黃瑞林，張 娜，孫 波，梁玉婷?

典型農(nóng)田根際土壤伯克霍爾德氏菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性*

黃瑞林1，張 娜2，孫 波2，梁玉婷2?

（1. 常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇常州 213164；2. 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008）

在根際環(huán)境中伯克霍爾德氏菌（Burkholderiales）是一類重要的植物促生菌，其群落結(jié)構(gòu)變化可能會影響植物的生長和發(fā)育。本研究針對伯克霍爾德氏菌目，采用特異性引物16S rRNA基因高通量測序技術(shù)，研究了田間條件下黑土、潮土和紅壤中玉米根際伯克霍爾德氏菌群落結(jié)構(gòu)及其對地上部作物生物量和產(chǎn)量的可能影響。結(jié)果表明：在三種土壤類型中，與未施肥相比，施肥對伯克霍爾德氏菌目的豐富度和多樣性均沒有顯著影響。在伯克霍爾德氏菌的科水平主要檢測到三類細(xì)菌，分別為草酸桿菌科（Oxalobacteraceae）、叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）和伯克氏菌科（Burkholderiaceae），且草酸桿菌科是其中的優(yōu)勢菌。此外，施肥顯著增加了有機(jī)質(zhì)含量較低的潮土中馬賽菌（spp.和sp.WG5）和伯克氏菌（spp.）的相對豐度（0.05）；增加了酸性紅壤中草螺旋菌（sp. ZM319）的相對豐度，但降低了spp.的相對豐度（0.05）；而在有機(jī)質(zhì)含量最高的黑土中，所有檢測到的伯克霍爾德氏菌均無明顯地變化。進(jìn)一步分析表明，土壤有效磷、速效鉀含量和土壤pH是影響這幾類細(xì)菌的主要因素，而馬賽菌群落的變化可能會影響玉米地上部生物量和產(chǎn)量。本研究表明，盡管化學(xué)施肥是影響玉米地上部生物量和產(chǎn)量的主要原因，但是伯克霍爾德氏菌等根際微生物群落也可能是影響它們的潛在生物因素。

伯克霍爾德氏菌；馬賽菌屬；根際微生物；施肥；溶磷

棲息于植物根、莖或葉的伯克霍爾德氏菌目屬于變形菌門下的β-變形菌綱，是一類革蘭氏陰性菌，其生理特征主要表現(xiàn)為嚴(yán)格需氧、兼性厭氧和專性厭氧化能異養(yǎng)型，主要類群包括：伯克氏菌科、草酸桿菌科、產(chǎn)堿菌科（Alcaligenaceae）和叢毛單胞菌科[1-2]。其中多數(shù)是具有固氮、結(jié)瘤、溶磷和產(chǎn)生植物激素等功能的植物促生菌。如越南伯克霍爾德菌（）和庫魯利伯克霍爾德菌（）具有固定空氣中游離態(tài)氮的功能[3]；瘤狀伯克霍爾德菌（）除具有固氮功能外還能夠在植物的根部結(jié)瘤[4]。Castanheira等[5]通過基因組指紋圖譜和16S rRNA高通量測序發(fā)現(xiàn)禾谷伯克霍爾德菌（）、真菌伯克霍爾德菌（）和屬于洋蔥伯克氏菌群（complex）的菌株具有溶解礦物質(zhì)磷、合成吲哚乙酸、生成鐵載體以及拮抗植物致病卵菌的能力。此外，一些洋蔥伯克霍爾德菌的菌株能夠棲息于谷物、玉米和水稻等作物的根際，通過提高作物養(yǎng)分吸收的方式增加作物產(chǎn)量[6-7]?？梢?，伯克霍爾德氏菌具有促進(jìn)植物生長和發(fā)育的潛力。

