林 潔 黃炳臣 王 娟 黃云美 黃小英

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床病理診斷與研究中心， 廣西百色市 533000，電子郵箱：310564854@qq.com)

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其病死率在所有腫瘤中排名前三[1-2]。有研究顯示，肝癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素是慢性HBV感染以及慢性HCV感染[3-5]，其他常見危險(xiǎn)因素還有酗酒、糖尿病、非酒精性脂肪肝等[6]。微小RNA(microRNA,miR)是一種高度保守的單鏈非編碼小RNA，成熟的miR通過與多種蛋白質(zhì)的結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體[7]。miR的調(diào)控具有網(wǎng)絡(luò)化的特性，某一miR可以靶向調(diào)節(jié)多種基因，某種基因也可能受到多種miR的調(diào)控，而目前研究發(fā)現(xiàn)人類60%的基因可能都受到miR的調(diào)控[8-9]。隨著對(duì)miR研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)顯示miR在細(xì)胞的增殖、分化等重要生理過程中扮演著重要的角色[10]。為此，本研究分析肝癌患者組織及血清中miR-24、miR-629 的表達(dá)情況及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 將我院2017年2月至2018年2月收治的67例肝癌患者作為肝癌組，其中男性54例、女性13例，年齡(55.2±11.7)歲；存在血管侵犯29例；腫瘤分化程度：高分化25例，中分化23例，低分化19例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)自愿參與本研究；(2)病理診斷證實(shí)為肝細(xì)胞性肝癌；(3)入院前未進(jìn)行任何形式的抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入院時(shí)存在肝功能障礙的患者；(2)有其他種類的惡性腫瘤或血液病患者；(3)患者已知情此次研究，并已簽署同意書。另選取同期在我院治療的31例慢性乙型病毒性肝炎或者乙肝相關(guān)性肝硬化患者為乙肝組，其中男性25例、女性6例，年齡(55.0±10.9)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[11]中關(guān)于乙肝及肝硬化的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡≥30歲；(3)患者已知情此次研究，并已簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有惡性腫瘤者；(2)有嚴(yán)重的感染性或免疫性疾病者；(3)病歷資料缺失者。選擇同期來我院進(jìn)行體檢的46例健康人員為正常對(duì)照組，其中男性37例、女性9例，年齡(55.3±11.2)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥30歲者；(2)受試者知情此次研究，且已簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有溝通交流障礙者；(2)已參與其他研究者。3組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 收集資料 收集所有研究對(duì)象的一般資料，包括年齡、性別等；收集肝癌患者血管侵犯情況以及腫瘤分化程度。

1.3 miR-24和miR-629表達(dá)水平的檢測方法

1.3.1 標(biāo)本的采集及處理：(1)肝癌組和乙肝組患者在入院次日，對(duì)照組在入組當(dāng)日，采集研究對(duì)象清晨空腹靜脈血5 mL置于無添加劑的真空試管中，并放在室溫下靜置30 min，使血液充分凝結(jié)。將凝結(jié)后的血液放置于低速離心機(jī)中，4℃ 2 000 r/min離心10 min后使用移液器將上清移至1.5 mL的無酶EP管中，再次4℃ 16 000 r/min離心10 min。吸取上清，用300 μL的EP管分裝，儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用。(2)取肝癌患者癌組織及癌旁正常組織(距離癌組織邊緣2 cm)，用于檢測miR-629及miR-24相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.2 特異性引物的設(shè)計(jì)及合成：根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org)公布的miR序列，設(shè)計(jì)特異性引物。其中，miR-24上游引物為5′-ACTAATRCCTCCCTCCTT-3′，下游為5′-ATAAACTTCTRGGTGTCC-3′；miR-629上游引物為5′-CGTGGGTTTACGTTGGG-3′，下游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′。內(nèi)參U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，miR-629及U6下游引物作為通用引物，引物退火溫度保持在55℃～60℃。引物由北京天根生化科技有限公司合成。

1.3.3 檢測步驟：CFX96型PCR儀購自美國Bio-Rad公司，總RNA快速提取試劑盒(批號(hào)：rp3201)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：rp3514)以及定量PCR試劑盒(批號(hào)：rp2027)等均購自北京的百泰克生物技術(shù)公司。按照總RNA快速提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟，提取血清及組織標(biāo)本的總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將合成的cDNA反應(yīng)液置于-20℃保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系共25 μL，包括PCR反應(yīng)液12.5 μL、cDNA模板3 μL，上下游引物各0.25 μL，超純水9 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃下30 s預(yù)變性，共1個(gè)循環(huán)；94℃下10 s變性，共39個(gè)循環(huán)；60℃下30 s退火，共39個(gè)循環(huán)。操作時(shí)均嚴(yán)格根據(jù)說明書的步驟進(jìn)行檢測。通過2-ΔΔCt法計(jì)算miR的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25，P75)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較使用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌患者癌組織及癌旁正常組織miR-629及miR-24的相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比 癌組織中的miR-629、miR-24的相對(duì)表達(dá)水平分別為2.080(0.232,7.215)、1.947(0.319,10.272)，分別高于癌旁正常肝組織的1.573(0.186,4.502)、1.341(0.275,7.933)(u=4.536、3.821，P=0.001、0.003)。

