金文松，劉文君，夏俊慧，李長樂，李贛新，都新榮，李佳歡，3，胡開輝，3*，張重義

1.福建農(nóng)林大學 生命科學學院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學 農(nóng)學院，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學 菌業(yè)研究院，福建 古田 352200

目前茯苓菌核資源主要仍以人工椴木栽培獲得，這種傳統(tǒng)獲取茯苓藥用資源方式存在三方面問題：第一，以消耗大量林業(yè)資源為代價，使得菌林矛盾日益尖銳化；第二，生產(chǎn)模式易受生產(chǎn)環(huán)境的影響；第三，勞動密集型生產(chǎn)方式。前人研究結(jié)果表明茯苓菌核主要藥效成分為茯苓三萜與茯苓多糖。應(yīng)用茯苓菌絲液體發(fā)酵策略獲取茯苓藥用成分成為當前的一個研究熱點。本課題組前期研究結(jié)果表明，16種菌株生長速度、生物量、胞內(nèi)藥效成分均具有一定的差異性，它們應(yīng)屬于不同的茯苓菌株[1]?；诋斍鞍l(fā)酵條件，基于當前發(fā)酵條件，遺傳育種是獲取菌絲生物量高、胞內(nèi)藥效成分含量高的優(yōu)質(zhì)發(fā)酵出發(fā)菌株的一條途徑，盡管當前茯苓性模式與生活史還存在較大的爭議[2-4]。

明確各菌株之間的親緣關(guān)系遠近是遺傳育種成功的基本條件之一。DNA分子標記因其穩(wěn)定性好、實驗成本低、操作容易等優(yōu)點，被廣泛用于種質(zhì)資源研究、遺傳圖譜構(gòu)建、基因標記、遺傳多樣性分析、系統(tǒng)發(fā)育分析、輔助育種等研究工作[5]。在茯苓菌株親緣關(guān)系鑒定方面，Interanl Trasncribed Spacer(ITS)序列分析、28S rRNA序列分析[6-8]、Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD)標記[9-10]、Sequence-related Amplified Polymorphism(SRAP)標記[11]、Simple Sequence Repeats(SSR)標記[12]均有被用于茯苓菌株間遺傳關(guān)系分析的報道。簡單重復(fù)序列間擴增(ISSR)標記是基于SSR標記發(fā)展來的分子標記技術(shù)[13]，已被更廣泛應(yīng)用于茯苓菌株種質(zhì)資源分析領(lǐng)域[14-16]，鑒定其他中藥親緣關(guān)系[17-20]。鑒于2009年中國已將ISSR標記作為食用菌菌種鑒定行業(yè)標準[21]，筆者應(yīng)用ISSR標記分析20種茯苓菌株的遺傳關(guān)系，并應(yīng)用體細胞不親和性實驗對ISSR標記分析結(jié)果予以驗證，以期明確20種茯苓菌株之間的遺傳親緣關(guān)系。研究結(jié)果為將來應(yīng)用遺傳育種方法獲取茯苓優(yōu)質(zhì)液體發(fā)酵菌株提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

1.1.1茯苓菌株收集 本項目共收集到20種茯苓菌株，菌株編號、俗名及來源相關(guān)信息見表1。

1.1.2試劑 2 x HieffTMPCR Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司)，CTAB(MYM biological technology company)，RNAase(北京寶生物科技有限公司)，有機試劑、無機鹽等(國藥控股集團有限公司)。

表1 茯苓菌株收集信息

1.1.3ISSR引物 本研究所用ISSR引物序列根據(jù)來源分為兩大類，第一類引物由加拿大哥倫比亞大學設(shè)計的UBC primer set #9 (Microsatellite)，共100條引物；第二類引物參考行業(yè)標準NY/T 1730-2009[21]，共128條引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。經(jīng)優(yōu)化的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)體系篩選之后，共20條引物用于本研究ISSR標記分析，具體引物信息、退火溫度、擴增條帶數(shù)與多態(tài)性條帶數(shù)見表2。