大量研究表明，溫度、海拔高度、土壤pH和土壤類型是影響細(xì)菌群落的重要因素[8-10]，因此它們也可能與伯克霍爾德氏菌的群落結(jié)構(gòu)和組成密切相關(guān)。Stopnisek等[11]對不同生態(tài)系統(tǒng)、氣候條件和土壤類型中的伯克氏菌進(jìn)行16S rRNA高通量測序和qPCR分析，表明年均溫度、海拔、地理位置（經(jīng)緯度）和土壤類型會顯著影響伯克氏菌屬的群落組成和結(jié)構(gòu)。此外，氮肥和磷肥的施加也可能會影響根際土壤中的伯克霍爾德氏菌的群落結(jié)構(gòu)、組成和功能。Tilman等[12]研究表明長期施氮肥尤其是以硫酸銨作為氮肥會引起土壤酸化。在酸性環(huán)境下（3.5～7），伯克氏菌屬（屬于伯克霍爾德菌目，伯克氏菌科）有明顯的競爭優(yōu)勢[11]，因此氮肥施加引起的土壤酸化可能會帶來該菌豐度的增加。與長期施加磷肥的土壤相比，不施加磷肥處理顯著地增加了一類重要的溶磷菌——馬賽菌屬（）（屬于伯克霍爾德菌目，草酸菌科）的豐度[13]。不僅如此，磷肥對伯克霍爾德氏菌的影響還與磷肥的種類密切相關(guān)。在玉米根際，與重過磷酸鈣（triple superphosphate）作為磷肥相比，長期以磷礦石（rock phosphate）作為磷肥能夠顯著地增加草酸桿菌科（主要是馬賽菌屬和草螺菌屬）的豐度[14]。最近，在海倫長期施磷礦石的農(nóng)業(yè)土壤中，研究者分離到了一種具有溶磷能力的馬賽菌并命名為：12-OD1T[15]。目前已發(fā)表的研究大多數(shù)是關(guān)于伯克霍爾德氏菌群落變化和物種鑒定分離，對伯克霍爾德氏菌在不同類型土壤中的比較及其與作物產(chǎn)量的潛在關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

本研究選擇了三種典型農(nóng)田土壤（黑土、潮土和紅壤）作為供試土壤，在同一海拔高度和氣候類型的田間條件下設(shè)置了施肥（氮磷鉀）和不施肥兩種處理。通過對伯克霍爾德氏菌的引物序列[16]進(jìn)行16S rRNA高通量測序，研究了玉米根際伯克霍爾德菌的群落結(jié)構(gòu)和組成的變化及其對玉米地上生物量和產(chǎn)量可能的影響。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

田間試驗(yàn)設(shè)置于中國科學(xué)院封丘農(nóng)業(yè)生態(tài)實(shí)驗(yàn)站（114°24′ E，35°00′ N），位于河南省封丘縣潘店鄉(xiāng)，海拔 67.5 m，屬半干旱、半濕潤的暖溫帶季風(fēng)氣候，年均溫為13.9℃，年降水量為605 mm，主要集中在6—9月份。年日照時(shí)數(shù)2 300～2 500 h。無霜期為220 d 左右。

1.2 研究方法

于2005年10月布置微區(qū)試驗(yàn)，選擇三種長期旱地耕作的農(nóng)田土壤（耕作歷史 20 年以上），分別為采自東北松嫩平原海倫的黃土母質(zhì)發(fā)育而成的黑土、采自黃淮海平原封丘的黃河沖積物發(fā)育的潮土和采自南方丘陵區(qū)鷹潭的第四紀(jì)紅黏土發(fā)育的紅壤，各土壤理化性質(zhì)見表1。在各地分層（20 cm每層）采集三種土壤的剖面（1.2 m 寬×1.4 m 長×1 m 深），運(yùn)至封丘站后按原來的土層順序分別填裝到長1.2 m、寬1.4 m、深1 m的試驗(yàn)小區(qū)，每種土壤設(shè)置2種處理，每種處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)（3×2×3）。小區(qū)為砌磚水泥池（微區(qū)面積 1.2 m×1.4 m=1.68 m2），小區(qū)隔墻厚 20 cm，露出地表 20 cm，底部鋪石英沙，內(nèi)壁覆蓋防水布。

2 種處理分別為：（1）不施肥處理（Unfertilized）：每年6月初種植 1 季玉米，品種為當(dāng)?shù)仄贩N鄭單958，不施用任何肥料，采用雨養(yǎng)，不灌溉，人工定期除草；（2）常規(guī)施肥處理（NPK）：每年種植1季玉米，施肥量為 N 150 kg·hm–2、P2O575 kg·hm–2、K2O 60 kg·hm–2，肥料分別為尿素、（NH4）2HPO4和 KCl，種植前施加底肥（1/2 氮肥、全部磷肥和鉀肥），玉米大喇叭口期追施尿素（1/2 氮肥），其他條件與不施肥處理相同。本研究試驗(yàn)樣品于2016 年玉米成熟期（9月18日）采集。

