吳 勇，施 鋼，謝又興，陳志光，潘傳豪*

(1.廣東海洋大學(xué)，廣東 湛江 524088；2.湛江市合興水產(chǎn)科技有限公司，廣東 湛江 524000)

1 材料方法

1.1 材料

本實驗在廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物教學(xué)基地室內(nèi)進(jìn)行，實驗用細(xì)鱗幼魚捕自湛江市海區(qū)，平均體長為(2.48±0.23)cm，平均體質(zhì)量(0.92±0.31)g。

高鹽度調(diào)節(jié)用鹽(徐聞縣海龍海洋生物制劑廠制作的“海龍牌”海水晶)，東海島海區(qū)自然砂濾海水及曝氣24 h以上的自來水，ATAGO-S20折射式鹽度計。

以1 m3玻璃鋼圓桶為自然砂濾海水儲水桶，250 L的白色聚丙烯方形桶(長×寬×高=70 cm×50 cm×70 cm，以下簡稱方形桶)為實驗用桶，實驗前1 d以300 mg·L-1KMnO4消毒后用淡水洗凈。

1.2 方法

1.2.1 各梯度海水的配制

分別設(shè)置0、5、10、20、30、40、50、55、60和65共10個鹽度梯度，以鹽度30的自然海水為對照組，高鹽度海水通過砂濾海水+經(jīng)過濾的海水晶配制成一份母液后，曝氣2 h后再等分成3份，最后再分別分裝入另外2個方形桶中而獲得，以此確保3個重復(fù)鹽度相一致；低鹽度海水由自然砂濾海水+曝氣24 h以上的自來水調(diào)配成一份母液后，曝氣2 h后再等分成3份，最后再分別分裝入另外2個方形桶中而獲得；鹽度為0的為曝氣24 h以上的自來水。調(diào)配好后貼上標(biāo)簽注明鹽度，每個方形桶盛水50 L。

1.2.2 鹽度驟變實驗

為初步確定最高濃度，預(yù)實驗設(shè)置了鹽度為65、75、80的高鹽度海水梯度，每個處理組放10尾魚，結(jié)果表明鹽度75和80的細(xì)鱗幼魚1 h內(nèi)存活率為0%，鹽度65的細(xì)鱗幼魚2 h內(nèi)存活率40%，初步確定鹽度65為本次鹽度脅迫實驗最高鹽度。

1.2.3 鹽度恢復(fù)實驗

1.2.4 吸水率和脫水率的計算

脫水率(The dehydration rate，%)：DHR=(We-WO) ×100/ WO；

吸水率(The water absorption rate，%)：WAR=(We-WO) ×100/ WO；

其中，We為實驗終末體質(zhì)量(g)；WO為相應(yīng)的初始體質(zhì)量(g)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2003和SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，用完全隨機(jī)設(shè)計的單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行分析(成活率數(shù)據(jù)經(jīng)反正弦變換后進(jìn)行ANOVA處理)，當(dāng)其達(dá)到顯著差異(P<0.05)，進(jìn)行Duncan多重比較檢驗組間差異，找出存活時間和成活率有統(tǒng)計差異的組別[12]。

2 結(jié)果

2.1 存活時間和存活率

表1 細(xì)鱗幼魚鹽度驟變實驗中存活時間統(tǒng)計表

Tab.1 Surviving time span and surviving rates of Terapon jarbua in acute salinity stress experiment

鹽度Salinity24h存活率/%Survivingratesin24h48h存活率/%Survivingratesin48h72h存活率/%Survivingratesin72h恢復(fù)實驗存活率/%Survivingratesinrecoveryexperiment總存活率/%Totalsurvivingrates最短存活時間/hMinimalsurvivingtimespan最長存活時間/hMaximalsurvivingtimespan平均存活時間/hMeansurvivingtimespan650.0a0.0a0.0a-00.973.751.88A6030.0b23.3b23.3b23.323.31.18>72>72B5556.7c53.3c53.3c53.353.31.78>72>72B5093.3d93.3d93.3d93.393.33.83>72>72B40100.0d100.0d100.0d100.0100.0>72>72>72B30100.0d100.0d100.0d100.0100.0>72>72>72B20100.0d100.0d100.0d100.0100.0>72>72>72B10100.0d100.0d100.0d100.0100.0>72>72>72B5100.0d100.0d100.0d100.0100.0>72>72>72B090.0d90.0d90.0d90.081.09.8>72>72B

注：同一列數(shù)據(jù)相同字母者表示差異不顯著(P>0.05)，反之差異顯著；“-”表示數(shù)據(jù)未測定或無。下同。

Notes：Labeling identical letters on data in the same column showed no significant differences(P>0.05)，otherwise significant difference(P<0.05);“-”indicated the data was not measured or no.Similarly hereinafter.

