肖 露 權(quán) 利 梁紅星 廖美霞 范曉波 陳西平 李寶香 涂 劍

(湖南省岳陽(yáng)市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，岳陽(yáng)市 414000，電子郵箱：xl2012cy@163.com)

染色體篩查是輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)的重要組成部分。胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(preimplantation genetic screening,PGS)是胚胎染色體篩查的重要技術(shù)手段，它能提高臨床妊娠率，降低早期流產(chǎn)率，并減少畸形兒的出生[1]。但PGS是一種有創(chuàng)的染色體篩查技術(shù)，可能會(huì)對(duì)胚胎后續(xù)發(fā)育造成潛在的、尚未知曉的影響。無創(chuàng)胚胎染色體篩查技術(shù)(noninvasive chromosome screening,NICS)通過檢測(cè)胚胎培養(yǎng)液及囊腔液樣本分析胚胎染色體的拷貝數(shù)，其結(jié)果與胚胎樣本染色體拷貝數(shù)高度相關(guān)，敏感性和特異性均高達(dá)80%以上[2]。但目前未見有關(guān)NICS檢測(cè)提示染色體正常的囊胚移植的臨床結(jié)局的研究報(bào)道。本研究比較NICS檢測(cè)提示為染色體正常的囊胚移植與Gardner囊胚評(píng)分[3]法評(píng)估為形態(tài)學(xué)質(zhì)量為優(yōu)的囊胚移植之間的臨床結(jié)局，探討NICS檢測(cè)對(duì)單囊胚移植臨床結(jié)局的影響，旨在為ART周期中運(yùn)用NICS檢測(cè)染色體提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2016年11月至2019年9月在我院生殖醫(yī)學(xué)中心行體外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryo transfer,IVF-ET)的372例不孕夫婦(372個(gè)移植周期)的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方年齡35～40歲；(2)ART周期中獲卵≥15個(gè)或者人絨毛促性腺激素注射當(dāng)日血清雌二醇水平≥5 000 pg/mL；(3)18 kg/m2≤女方體質(zhì)指數(shù)≤28 kg/m2；(4)同意選擇單囊胚凍胚復(fù)蘇移植；(5)根據(jù)Gardner囊胚評(píng)分法評(píng)估形態(tài)學(xué)質(zhì)量，符合移植條件的囊胚數(shù)≥2個(gè)；(6)無內(nèi)科并發(fā)癥；(7)符合國(guó)家計(jì)劃生育政策。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)夫妻任一方有ART治療禁忌證；(2)女方既往自發(fā)性流產(chǎn)>3次；(3)女方單側(cè)卵巢切除；(4)有如下明確原因的不孕患者，如單側(cè)或雙側(cè)輸卵管積液、瘢痕子宮、子宮畸形、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜息肉、宮腔粘連或其他影響子宮內(nèi)膜環(huán)境的病變；(5)女方患有不宜生育的嚴(yán)重遺傳性疾病、嚴(yán)重軀體疾病、精神心理障礙等。在移植前所有囊胚形態(tài)學(xué)質(zhì)量經(jīng)Gardner囊胚評(píng)分[3]評(píng)估都符合移植要求。將其中愿意接受NICS檢測(cè)并且檢測(cè)結(jié)果顯示囊胚染色體拷貝數(shù)正常的75例，設(shè)為染色體拷貝數(shù)正常囊胚移植組(A組)；愿意接受NICS檢測(cè)并且檢測(cè)結(jié)果顯示囊胚染色體拷貝數(shù)異常的73個(gè)優(yōu)質(zhì)囊胚將不用于臨床移植，不納入任何一組；其余224例設(shè)為形態(tài)學(xué)優(yōu)質(zhì)囊胚移植組(B組)。兩組的女方年齡、不孕年限、體質(zhì)指數(shù)和移植日子宮內(nèi)膜厚度比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。本研究已通過岳陽(yáng)市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

表1 兩組間基本資料的比較(x±s)