玉米根際土壤采用抖根法收集[17-18]，具體操作如下：首先劇烈抖動(dòng)玉米的根，去除根表面附著的大多數(shù)土壤，只保留根周圍1 mm左右的土視為根際土；其次稱取5 g含有根際土的根放入100 mL的無菌錐形瓶中，并向其中加入50 mL 0.85%的NaCl溶液（經(jīng)滅菌），使用無菌鑷子小心地將根際土洗下，直至根表面無明顯土壤（重復(fù)該過程3次）；最后將所有含有根際土的NaCl溶液小心轉(zhuǎn)移至滅菌過的50 mL離心管中，以9 000 r·min–1的速度離心10 min，倒去上清液后收集根際土（收集三次得到的所有根際土）。采集到的根際土分別以4℃和–20℃保存，以進(jìn)行理化指標(biāo)的檢測和DNA提取。需要檢測的理化指標(biāo)測定方法參照文獻(xiàn)[19]，包括土壤有機(jī)質(zhì)含量、pH和營養(yǎng)物質(zhì)含量（全氮、全磷、全鉀、有效磷、速效鉀和堿解氮）。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)（2005年）

1.3 DNA提取和高通量測序

準(zhǔn)確稱量1 g玉米根際土壤于無菌研缽中并加入0.5 g無菌石英砂，液氮研磨；使用Power Soil DNA isolation kit提取土壤總DNA。提取后使用超微量分光光度計(jì)（Nanodrop 2000，Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE，U.S.A）上機(jī)檢測各樣品DNA的質(zhì)量和濃度，濃度≥20 ng·μL–1，OD260/280= 1.8～2.0的樣品為合格樣品，合格樣品在–80℃條件下保存。

利用Illumina測序平臺，對18個(gè)根際土壤樣本的DNA做伯克霍爾德氏菌進(jìn)行高通量測序，以標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌基因組DNA Mix作為陽性對照，根據(jù)選定的檢測區(qū)域確定相對應(yīng)的擴(kuò)增引物，對各樣本的檢測區(qū)域做高保真PCR擴(kuò)增。伯克霍爾德氏菌的16S rRNA（V4-V5區(qū)）擴(kuò)增引物序列為[16]：Primer F = Illumina adapter sequence 1 + TTTTGGACAATGG GGGCAAC，Primer R = Illumina adapter sequence 2 + CTTCGTTACCAAGTCAATGAAGA。研究表明該引物所得序列有99%屬于伯克霍爾德氏菌[16]，且使用該引物在BLAST數(shù)據(jù)庫對比確定其屬于特異性引物。該細(xì)菌的16S rRNA（V4-V5區(qū)）區(qū)域擴(kuò)增的PCR條件為：預(yù)變性步驟設(shè)置95℃、2 min；變性步驟設(shè)置94℃、20 s，退火步驟設(shè)置55℃、40 s，延伸步驟設(shè)置72℃、1 min，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三個(gè)步驟35次；末延伸步驟設(shè)置72℃、2 min。利用帶有Index序列的引物，通過高保真PCR將特定的標(biāo)簽序列導(dǎo)入文庫末端。樣本添加特異性標(biāo)簽序列的PCR條件為：預(yù)變性步驟設(shè)置98℃、30 s；變性步驟設(shè)置98℃、10 s，退火步驟設(shè)置65℃、30 s，延伸步驟設(shè)置72℃、30 s，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三個(gè)步驟11次；末延伸步驟設(shè)置72℃、5 min。之后應(yīng)用核酸純化磁珠純化擴(kuò)增產(chǎn)物，得到樣本的原始文庫。利用Qubit熒光定量儀對文庫精確定量，按相應(yīng)比例（摩爾比）混合樣本。通過Agilent 2100 Bioanalyzer生物分析儀檢測混合樣本的文庫插入片段的大小，確認(rèn)在210～252 bp之間無非特異性擴(kuò)增，并準(zhǔn)確定量測序文庫濃度。采用Miseq系列測序儀2×250 bp的雙端測序策略對文庫做測序。原始下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量控制和過濾后，利用UPARSE軟件對其做OTU（Operational Taxonomic Unit）聚類分析，分類依據(jù)參照RDP（Ribosomal Database Project）數(shù)據(jù)庫的RDP Release 11.5版本。細(xì)菌測序中每個(gè)樣本獲得的序列數(shù)范圍為40 607～65 060 reads，為了盡量減少樣本中讀取計(jì)數(shù)變化的影響，本研究基于樣本序列最低數(shù)量（40 607 reads）對其做抽平處理，按照97%的相似性對所有序列做OTU劃分，各樣品文庫的覆蓋率均達(dá)到98%以上。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究計(jì)算了同一土壤類型下施肥和不施肥對根際土壤中物種相對豐度的影響，且使用熱圖（heatmap）對數(shù)據(jù)進(jìn)行了可視化，使用了皮爾森（Pearson）相關(guān)分析，以檢驗(yàn)不同理化性質(zhì)與物種相對豐度之間的相關(guān)性。同時(shí)利用典范對應(yīng)分析（CCA）以研究不同理化指標(biāo)對施肥情況下相對豐度顯著變化的伯克霍爾德氏菌群落結(jié)構(gòu)和分布的影響。利用R語言中的lm函數(shù)對物種相對豐度變化與玉米地上生物量和產(chǎn)量進(jìn)行了線性擬合。所有這些分析都是在R語言（R 3.5.1）中進(jìn)行的（https：//www.r-project.org/）。所涉及的R包分別為pheatmap、corrplot和vegan[20]。