方差齊性檢驗表明，各處理組存活時間方差不齊，使用Tamhane多重比較，結(jié)果表明鹽度為65處理組的平均存活時間與其他處理組的平均存活時間有極顯著差異，此處理組的平均存活時間ASTS65(1.88 h)<其他處理組的ASTS(>72 h)，說明細(xì)鱗幼魚在鹽度為65、60、55的海水中的存活時間顯著低于其他鹽度組的存活時間。

對存活率作反正弦變換后進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明，鹽度65、60、55處理組存活率分別與其他處理組之間(The survival rate，以下簡稱TSR)存在顯著差異，P<0.05(表1、圖1)。

LSD多重比較表明，TSR65、TSR60、TSR50、TSR0的存活率顯著低于其他處理組的存活率，其中TSR65與TSR60之間無統(tǒng)計學(xué)差異而與其他兩組有顯著差異，TSR50與TSR0之間無統(tǒng)計學(xué)差異而與其他兩組有顯著差異。

2.2 鹽度脅迫下的細(xì)鱗行為表現(xiàn)

2.3 攝食情況

實驗進(jìn)行24 h后，全部梯度存活下來的魚投喂沉性配合飼料后攝食強(qiáng)烈、快速搶食，與實驗前暫養(yǎng)時的攝食情況基本相同，本實驗的鹽度脅迫對存活下來的細(xì)鱗幼魚攝食情況無明顯的差異。

2.4 吸水率和脫水率

方差分析結(jié)果表明，鹽度為65和60的極高鹽度處理組與鹽度為5和0的極低鹽度處理組對全魚脫水率的影響具有顯著差異(P<0.05)，鹽度5組與鹽度0組具有顯著性差異(P<0.05)，鹽度65組與鹽度60組無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 細(xì)鱗幼魚鹽度驟變實驗中吸水率與脫水率變化統(tǒng)計表

Tab.2 The water absorption rate and the dehydration rate of Terapon jarbua in acute salinity stress experiment %

表2 細(xì)鱗幼魚鹽度驟變實驗中吸水率與脫水率變化統(tǒng)計表

鹽度Salinity1h后脫水率Dehydrationratein1h2h后吸/脫水率Waterabsorptionrateordehydrationratein2h8h后吸/脫水率Waterabsorptionrateordehydrationratein8h24h后吸/脫水率Waterabsorptionrateordehydrationratein24h最大吸/脫水率Maximalwaterabsorptionrateordehydrationratein2h最小吸/脫水率Minimalwaterabsorptionrateordehydrationrate65-10.4-12.7a//-16.6-8.860/-12.6a//-16.6-7.45/+2.4b+1.0a+0.1a+3.800/+6.5c+13.3b+10.4b+19.40

注： 數(shù)據(jù)前標(biāo)“-”的表示脫水，數(shù)據(jù)前標(biāo)“+”表示吸水，“/”表示數(shù)據(jù)未測定或無。

Notes：“-10.4”indicated dehydration rate 10.4%，“+2.4”indicated water absorption 2.4%，“/”indicated the data was not measured or no.

鹽度實驗2 h后高鹽度組出現(xiàn)明顯脫水，低鹽度組出現(xiàn)明顯吸水，24 h后鹽度5組比仍然存活的0、60組更能自主調(diào)節(jié)吸水率或者脫水率使體質(zhì)量回歸正常值，可見在鹽度5的低鹽組，細(xì)鱗幼魚滲透壓調(diào)節(jié)適應(yīng)能力高于60的高鹽組，也強(qiáng)于鹽度為0的低鹽組。

3 討論

3.1 細(xì)鱗的鹽度急性鹽度脅迫下的可能機(jī)制及其調(diào)節(jié)極限

魚類生存環(huán)境中的鹽度與魚體內(nèi)滲透壓有密切關(guān)系，溶解于水中的各種鹽類，通過滲透壓對魚體產(chǎn)生影響，魚類對鹽度變化的耐受性取決于其滲透壓調(diào)節(jié)能力以及與提供能量支持有關(guān)的代謝重組[13]。魚類生活水域的鹽度差異甚大，各種魚類能夠在不同鹽度的水域中正常生活，與其具有完善的生理調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)，但這種調(diào)節(jié)作用只能局限于一定的鹽度范圍內(nèi)，在不適宜的鹽度范圍內(nèi)，魚類即使能夠生存，也不能正常生長。海水硬骨魚類體液鹽分濃度即滲透壓一般比海水低，屬于低滲性溶液，對滲透壓的調(diào)節(jié)主要通過“飲海水，排鹽分”的方式進(jìn)行。海水硬骨魚類主要依靠鰓對鹽分進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)[14]，且主要是依靠鰓上皮細(xì)胞中為數(shù)不多的氯細(xì)胞[15]。首先，可從食物中獲得少量水分，更多的是吞入大量海水，大量的NaCl由腮絲上的泌氯細(xì)胞排出；其次，退化的腎小球可阻止因排泄廢物失水過多，而只排出Mg2+、SO42-、Ca2+及少量的水分[16]。細(xì)鱗屬于廣鹽性硬骨魚類，對外界滲透壓的變化有一定的調(diào)節(jié)能力，但當(dāng)鹽度變化超過一定的范圍時，在細(xì)鱗急性鹽度脅迫中表現(xiàn)為低鹽度為5以下、高鹽度為50以上產(chǎn)生明顯的吸水和脫水現(xiàn)象，此時已經(jīng)超過此魚類的內(nèi)部調(diào)節(jié)能力，會有吸水、脫水甚至死亡等巨大的生理影響。