表2 ISSR引物退火溫度與茯苓菌株的條帶多態(tài)性

1.2 儀器

ETC811梯度PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)，JS-2012凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)，JS-HE128水平電泳儀(上海培清科技有限公司)，JS-power 600電泳儀電源(上海培清科技有限公司)，3K15高速冷凍離心機(德國Sigma公司)，SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司)，Nonodrop 2000(美國Thermo Fisher公司)。

2 方法

2.1 茯苓菌絲體培養(yǎng)與基因組DNA提取

菌絲體培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)與收集參照參考文獻[1]。采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取茯苓基因組DNA，操作步驟如下：應(yīng)用液氮將菌絲研磨成粉，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，加入500 μL 65 ℃預(yù)熱的2% CATB(100 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0，20 mmol·L-1乙二胺四乙酸(EDTA)，1.4 mol·L-1NaCl，2% CTAB，2%聚乙烯吡咯燒酮)水浴60 min，加入等體積三氯甲烷/異戊醇(24∶1)抽提，10 000 r·min-1離心10 min(離心半徑為8.5 cm)，轉(zhuǎn)移上清至新管，并加入RNAase A(40 μg·mL-1)于37 ℃消化2 h，加入0.7倍體積預(yù)冷異丙醇于-20 ℃沉淀DNA，離心收集DNA，并用70%乙醇洗滌2次，最后溶于去離子水。應(yīng)用Nanodrop測定DNA濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 ISSR分析

PCR反應(yīng)體系：2 x HieffTMPCR Master Mix 10 μL，引物 10 μmmol·L-1，DNA 100 ng，去離子水補齊至20 μL。PCR擴增程序：95 ℃，300 s，1個循環(huán)；95 ℃，30 s，退火溫度(見表2)，30 s，72 ℃，120 s，35個循環(huán)；72 ℃，600 s，1個循環(huán)；4 ℃，程序結(jié)束。電泳：瓊脂糖凝膠(1.5%)，1% DNA Green，膠長20 cm，恒壓120 V。染料電泳到膠末端，拍照記錄。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與聚類作圖

ISSR-PCR獲得的DNA圖譜帶型用0、1統(tǒng)計，并據(jù)此建立DNA條帶位置數(shù)據(jù)庫。相同的遷移位置存在條帶的標記為1，不存在條帶的記為0。遺傳相似系數(shù)按公式(1)計算：

Gs=2Nij/(Ni+Nj)

(1)

其中Nij表示基因型間共有帶數(shù)目，Ni和Nj表示量基因型各自的條帶數(shù)目。

遺傳距離按公式(2)計算;

Gd=1-Gs

(2)

聚類分析方法為UPGMA，并使用NTSYSpc-2.10e軟件進行聚類并繪制聚類樹狀圖。

2.4 體細胞不親和性分析

根據(jù)ISSR標記結(jié)果，選擇不同遺傳相似系數(shù)的9種菌株進行體細胞不親和性實驗。將待檢驗菌株的菌絲接種在固體馬鈴薯萄葡糖瓊脂(PDA)加富平板上，每個平板接種2種不同菌株。將接種好的平板放在26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌株間是否會出現(xiàn)拮抗線，拍照并做記錄。

3 結(jié)果

3.1 20個茯苓菌株基因組DNA提取與檢測

應(yīng)用CTAB法分別提取20種茯苓菌株的基因組DNA(見表1)，測定其濃度并對其質(zhì)量進行檢測。Nanodrop測定結(jié)果表明，20種菌株基因組DNA的質(zhì)量濃度為100～500 ng·μL-1，A260～280 nm均在1.80左右，表明所提取的基因組DNA純度較好。應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳法對所提取的20種菌株基因組DNA進行檢測，電泳結(jié)果見圖1，各菌株主帶明顯，無彌散條帶，條帶大小較為一致，表明提取的DNA比較完整，DNA沒有降解和斷裂，可用于后續(xù)ISSR-PCR分析。