為了評估土壤理化性質(zhì)，伯克霍爾德氏菌的相對豐度與玉米地上生物量和產(chǎn)量之間的直接和間接聯(lián)系，本研究構(gòu)建了結(jié)構(gòu)方程模型[21]（structural equation modeling，SEM）。構(gòu)建過程主要分為以下三個(gè)步驟：首先基于已經(jīng)掌握的知識和過去已發(fā)表過的文獻(xiàn)，判斷預(yù)測因子之間可能存在的相關(guān)性并預(yù)設(shè)模型；其次檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，對不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，加載數(shù)據(jù)后檢查模型的整體適應(yīng)性，本研究使用了2檢測（當(dāng)>0.05時(shí)模型適應(yīng)良好）、擬合優(yōu)度指標(biāo)（GFI，當(dāng)GFI>0.9時(shí)模型適應(yīng)良好）和近似均方根誤差[22]（RMSEA，當(dāng)RMSEA<0.05且>0.05時(shí)模型適應(yīng)良好）來判斷模型的適應(yīng)性，對于某些即使對數(shù)轉(zhuǎn)換后也難以符合正態(tài)分布的變量本研究使用了Bollen-Stine bootstrap檢測（當(dāng)bootstrap>0.05時(shí)模型適應(yīng)良好）；最后通過合理的模型擬合，本研究解釋了模型的路徑系數(shù)以及其對應(yīng)的顯著性值，并且本研究還計(jì)算了標(biāo)準(zhǔn)總體影響（standardized total effects，對兩個(gè)變量之間的直接和間接影響求和）。所有的結(jié)構(gòu)方程分析在IBM? SPSS? Amos 20.0（AMOS IBM USA）中完成。

2 結(jié) 果

2.1 不同土壤類型下施肥對土壤理化性質(zhì)、玉米地上部生物量和產(chǎn)量的影響

在本研究中，施肥會顯著增加三種土壤類型中的全磷、有效磷含量和玉米地上部生物量（0.05）；而對土壤水分含量、pH、土壤有機(jī)質(zhì)和玉米產(chǎn)量的改變會受到土壤類型的影響（表2）。例如，施肥會提高黑土的水分含量，提高黑土和潮土中的土壤有機(jī)質(zhì)，而對紅壤中的水分含量和土壤有機(jī)質(zhì)含量并無顯著的影響。此外，同種土壤與移置前相比，移置后其產(chǎn)量均有顯著的提高（<0.001）。