侯俊利等[17]的研究表明，魚類通過改變鰓表皮細(xì)胞中的扁平細(xì)胞和泌氯細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)來適應(yīng)生存環(huán)境中鹽度的變化，在鹽度為10的海水中馴養(yǎng)的施氏鱘(Acipenserschrenckii)幼魚鰓小片上的泌氯細(xì)胞較在淡水中馴養(yǎng)的大。據(jù)王艷等[18]對不同鹽度下鱸魚(Lateolabraxjaponicus)稚魚鰓顯微結(jié)構(gòu)的研究表明，鹽度為15的稚魚鰓絲和鰓小片較窄且短，其上的泌氯細(xì)胞數(shù)量較多，體積顯著膨大；鹽度為7.5稚魚腮絲和鰓小片上的泌氯細(xì)胞數(shù)量、結(jié)構(gòu)變化不明顯；而鹽度為0稚魚鰓絲和鰓小片寬，間距小，其上的泌氯細(xì)胞數(shù)量較少，胞體較小，核較大，以此通過泌氯細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和數(shù)量變化來調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓以適應(yīng)生存環(huán)境的改變。馬慧等[19]的研究表明多種內(nèi)分泌激素如催乳素、生長激素、胰島素樣因子及皮質(zhì)醇等通過刺激新的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成，影響氯細(xì)胞增值與分化，改變離子與水的運(yùn)輸能力。稍低或稍高的鹽度(如鹽度20～40)脅迫對魚類組織的影響或損傷可能較小，魚類能通過自身的調(diào)節(jié)機(jī)制或通過修復(fù)可逐步適應(yīng)環(huán)境的改變。例如，在河口半咸水地區(qū)生活的鯔魚(Mugilcephalus)和魚(Planilizahaematocheila)，若從海水立即投入淡水中則會很快死亡，而在其生活的水體中逐漸加入淡水，直至養(yǎng)殖水體完全或大部分淡化，這個過程僅僅需要一兩個小時，它們便可以完全適應(yīng)淡水生活[20]。而極端鹽度(如鹽度≥60或鹽度≤5)脅迫可能會對魚類的鰓部等組織結(jié)構(gòu)造成不可逆的影響，帶來嚴(yán)重且不可修復(fù)的損傷。本實驗也表明，細(xì)鱗幼魚在鹽度為65的極端高鹽度脅迫下，在3.75 h內(nèi)全部死亡，最短死亡時間為0.97，平均死亡時間僅為1.88 h；在鹽度為60下的幼魚24 h死亡率也高達(dá)70%，最短死亡時間也僅為1.18 h。鹽度為0的幼魚24 h死亡率為10%，最短死亡時間為9.80 h，顯著長于鹽度為65和60的極端高鹽度下的存活時間，但在鹽度恢復(fù)實驗24 h內(nèi)死亡率增加到20%，這可能說明極高鹽度對魚鰓部組織的損傷程度大于極低鹽度對鰓部組織的損傷程度，高鹽度導(dǎo)致鰓小片上的扁平細(xì)胞變薄，且極高鹽度還可能致使鰓上某些酶活力降低或失活，甚至直接導(dǎo)致某些運(yùn)載蛋白的變性。