1.2 IVF-ET及NICS檢測(cè) 所有女方均接受本中心常規(guī)采用的促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑降調(diào)節(jié)進(jìn)行超排卵：采用早卵泡期長(zhǎng)效長(zhǎng)促排卵方案，月經(jīng)第1～4天行陰道B超和血促卵泡激素、黃體生成素、雌二醇、孕酮檢查，予以注射長(zhǎng)效達(dá)菲林(生產(chǎn)廠家：Ipsen Pharma Biotech；規(guī)格：3.75 mg/支)3.75 mg，28～30 d后復(fù)查陰道B超和血促卵泡激素、促黃體生成素、雌二醇、孕酮值。若達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)(降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)：卵泡直徑≤5～8 mm、子宮內(nèi)膜≤5 mm、雌二醇<50 pg/mL、促卵泡激素及促黃體生成素<5 mIU/mL、孕酮<0.9 ng/mL)，予以注射Gn(果納芬，生產(chǎn)廠家：MerckSeronoS.p.A；規(guī)格：300 IU/0.5 mL)啟動(dòng)。至扳機(jī)時(shí)機(jī)(扳機(jī)時(shí)機(jī)：主導(dǎo)卵泡群直徑≥17 mm與≥14 mm卵泡數(shù)的比值達(dá)60%～70%)，予注射艾澤(規(guī)格：250 μg:0.5 mL)扳機(jī)。扳機(jī)后36 h采卵，行體外受精。兩組均行體外受精，將受精卵置于培養(yǎng)箱內(nèi)采用G-1TM培養(yǎng)液(瑞典Vitrolife公司,型號(hào)：10128)行單微滴單胚胎培養(yǎng)72 h后，換G-2TM(瑞典Vitrolife公司,型號(hào)：10132)囊胚培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)液為Vitrolife公司G5系列培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱為美國(guó)COOK公司K-MINC-1000型培養(yǎng)箱。

培養(yǎng)至120 h(D5)～144 h(D6)，行形態(tài)學(xué)評(píng)估后，對(duì)接受NICS檢測(cè)的患者囊胚進(jìn)行激光皺縮，5～10 min后取30 μL囊胚培養(yǎng)液，送億康基因有限公司進(jìn)行NICS檢測(cè)(多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增+高通量測(cè)序)，篩選染色體正常胚胎進(jìn)行移植；不接受NICS檢測(cè)的形態(tài)學(xué)優(yōu)質(zhì)囊胚直接進(jìn)行移植[3-4]。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察兩組患者的臨床結(jié)局，包括臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、持續(xù)妊娠率、異位妊娠率、活產(chǎn)率、新生兒畸形率。判斷標(biāo)準(zhǔn)：移植后4周行B超檢查，宮腔內(nèi)見妊娠囊確定為臨床妊娠；發(fā)生在孕12周以前的流產(chǎn)定義為早期流產(chǎn)；持續(xù)妊娠是指懷孕持續(xù)到20周或以后；發(fā)生在子宮底或子宮體之外的妊娠定義為異位妊娠，異位妊娠亦記為臨床妊娠；胎兒分娩后，存在呼吸或其他生命征象(如心臟跳動(dòng)等)均被定義為活產(chǎn)嬰兒；胎兒出生前已經(jīng)存在的結(jié)構(gòu)或功能異常為新生兒畸形。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植總周期數(shù)×100%；早期流產(chǎn)率=早期流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；持續(xù)妊娠率=持續(xù)妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=有活產(chǎn)周期數(shù)/移植總周期數(shù)×100%；新生兒畸形率=畸形嬰兒數(shù)/活產(chǎn)嬰兒數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0和GraphPad Prism 7進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用兩樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NICS檢測(cè)情況 對(duì)148枚Gardner囊胚評(píng)分法形態(tài)學(xué)質(zhì)量為優(yōu)的囊胚(見圖1)進(jìn)行NICS檢測(cè)，結(jié)果提示75枚Gardner囊胚評(píng)分法形態(tài)學(xué)質(zhì)量為優(yōu)的囊胚的染色體拷貝數(shù)正常，其余73枚Gardner囊胚評(píng)分法形態(tài)學(xué)質(zhì)量為優(yōu)的囊胚的染色體拷貝數(shù)異常(見圖2)，包括39枚為非整倍體，22枚為嵌合體，12枚為染色體檢測(cè)結(jié)果不明確。將NICS檢測(cè)染色體拷貝數(shù)正常的Gardner囊胚評(píng)分法形態(tài)學(xué)質(zhì)量為優(yōu)的囊胚進(jìn)行移植，而染色體拷貝數(shù)異常的Gardner囊胚評(píng)分法形態(tài)學(xué)質(zhì)量為優(yōu)的囊胚終止ART周期。