2.2 施肥對伯克霍爾德氏菌群落的影響

基于對伯克霍爾德氏菌的16s rRNA測序分析表明，相比黑土和潮土，紅壤中伯克霍爾德氏菌的豐富度和多樣性較低；在同種土壤類型中，與未施肥土壤相比，施肥并未顯著地影響伯克霍爾德氏菌的豐富度和多樣性（圖1a）。本研究主要檢測到三類主要的伯克霍爾德氏菌，分別為草酸桿菌科、叢毛單胞菌科和伯克氏菌科（圖1b），其中草酸桿菌均是優(yōu)勢菌。伯克氏菌科在潮土中豐度最低。進(jìn)一步分析表明，施肥對種水平伯克霍爾德氏菌相對豐度的影響可能與土壤類型有關(guān)（圖1c）。例如，在潮土中施肥顯著地增加了spp.（屬于伯克氏菌屬）、spp.（屬于馬賽菌屬）和sp. WG5（屬于馬賽菌屬）的相對豐度；在紅壤中施肥處理顯著增加了sp. ZM319的相對豐度（屬于草螺旋菌屬），顯著降低了spp.的相對豐度（0.05）；而在黑土中施肥對所有檢測到的伯克霍爾德氏菌的相對豐度均無顯著影響。

表2 同種土壤類型下施肥對土壤理化性質(zhì)、玉米地上部生物量和產(chǎn)量的影響（2016）

注：未施肥處理unfertilized treatment；施肥處理 fertilized treatment；加粗表示處理之間存在顯著差異（<0.05）。下同。Note：Unfertilized treatment，fertilized treatment；bold indicates significant different between treatments（<0.05）. The same below.

注：圖a）伯克霍爾德氏菌的豐富度和多樣性，其中小寫字母代表同種土壤施肥與不施肥之間的比較，大寫字母代表同一處理（施肥或不施肥）下不同土壤之間的比較，不同字母表示存在顯著差異；圖b）同一微生物分類等級下，不同處理土壤中微生物的相對豐度，其中數(shù)字代表測序得到的序列數(shù)，其中在屬水平下只展示了相對豐度在該屬中大于1%的物種；圖c）種水平伯克霍爾德氏菌的熱圖分析，P代表黑土Phaeozem，C代表潮土Cambisol，A代表紅壤Acrisol，U代表未施肥unfertilized，F(xiàn)代表施肥fertilized，如PU代表黑土未施肥；黃色方框代表在同一種土壤下施肥與未施肥之間的比較；“*”代表顯著性水平P<0.05，“**”代表P<0.01，“***”代表P<0.001。下同。Note：Fig. a）richness and diversity of Burkholderiales，in which lowercase letters represent a comparison between fertilized and unfertilized treatment under the same soil，capital letters represent a comparison between different soils under the same treatment，different letters indicate significant difference；Fig. b）relative abundances of microbes under different treated soils at the same classification level，in which numbers represent reads obtained by sequencing，only species with a relative abundance greater than 1% are shown at the genus level；Fig. c）heatmap analysis of Burkholderiales at the level of species，in which P，C，A，U and F represent Phaeozem，Cambisol，Acrisol，unfertilized and fertilized treatment，respectively. For example，PU represent Phaeozem-unfertilized；yellow boxes represent a comparison between fertilized and unfertilized treatment under the same soil. “*” represents significance level P<0.05，“**” represents significance level P<0.01，“***” represents significance level P<0.001. The same below.

2.3 土壤理化性質(zhì)與伯克霍爾德氏菌群落之間的關(guān)系

注：圖a）為存在顯著變化的伯克霍爾德氏菌與土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)性分析，顏色深度代表相關(guān)性強(qiáng)弱，藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)，紅色表示正相關(guān)；圖b）為典范對應(yīng)（CCA）分析。Note：Fig. a）correlation analysis between Burkholderiales with significant changes and the soil physicochemical properties，in which color depth represents the strength of the correlation，blue indicates the negative correlation，and red indicates the positive correlation；Fig. b）canonical correspondence analysis（CCA）.

