液50μL，9到16組分別肺遞送不同劑量的基因缺失株201Δcaf1菌液50μL。每天觀察記錄2次小鼠發(fā)病及死亡情況，連續(xù)觀察2周，根據(jù)各感染劑量組小鼠死亡情況分別求出2株菌株氣溶膠肺遞送感染小鼠的半數(shù)致死劑量(LD50)。

1.2.8 不同途徑感染小鼠生存曲線觀察 選取SPF級6到8周齡雌性BALB/c小鼠80只，隨機(jī)分成8個(gè)組，每組10只小鼠。使用含有0.05%泊洛沙姆的生理鹽水將鼠疫耶爾森菌201株與基因缺失株201Δcaf1菌液配制成理論感染劑量2 000 CFU/50 μL，分別以氣溶膠肺遞送、滴鼻、腹腔注射、尾靜脈注射4種途徑感染小鼠，每天觀察記錄2次小鼠發(fā)病及死亡情況，連續(xù)觀察2周，繪制生存曲線。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 在菌株自凝聚率測定實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)比較采用multivariate檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在不同途徑感染小鼠生存曲線觀察實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用Graph Pad Pris m 8.0.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并繪制生存曲線，組間比較采用Logrank(Mantel-Cox)檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1caf1基因缺失株的鑒定 利用1.2.1設(shè)計(jì)的用于鑒定caf1基因的上下游引物JD-caf1-F/R對缺失株和野生株進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示野生株caf1基因擴(kuò)增為陽性，產(chǎn)物長度416 bp，所有缺失株caf1基因擴(kuò)增均為陰性(圖1)，表明基因缺失株201Δcaf1構(gòu)建成功。

圖1 鼠疫耶爾森菌201株與基因缺失株201Δcaf 1的caf 1基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR of Y.pestis 201 and 201Δcaf 1

2.2 菌落形態(tài)觀察 鼠疫耶爾森菌201株與基因缺失株201Δcaf 1接種血平皿培養(yǎng)72 h后，可見二者均長出淺灰色、表面光滑的細(xì)小菌落，菌落形態(tài)觀察結(jié)果無明顯差異。

2.3 菌株生長曲線分析 26℃培養(yǎng)條件下鼠疫耶爾森菌201株與基因缺失株201Δcaf 1的生長曲線基本一致(圖2)。2株株菌均經(jīng)歷適應(yīng)期、對數(shù)期、穩(wěn)定期3個(gè)階段，均經(jīng)過8 h適應(yīng)期后進(jìn)入對數(shù)生長期，培養(yǎng)14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。

圖2 鼠疫耶爾森菌201株與基因缺失株201Δcaf 1的生長曲線Fig.2 Growth curve of Y.pestis 201 and 201Δcaf 1

2.4 菌株自凝聚率比較 在靜置的液體環(huán)境中鼠疫耶爾森菌201株與基因缺失株201Δcaf 1的自凝聚率如圖3所示，2個(gè)菌株的自凝聚率呈現(xiàn)出上升趨勢。菌液自凝聚率的上升趨勢并不是一條直線，基因缺失株201Δcaf 1在0～2 h內(nèi)自凝聚率上升快于鼠疫耶爾森菌201株，在2～3 h內(nèi)自凝聚率上升較慢于鼠疫耶爾森菌201株。當(dāng)靜置3 h后，野生株與缺失株的自凝聚率基本不會發(fā)生顯著性的變化，維持在80%左右。基因缺失株201Δcaf 1的自凝聚率高于鼠疫耶爾森菌201株，F(xiàn)0.5h＝89.99，P＜0.05;F1.0h＝54.93，P＜0.05;F1.5h＝57.60，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在2 h、3 h時(shí)時(shí)間點(diǎn)上基因缺失株201Δcaf 1的自凝聚率與鼠疫耶爾森菌201株的自凝聚率無明顯差異，提示caf 1基因缺失影響鼠疫耶爾森菌早期自凝聚率。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.5 氣溶膠肺遞送途徑感染小鼠LD50比較 鼠疫耶爾森菌201株與基因缺失株201Δcaf 1通過氣溶膠肺遞送途徑感染BALB/c小鼠，根據(jù)各感染劑量組小鼠死亡情況繪制出生存曲線(圖4)，并使用Reed-Muench法求出兩株菌氣溶膠肺遞送感染BALB/c小鼠的LD50。計(jì)算結(jié)果鼠疫耶爾森菌201株的LD50為14 CFU/只，基因缺失株201Δcaf 1的LD50為82 CFU/只，缺失株LD50約是野生株的6倍。由此可見，caf 1基因的缺失引起了鼠疫耶爾森菌氣溶膠途徑感染小鼠毒力的下降。