2.2 3組研究對(duì)象血清miR-24和miR-629的相對(duì)表達(dá)水平比較 正常對(duì)照組、乙肝組、肝癌組的血清miR-24、miR-629相對(duì)表達(dá)水平依次升高(均P<0.05)，見表1。

表1 3組研究對(duì)象血清miR-24、miR-629相對(duì)表達(dá)水平比較[ M(P25，P75)]

2.3 肝癌患者血清miR-629、miR-24的相對(duì)表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性 血清miR-629、miR-24的相對(duì)表達(dá)水平與血管侵犯情況以及腫瘤分化程度呈正相關(guān)(均P<0.05)，見表2。

表2 肝癌患者血清miR-629、miR-24的相對(duì)表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性

3 討 論

MiR-24是近年被發(fā)現(xiàn)的參與基因表達(dá)調(diào)控且廣泛存在于人類組織細(xì)胞的微小RNA分子，共有兩個(gè)亞簇，即miR-24-1和miR-24-2，其編碼基因分別定位于人類9q22和19p13,兩個(gè)亞簇具有相似的生物學(xué)活性[12-13]。而miR-629定位于15q23。研究表明，miR-24和miR-629可與相應(yīng)靶基因mRNA 3′非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，從而在細(xì)胞的生長與分化過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，它們的表達(dá)失調(diào)與各類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，癌組織中的miR-629及miR-24的相對(duì)表達(dá)水平均高于正常肝組織，肝癌患者血清中miR-629及miR-24的相對(duì)表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組(均P<0.05)，即miR-629及miR-24在肝癌組織及外周血中均表達(dá)上調(diào)，表明兩者在肝癌的形成過程中發(fā)揮了一定的作用。進(jìn)一步行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-629、miR-24的相對(duì)表達(dá)水平均與血管侵犯情況以及腫瘤分化程度呈正相關(guān)(均P<0.05)，因此血清miR-629及miR-24水平的檢測可能有助于評(píng)估肝癌患者的病情[15-16]。

目前認(rèn)為慢性肝炎→肝硬化→非典型增生→肝癌是肝組織腫瘤化過程中的重要病理變化，但由慢性肝炎到肝癌惡性轉(zhuǎn)化過程(即腫瘤化)中關(guān)鍵的分子事件并未完全清楚[17]。前期研究表明，DNA 損傷修復(fù)功能缺陷在慢性肝炎的惡性轉(zhuǎn)化過程中可能起重要作用，而 miR-24/miR-629 在消化系統(tǒng)癌組織中出現(xiàn)異常表達(dá)[18-19]。MiR-629、miR-24這兩種miR的高表達(dá)受核因子激活的B細(xì)胞的κ-輕鏈調(diào)控，且這種異常在具有慢性肝炎背景的組織中更為明顯，這提示 DNA 損傷及 miR-24/miR-629 間可能存在一種網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并可能在慢性肝炎的惡性轉(zhuǎn)化過程中起重要作用[20]。因此，深入研究 DNA 損傷/miR-24/miR-629 在慢性肝炎的惡性轉(zhuǎn)化過程中的作用具有重要科學(xué)價(jià)值，其有助于闡明慢性肝炎由可控到不可控、再到惡性轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵分子事件，并對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)肝癌的發(fā)生機(jī)制、加強(qiáng)肝癌的防治具有重要意義[21]。本研究結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、乙肝組、肝癌組的血清miR-24、miR-629的相對(duì)表達(dá)水平依次升高(均P<0.05)，表明隨著肝臟病變嚴(yán)重程度的增加，血清中的miR-629及miR-24的水平也逐漸升高，這提示miR-24、miR-629在慢性肝炎的惡性轉(zhuǎn)化過程中起重要作用。

綜上所述，肝癌患者癌組織及血清中的miR-629、miR-24的表達(dá)水平均上調(diào)，其可能在肝癌的發(fā)生以及慢性肝炎的惡性轉(zhuǎn)化過程中起到重要作用，而血清miR-24和miR-629的檢測或有助于評(píng)估肝癌患者的病情。