2.4 生物因素、非生物因素與玉米地上部生物量和產(chǎn)量之間的關(guān)系

利用結(jié)構(gòu)方程模型，建立了土壤營養(yǎng)狀況、pH及伯克霍爾德氏菌相對豐度與玉米地上部生物量和產(chǎn)量之間潛在的直接和間接聯(lián)系。結(jié)果表明：施肥對土壤營養(yǎng)狀態(tài)的改善既能夠直接地影響玉米地上部生物量（如有效磷）和產(chǎn)量（如硝態(tài)氮和速效鉀），也能夠通過影響土壤pH和馬賽菌屬的群落結(jié)構(gòu)間接產(chǎn)生影響（圖3a）。此外，雖然施肥導(dǎo)致的土壤理化性質(zhì)的改變對sp. WG5的相對豐度變化均無顯著影響（圖2），但是屬于馬賽菌屬的同種微生物之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系（=0.85，<0.01），這意味著其同屬內(nèi)的其他物種可能通過增加sp. WG5的相對豐度從而影響玉米的產(chǎn)量。此外，標(biāo)準(zhǔn)總體效應(yīng)的結(jié)果表明了有效磷和硝態(tài)氮含量的增加是提高玉米地上部生物量和產(chǎn)量的最主要因素，馬賽菌屬相對豐度的變化也會潛在影響玉米地上部生物量和產(chǎn)量（圖3b）。

2.5 伯克霍爾德氏菌相對豐度與玉米地上部生物量和產(chǎn)量的關(guān)系

對伯克霍爾德氏菌相對豐度與玉米地上部生物量和產(chǎn)量的線性回歸分析表明，其中馬賽菌屬的sp. WG5和spp.的相對豐度與玉米產(chǎn)量存在明顯的線性相關(guān)（圖4）（0.05）。在不同土壤中施肥對這兩種菌的影響并不一致，僅在有機(jī)質(zhì)含量不高、土壤呈堿性的潮土中，施肥才會顯著影響馬賽菌的相對豐度；Mantel檢測也發(fā)現(xiàn)僅在潮土中馬賽菌相對豐度變化與玉米地上部生物量和產(chǎn)量之間有顯著相關(guān)性（表3）。

注：圖a）為結(jié)構(gòu)方程模型（SEM），χ2 = 7.051，P = 0.632，df = 9；bootstrap P = 0.806；GFI = 0.931；RMSEA = 0.000，P = 0.662，灰色帶箭頭的虛線代表沒有顯著相關(guān)，紅色帶箭頭的實(shí)線代表顯著正相關(guān)，黑色帶箭頭的實(shí)線代表顯著負(fù)相關(guān)；圖b）為結(jié)構(gòu)方程模型中各指標(biāo)對地上部生物量和產(chǎn)量的總影響。Note：Fig. a）structural equation model（SEM），χ2 = 7.051，P = 0.632，df = 9；bootstrap P = 0.806；GFI = 0.931；RMSEA = 0.000，P = 0.662，in which dotted grey arrows represent non-significant paths（P>0.05），solid red arrows represent positive paths（P<0.05），solid black arrows represent negative paths（P<0.05）. Fig. b）total effect of each index on shoot biomass and yield in structural equation model.

圖4 伯克霍爾德氏菌與地上部生物量和產(chǎn)量的線性擬合

3 討 論

基于伯克霍爾德氏菌的16S rRNA測序數(shù)據(jù)，本研究發(fā)現(xiàn)在同種土壤中施肥并沒有顯著改變根際土壤中伯克霍爾德氏菌的α多樣性（圖1a），這可能是因?yàn)樵诟H土壤中存在大量的根際分泌物[23-24]，所以根際環(huán)境中碳可能不是伯克霍爾德氏菌的限制性因素[25]。這一點(diǎn)與Stopnisek等[11]的研究結(jié)果一致，土壤中有機(jī)質(zhì)的含量不會影響伯克霍爾德氏菌的多樣性。此外，在本研究中草酸菌科是伯克霍爾德氏菌群落內(nèi)的優(yōu)勢菌（圖1b）。有證據(jù)表明該菌的多樣性主要受菌根真菌的影響[26-27]，其大多數(shù)成員與菌根真菌存在共生關(guān)系[28]，所以施肥可能對草酸菌科下群落的多樣性影響較弱。