圖3 鼠疫耶爾森菌201株與基因缺失株201Δcaf 1株不同時(shí)間的自凝聚率圖Fig.3 Coherency of Y.pestis 201 and 201Δcaf 1

2.6 不同途徑小鼠感染試驗(yàn) 鼠疫耶爾森菌201株與基因缺失株201Δcaf 1分別以氣溶膠肺遞送、滴鼻、皮下注射、尾靜脈注射途徑對BALB/c小鼠進(jìn)行2 000 CFU/50μL劑量的感染，由生存曲線圖可知BALB/c小鼠全部死亡(圖5)，但每個(gè)途徑缺失株的全部死亡時(shí)間均晚于鼠疫耶爾森菌201株。通過4種途徑下的鼠疫耶爾森菌201株與基因缺失株201Δcaf 1的生存曲線比較可知，基因缺失株死亡時(shí)間與野生株相比氣溶膠肺遞送途經(jīng)(χ2＝19.0，P＜0.05)、滴鼻途經(jīng)(χ2＝18.0，P＜0.05)，皮下注射途經(jīng)(χ2＝10.23，P＜0.05)，尾靜脈注射途經(jīng)(χ2＝15.31，P＜0.05)，提示caf 1基因缺失影響鼠疫耶爾森菌通過4種不同途徑感染小鼠的毒力。

3 討 論

CRISPR-Cas系統(tǒng)，即成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列簇(cl ustered regularly interspaced short palindro mic repeats，CRISPR)和 CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR associated protein，Cas)，廣泛存在于細(xì)菌和古生菌基因組中[8]，作為一種獲得性免疫系統(tǒng)來有效地抵抗噬菌體和外界各種基因原件造成的干擾。利用CRISPR-Cas系統(tǒng)，構(gòu)建靶向cr RNA引導(dǎo)Cas核酸酶對靶點(diǎn)進(jìn)行剪切產(chǎn)生雙鏈斷裂，則可對基因組進(jìn)行剪切[9]。本研究利用CRISPR-Cas12a系統(tǒng)結(jié)合噬菌體蛋白重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了應(yīng)用于鼠疫耶爾森菌的基因編輯體系，用于鼠疫耶爾森菌caf 1基因敲除。