圖1 D5～D6 Gardner囊胚評(píng)分法形態(tài)學(xué)質(zhì)量為優(yōu)的囊胚

圖2 NICS檢測(cè)形態(tài)學(xué)優(yōu)質(zhì)囊胚的染色體拷貝數(shù)結(jié)果

2.2 兩組臨床結(jié)局比較 A組的新生兒畸形率低于B組，活產(chǎn)率高于B組(均P<0.05)；但兩組之間的臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、持續(xù)妊娠率和異位妊娠率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 兩組臨床結(jié)局比較

3 討 論

隨著二孩政策的全面放開，許多高齡女性渴望再生育，但隨著年齡的增長(zhǎng)，女性生殖能力逐漸下降，尤其35歲以后下降更為明顯。這促使有生育要求的高齡孕婦選擇通過ART來實(shí)現(xiàn)生育。研究表明，ART受孕與自然受孕的新生兒出生缺陷發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[5-8]。但通過ART方式獲得的胚胎，仍有40%～60%存在染色體異常，且隨孕婦年齡增大，染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)呈上升趨勢(shì)[9]。而胚胎染色體異常時(shí)導(dǎo)致ART失敗的主要原因[10]。ART周期中PGS是胚胎染色體篩查的重要技術(shù)手段，采用PGS進(jìn)行胚胎染色體篩查，可降低試管嬰兒流產(chǎn)率，提高臨床妊娠率[11-12]。但PGS的標(biāo)本采集方式對(duì)胚胎存在一定的創(chuàng)傷。研究表明，有創(chuàng)性的活檢有可能會(huì)引起胚胎發(fā)育節(jié)點(diǎn)時(shí)間延長(zhǎng)，并造成表觀遺傳修飾異常[13-14]和胎盤異常[15-16]等不利影響。

本研究中，A組的新生兒畸形率低于B組，而活產(chǎn)率高于B組(P<0.05)；但兩組之間的臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率、早期流產(chǎn)率、異位妊娠率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究對(duì)Gardner囊胚評(píng)分法形態(tài)學(xué)質(zhì)量為優(yōu)的囊胚進(jìn)行NICS檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這些囊胚部分亦存在染色體拷貝數(shù)異常，這種異?？赡軐?dǎo)致某些基因(如MPP1)的缺失、減少或增多[17]，從而導(dǎo)致活產(chǎn)率降低和新生兒畸形率升高[18]。

綜上所述，與單純傳統(tǒng)胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分比較，聯(lián)合NICS能夠提高單囊胚凍胚復(fù)蘇移植的活產(chǎn)率，降低新生兒畸形率。這為臨床ART周期中染色體篩查提供新的思路，而合理應(yīng)用NICS能更好地實(shí)現(xiàn)ART技術(shù)中優(yōu)生優(yōu)育的目的。但由于本研究為單中心回顧性研究，同時(shí)周期數(shù)量有限，所得結(jié)果可能存在一定的偏差，今后還需進(jìn)一步進(jìn)行多中心、多周期的前瞻性或回顧性研究以驗(yàn)證。