表3 不同土壤類型下兩種馬賽菌對地上部分生物量和作物產(chǎn)量的Mantel檢測

研究表明在根際土壤草酸桿菌科下的馬賽菌屬是一種重要的功能菌[29]，該菌屬中的多數(shù)成員具有溶磷[15]、降解菲[30]及提高作物對鹽的耐受力的功能[31]。與過去的研究一致[25]，在三種土壤中，本研究均發(fā)現(xiàn)了豐富的馬賽菌（圖1b和圖1c）。然而，只有在潮土中馬賽菌（主要是sp. WG5和spp.）的相對豐度對施肥有顯著的響應(yīng)，這可能與該菌的生存策略有關(guān)。研究表明富營養(yǎng)生存策略的細(xì)菌有更快的生長速度，同時(shí)對競爭和和營養(yǎng)狀態(tài)的改變有更高的敏感性[32-33]。已有研究證明了馬賽菌屬于富營養(yǎng)型細(xì)菌[25]，并且大量存在于根際土壤中[34]。在本研究中結(jié)構(gòu)方程模型分析發(fā)現(xiàn)土壤中有效磷含量與馬賽菌（主要是spp.）的相對豐度顯著正相關(guān)（圖3a；= 0.49，<0.01），而硝態(tài)氮含量的變化能夠間接影響馬賽菌的相對豐度。因此，在有效磷含量被顯著改善而土壤pH沒有變化的潮土中馬賽菌對施肥會有一個(gè)明顯的響應(yīng)。對于黑土而言，因?yàn)槠浔旧砭哂泻芨叩挠袡C(jī)質(zhì)和有效磷含量（表2），因此在該土壤類型下碳和營養(yǎng)物質(zhì)不是馬賽菌屬生長和繁殖的限制因子。黑土含有豐富的碳和營養(yǎng)物質(zhì)，因此其可能包含更多的營富營養(yǎng)生存策略的微生物，這可能會給馬賽菌屬帶來較大的競爭壓力[25]；同時(shí)，在移置到封丘后其土壤有機(jī)質(zhì)含量的明顯降低，這將進(jìn)一步增加富營養(yǎng)微生物間對生態(tài)位和生存空間的競爭。因此，施肥雖然會增加黑土中有效磷和速效鉀的含量，但是這些營養(yǎng)物質(zhì)的改善并沒有增加馬賽菌屬的相對豐度。本研究中施肥顯著降低了紅壤的pH，從而增加馬賽菌（主要是spp.）的相對豐度（圖3a），這意味著馬賽菌更適合生活在偏酸性的土壤中。

本研究結(jié)果表明在弱堿性和有機(jī)質(zhì)含量較低的潮土中，馬賽菌屬相對豐度的增加可能是提高玉米地上部生物量和產(chǎn)量的一個(gè)潛在生物途徑（圖3和圖4）。這可能是由于以下原因：首先大量的研究證明了馬賽菌是一類具有溶磷能力的菌屬[13-15，34]，在過去的研究中無論是磷缺乏的土壤中[13]，還是在長期施加磷礦石[14]的土壤中均有發(fā)現(xiàn)豐富的馬賽菌。相關(guān)研究還表明馬賽菌的豐度與磷酸酶的活性顯著正相關(guān)[34]。因此，潮土中馬賽菌相對豐度的增加能夠?yàn)橛衩滋峁└嗟挠行Я?。在本研究中，Mantel檢測也證明了在潮土中該菌屬相對豐度的變化顯著影響玉米地上部生物量和產(chǎn)量（表3）。其次，Silva等[14]在研究發(fā)現(xiàn)馬賽菌屬有利于提高玉米對磷的吸收能力。在本研究中，施肥土壤中玉米地上生物量和產(chǎn)量的變化分別是黑土中增加了68.30%和39.41%；潮土中增加了196.26%和67.32%；紅壤中增加了155.14%和34.86%（表2），潮土中玉米地上生物量和產(chǎn)量的增加相比于黑土和紅壤來說更高。施肥是提高玉米生物量和產(chǎn)量的重要因素（圖3b），潮土中馬賽菌屬群落結(jié)構(gòu)的變化可能也是提高玉米地上生物量和產(chǎn)量的重要潛在生物因素。

4 結(jié) 論

氮磷鉀施肥顯著增加潮土中spp.、spp.和sp. WG5的相對豐度；增加紅壤中sp. ZM319的相對豐度，降低紅壤中spp.的相對豐度（< 0.05）；黑土中所有檢測到的伯克霍爾德氏菌的相對豐度均無顯著影響。基于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，本研究發(fā)現(xiàn)馬賽菌屬相對豐度的變化可能是改變玉米地上生物量和產(chǎn)量的潛在生物途徑。由于該結(jié)果是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得到的，未來需要增加實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Community Structure of Burkholderiales and Its Diversity in Typical Maize Rhizosphere Soil

HUANG Ruilin1, ZHANG Na2, SUN Bo2, LIANG Yuting2?