成功獲得鼠疫耶爾森菌caf 1基因缺失株后，本研究探討了caf 1基因的缺失對鼠疫耶爾森菌生長曲線、菌落形態(tài)、自凝聚率等生物學(xué)特性的影響。通過比較鼠疫耶爾森菌201株與基因缺失株201Δcaf 1的生長曲線和菌落形態(tài)，發(fā)現(xiàn)2株菌沒有明顯差異，表明caf 1基因的缺失并不影響鼠疫耶爾森菌的生長曲線和菌落形態(tài)。但在2 h以內(nèi)因缺失株201Δcaf 1的自凝聚率比鼠疫耶爾森菌201株的高，在3 h后自凝聚率趨于一致，表明caf 1基因的缺失影響鼠疫耶爾森菌的自凝聚率。有研究表明微生物的聚集作用與微生物產(chǎn)生的胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances，EPS)密切相關(guān)，對微生物聚集體結(jié)構(gòu)的形成和維持起著至關(guān)重要的作用[10]。當(dāng)不同類型的EPS或EPS中的某些成分比例發(fā)生變化時(shí)，微生物之間的聚集性會出現(xiàn)變化[11]。而F1蛋白作為EPS的組成成分時(shí)，在基因缺失株201Δcaf 1不能合成F1蛋白的情況下，EPS的成分和結(jié)構(gòu)均發(fā)生了變化。從而影響了基因缺失株201Δcaf 1的自凝聚率的變化和聚集體的穩(wěn)定。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，當(dāng)caf 1基因缺失后自凝聚率在短期內(nèi)升高，在3 h后缺失株與野生株的自凝聚率基本一致，推測是由于微生物聚集體在重力作用的影響下出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象導(dǎo)致自凝聚率的升高。

圖4 鼠疫耶爾森菌201株(A)與基因缺失株201Δcaf 1(B)氣溶膠肺遞送感染小鼠生存曲線圖Fig.4 Survival curves of Y.pestis 201 and 201Δcaf 1

圖5 鼠疫耶爾森菌201株與基因缺失株201Δcaf 1株4種途徑感染小鼠生存曲線圖Fig.5 Four ways of survival curves of Y.pestis 201 and 201Δcaf 1

隨后本研究對caf 1基因的缺失是否引起鼠疫耶爾森菌毒力的變化進(jìn)行了驗(yàn)證。首先，使用氣溶膠肺遞送途徑對BALB/c小鼠進(jìn)行鼠疫耶爾森菌201株與基因缺失株201Δcaf 1的感染，結(jié)果表明缺失株LD50是野生株的約6倍，可見caf 1基因的缺失引起了鼠疫耶爾森菌毒力在氣溶膠肺遞送感染小鼠模型上的下降。其次，本研究通過肺遞送、滴鼻、皮下、尾靜脈注射4種途徑中給予小鼠絕對致死量的鼠疫耶爾森菌，結(jié)果表明基因缺失株201Δcaf 1死亡時(shí)間均晚于鼠疫耶爾森菌201株。在這4種途徑下BALB/c小鼠對于基因缺失株201Δcaf 1的敏感度降低。目前已知鼠疫耶爾森菌中由F1抗原和由低鈣反應(yīng)質(zhì)粒編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)共同完成的抗吞噬作用[12]，當(dāng)缺失Ⅲ型分泌系統(tǒng)的菌株失去F1抗原后，被吞噬的鼠疫耶爾森菌會增加6倍，當(dāng)缺失F1抗原的菌株失去Ⅲ型分泌系統(tǒng)后，被吞噬的鼠疫耶爾森菌會增加14倍，當(dāng)兩者均缺失時(shí)吞噬率會增加18倍[13]。雖然F1抗原有抗吞噬作用，但F1抗原不是必須的毒力因子，F(xiàn)1抗原基因的缺失并不能明顯降低不同動物模型的半數(shù)致死量[14]。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，BALB/c小鼠對于基因缺失株201Δcaf 1的敏感性降低，LD50升高6倍。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了基因缺失株201Δcaf 1，并對其從基因水平進(jìn)行鑒定。通過生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)基因缺失株201Δcaf 1和鼠疫耶爾森菌201株在相同的培養(yǎng)條件下菌落形態(tài)和生長速率上無明顯差異，自凝聚率有所升高。而且BALB/c小鼠對基因缺失株201Δcaf 1的敏感性降低，LD50也有所升高。本研究基于CRISPR/Cas12a方法構(gòu)建了基因缺失株201Δcaf 1，證實(shí)該基因參與細(xì)菌的自凝聚過程和致病過程。在此基礎(chǔ)上我們將進(jìn)一步通過研究caf 1基因，以便更加深入的研究詮釋F1蛋白的生物學(xué)功能。