圖1 20種茯苓菌株基因組DNA電泳圖

3.2 ISSR標記引物篩選

本研究根據(jù)加拿大哥倫比亞大學設(shè)計的英屬哥倫比亞大學(UBC)引物序列與食用菌菌種真實性鑒定-ISSR法所提供的引物序列，共合成了128條ISSR引物。首先對PCR反應(yīng)體系、擴增程序及電泳條件作了初步的優(yōu)化，優(yōu)化標準為PCR條帶明亮清晰，PCR條帶在瓊脂糖凝膠上具有較好的分離度，優(yōu)化結(jié)果見2.2。隨機選擇Y1菌株基因組DNA作為篩選ISSR-PCR引物的模板，發(fā)現(xiàn)其中62條引物可擴增出條帶，68條引物幾乎無擴增條帶(數(shù)據(jù)未顯示)，從62條可擴增出條帶引物中篩選出具有較好擴增圖譜的20條引物作為本實驗構(gòu)建ISSR指紋圖譜的引物(見表2)。采用梯度PCR條件，以Y1基因組DNA作為模板，分別分析20條引物的較適退火溫度，退火溫度為35.0～50.6 ℃(見表2)。

3.3 20種茯苓菌株的ISSR指紋圖譜分析

為了明確20種茯苓菌株之間的親緣關(guān)系，本研究應(yīng)用已篩選出的20條ISSR-PCR引物對提取的20種茯苓菌株基因組DNA分別進行PCR擴增。分別對ISSR-PCR電泳結(jié)果進行瓊脂糖凝膠電泳分析，并拍照與記錄。電泳結(jié)果顯示，大部分引物都可以在樣品基因組DNA上成功擴增出條帶，但部分引物不能從L菌株DNA上擴增出條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。對所有的電泳圖片進行DNA條帶進行統(tǒng)計，并分析DNA帶型。統(tǒng)計結(jié)果顯示，20條引物在20種菌株基因組DNA上共擴增出241條條帶，其中特異性條帶89條(見表2)，代表性ISSR-PCR圖譜見圖2。

注：A.引物P19;B.引物UBC830;C.引物P22;D.引物UBC850。圖2 20種茯苓菌株的ISSR圖譜

3.4 20種茯苓菌株的聚類分析

對241個標記條帶進行統(tǒng)計，生成20種茯苓菌株的遺傳數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建它們的遺傳相似系數(shù)矩陣。采用NTSYS軟件進行聚類分析，繪制菌株的ISSR聚類樹狀圖(見圖3)。聚類分析結(jié)果表明，在36%相似系數(shù)時，20個菌株可分為兩大類，L獨處一類；在94%相似系數(shù)時，除了無法區(qū)分AS 5.137與GIM 5.219之外，其余菌株均被明顯區(qū)別開。

3.5 體細胞不親和性分析

體細胞不親和性指2種菌株之間的親緣關(guān)系較遠時，在它們菌絲交接處會產(chǎn)生特異性的拮抗反應(yīng)，彼此防止自身遺傳物質(zhì)被外來DNA改變，從而產(chǎn)生肉眼可分辨的拮抗線。從本質(zhì)上講，因菌株產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，如分泌酶系、次級代謝產(chǎn)物等非遺傳物質(zhì)，介導(dǎo)菌株之間的不親和性，體細胞不親和性標記實質(zhì)為一種細胞標記，是一種傳統(tǒng)用于初步鑒定真菌親和性關(guān)系的標記。本研究中，為明確L與其他菌株之間的遺傳關(guān)系，選取與L遺傳相似系數(shù)26%～59%的4種菌株分別進行體細胞不親性分析，實驗結(jié)果表明，L均與測試菌株之間產(chǎn)生較弱拮抗線。選取遺傳相似系數(shù)29%～94%的6種菌株進行體細胞不親和性分析，體細胞不親和性實驗結(jié)果顯示，除GIM 5.219與L之間未產(chǎn)生拮抗線之外，其余兩兩對峙培養(yǎng)的菌株之間均產(chǎn)生較弱，肉眼可分辨的拮抗線(見圖4)。