(1. School of Environmental and Safety Engineering, Changzhou University, Changzhou,Jiangsu 213164, China; 2. State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture,Institute of Soil Science,Chinese Academy of Sciences,Nanjing 210008, China)

【】Under the class β-proteobacteria, Burkholderiales is a kind of Gram-negative bacteria, characterized physiologically as strict aerobic, facultative anaerobic and obligate anaerobic chemoheterotrophic types, and composed mainly ofBurkholaceae, Oxalobacteriaceae, Alcaligenaceae, and Comamonadaceae in taxonomy. In rhizospheric environment, Burkholderiales is an important group of pro-growth bacteria that can promote growth and development of plants. It can not only promote plant growth by producing phytohormones, but also improve the environment in which plants grow via nitrogen fixation, nodulation and phosphorus solubilization. Studies, so far accomplished, have demonstrated that soil physicochemical properties, soil pH, soil type and fertilization can affect the community structure and composition of Burkholderiales, but failed to address variation of the effects with soil type and its potential relationship with crop yield.【】In this study, 16S rRNA high-throughput sequencing of Burkholderiales was performed with a pair of specific primersBased on the findings, responses of Burkholderiales to nitrogen, phosphorus and potassium fertilization (N, P and K) in community structure and of the maize crops in three different types of agricultural soils (phaeozem, cambisol and acrisol) in shoot biomass and yield were investigated.【】Results show that application of chemical fertilizer did not affect much richness and diversity of the Burkholderiales in the three types of soil, as compared to the unfertilized plot. Moreover, three taxa of bacteria, i.e. Oxalobacteraceae, Comammonadaceae, and Burkholderiaceae, were detected at the family level of Burkholderiales. And Oxalobacteraceae was the dominant group. In addition, fertilization markedly increased relative abundance of the(mainlyspp.) and(mainlyspp. andsp. WG5) in the cambisol low in organic matter (<0.01), while it significantly increased relative abundance of the(mainlysp.), but decreased that of the(mainlyspp.) (<0.01) in acidic acrisol. However, it did not affect much the relative abundance of all detected groups ofBurkholderiales in the phaeozem high in soil organic matter and nutrient. Pearson correlation analysis and canonical correspondence analysis (CCA) indicates that nutrient (such as AP and AK) content and soil pH are the main factors affecting the community composition and structure of these bacteria (,and). Furthermore, linear regression analysis and Mantel test shows that only the relative abundance ofis significantly correlated with the shoot biomass and yield of maize (0.05). All these statistical analyses demonstrate that changes in community structure ofmay affect shoot biomass and yield of the crop. 【】This study indicates that although chemical fertilization is the main cause of the increase in shoot biomass and yield of maize, changes in community structure of rhizosphere microbes, such as Burkholderiales, may also be potential biological factors affecting shoot biomass and yield of maize.

Burkholderiales;; Rhizosphere microbes; Fertilization; Phosphorus solubilization

X172

A

10.11766/trxb201901040008

黃瑞林，張娜，孫波，梁玉婷. 典型農(nóng)田根際土壤伯克霍爾德氏菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性[J]. 土壤學(xué)報(bào)，2020，57（4）：975–985.

HUANG Ruilin，ZHANG Na，SUN Bo，LIANG Yuting. Community Structure of Burkholderiales and Its Diversity in Typical Maize Rhizosphere Soil[J]. Acta Pedologica Sinica，2020，57（4）：975–985.

* 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41622104）資助Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.41622104）

，E-mail：ytliang@issas.ac.cn

黃瑞林（1992—），男，河南項(xiàng)城人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橥寥牢⑸?。E-mail：fhruilin@163.com

2019–01–04；

2019–04–08；

2019–05–09

（責(zé)任編輯：盧 萍）