圖3 20種茯苓菌株的親緣關(guān)系

注：A.L與4種茯苓菌株之間體細胞不親和性分析結(jié)果；B.6種茯苓菌株之間體細胞不親和性分析結(jié)果。圖4 9種茯苓菌株間體細胞不親和性分析結(jié)果

4 討論

ISSR分析結(jié)果的可靠性取決于供試引物數(shù)量，供試引物越多，ISSR分析結(jié)果的可靠性與可信度越高。本研究共合成了128條ISSR引物，從中篩選出20條引物用于ISSR-PCR分析，盡可能地保證ISSR分析結(jié)果的可靠性。其次，筆者嘗試用不同長度的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行分離，發(fā)現(xiàn)凝膠長度對PCR條帶的分離度具有較大影響，膠越長，PCR條帶間的分離度越高，在本研究中，筆者使用20 cm長度的瓊脂膠，使PCR擴增條帶的可讀性得到一定程度的提高。

本研究ISSR-PCR擴增條帶的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，大部分菌株之間的擴增條帶較為一致，多態(tài)性條帶比例為20%～55%。除了菌株L與其余菌株的遺傳相似系數(shù)較小之外，其余19種菌株的遺傳相似系數(shù)均在68%以上，反映20種茯苓菌株之間的親緣關(guān)系較近。這與同行所得到的我國茯苓種質(zhì)資源遺傳背景較窄結(jié)論相一致[6，9-12，16]。

筆者前期的研究結(jié)果表明，對于菌絲產(chǎn)胞內(nèi)多糖而言，DB菌絲生物量最高，AS 5.137菌絲胞內(nèi)多糖含量最高；對于菌絲產(chǎn)胞內(nèi)三萜而言，SC菌絲生物量最高，Y1菌絲胞內(nèi)三萜含量最高[1]，是否可以通過遺傳育種方法獲得遺傳穩(wěn)定、生物量與產(chǎn)胞內(nèi)多糖或三萜含量均高的優(yōu)質(zhì)發(fā)酵出發(fā)菌株，是今后值得去研究的方向。

體細胞不親和性分析作為一種傳統(tǒng)的菌種鑒定技術(shù)，常被用于菌種之間的親緣關(guān)系鑒定。結(jié)合本研究ISSR標記分析結(jié)果，筆者選取遺傳相似系數(shù)為26%～94%的9種菌株進行體細胞不親和性分析。大部分菌株之間具有較弱的拮抗性，表明測試菌株之間存在一定的差異性。盡管在ISSR分析中，L菌株與GIM 5.219存在明顯的遺傳距離，但該2種菌株并未表現(xiàn)出體細胞不親和性行為。結(jié)果表明體細胞不親和性分析結(jié)果并不能完合吻合ISSR標記結(jié)果。此外，實驗結(jié)果也表明菌株之間的拮抗強度與ISSR標記分析得到的遺傳相似度不具有顯著的正相關(guān)關(guān)系，這與應(yīng)用體細胞不親和性標記與RAPD標記分析糙皮側(cè)耳品種的遺傳關(guān)系結(jié)論相類似[22]。

本研究結(jié)果表明ISSR標記可作為鑒定茯苓菌株之間親緣關(guān)系的一種DNA分子標記技術(shù)，ISSR分析結(jié)果表明筆者收集的20種茯苓菌株，其中19種茯苓菌株遺傳關(guān)系較近，反映測試的茯苓種質(zhì)資源遺傳背景較窄。