環(huán)境脅迫打破魚類與環(huán)境之間的平衡與協(xié)調(diào)，引起魚體內(nèi)分泌等生理狀態(tài)的紊亂[21]。當(dāng)鹽度脅迫可導(dǎo)致魚類去甲腎上腺素分泌的增加，當(dāng)這種脅迫加重或持續(xù)時間過長超出了魚體的調(diào)節(jié)和免疫應(yīng)答應(yīng)對能力時，會造成魚體體內(nèi)各種生理生化指標(biāo)的變化，出現(xiàn)行為異常甚至死亡[22]。Cannon應(yīng)急反應(yīng)學(xué)說(Emergency Reaction Hypothesis)認(rèn)為，當(dāng)機(jī)體遭受特殊緊急情況時，如鹽度突變，會使交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)反應(yīng)立即被調(diào)動起來，腎上腺素與去甲腎上腺素分泌大大增加，它們作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，提高興奮性，使機(jī)體處于警覺狀態(tài)[22]，表現(xiàn)為反應(yīng)靈敏、呼吸加強(qiáng)加快、心跳加快、糖原分解代謝加快等以利于應(yīng)急時的氧氣及能量供給，本實驗的細(xì)鱗幼魚呼吸頻率達(dá)160次/min以上即是其中的外在生理反應(yīng)。而童燕等[23]研究表明，急性鹽度脅迫導(dǎo)致施氏鱘血漿皮質(zhì)醇濃度顯著升高，鹽度15的皮質(zhì)醇在5 h時達(dá)到峰值，而鹽度為22的在0.5 h時達(dá)到峰值。皮質(zhì)醇能刺激魚類鰓上皮氯細(xì)胞密度增加，增強(qiáng)鰓內(nèi)Na+/K+-ATPase活性，促使過多的鹽分排出體外[24]。本實驗的細(xì)鱗幼魚生理和激素變化是否遵循此規(guī)律有待進(jìn)一步研究。

一般海區(qū)海水鹽度在35以下，而本實驗設(shè)計了50～65的鹽度處理組，超高鹽度設(shè)計的目的是考慮以下兩個可能的應(yīng)用：1)用于推測自然界中細(xì)鱗幼魚在海水極端鹽度中能生存的最高鹽度，與其現(xiàn)有的生態(tài)分布數(shù)據(jù)作比較、印證；2)用于將來養(yǎng)殖細(xì)鱗時，選擇養(yǎng)殖鹽度、低鹽度或者高鹽處理寄生蟲或者其他對鹽度敏感型的魚類疾病，如小瓜蟲，甚至是為推廣到鹽湖、鹽田等高鹽地區(qū)或者內(nèi)陸蝦池的混養(yǎng)模式中，作為養(yǎng)殖鹽度參考資料。

3.2 細(xì)鱗幼魚鹽度脅迫適應(yīng)能力與鹽度梯度變化速率的關(guān)系

此外，如圖2所示，在鹽度為65和60的極高鹽度脅迫下，細(xì)鱗幼魚出現(xiàn)明顯脫水現(xiàn)象，實驗進(jìn)行2 h后脫水率分別達(dá)到12.70%和12.62%并出現(xiàn)死亡，這可能說明細(xì)鱗幼魚對極高鹽度脅迫下的調(diào)節(jié)能力有限，無法應(yīng)對極高鹽度帶來的組織損傷及滲透壓改變等而最終導(dǎo)致死亡。在鹽度為5和0的極端低鹽度脅迫下，細(xì)鱗幼魚出現(xiàn)明顯吸水現(xiàn)象，實驗進(jìn)行2 h后吸水率分別為2.44%和6.46%，8 h后吸水率分別為1.03%和13.30%，24 h后吸水率分別為0.10%和10.40%(相對于8 h時的吸水率出現(xiàn)了止升下跌的趨勢)，細(xì)鱗幼魚在鹽度為5的脅迫下吸水率低于鹽度為0環(huán)境下的吸水率，且經(jīng)24 h的自身滲透壓調(diào)節(jié)后，其含水量基本恢復(fù)至原狀即滲透壓恢復(fù)平衡，此外，鹽度為0的幼魚在實驗進(jìn)行9.8 h后開始出現(xiàn)死亡，24 h內(nèi)死亡率為10%，并且在鹽度恢復(fù)過程中亦出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，鹽度恢復(fù)后24 h內(nèi)總死亡率升至19%，這可能表明幼魚在鹽度為5的海水下的調(diào)節(jié)能力強(qiáng)于鹽度為0的淡水下的調(diào)節(jié)能力，細(xì)鱗幼魚在鹽度逐步降低的情況下才能完全適應(yīng)淡水生活，并且需要一定的時間，通過逐步的適應(yīng)過程使機(jī)體適應(yīng)新的鹽度環(huán)境。于娜等[26]對不同年齡的暗紋東方鲀(Takofuguobscurus)的研究認(rèn)為，0齡組的幼魚的滲透壓調(diào)節(jié)能力較1齡魚的要弱，可能是其滲透壓調(diào)節(jié)的器官發(fā)育還不完善，不能完全行使其調(diào)節(jié)能力而導(dǎo)致死亡，細(xì)鱗幼魚是否也是因滲透壓調(diào)節(jié)的器官發(fā)育還不完善而導(dǎo)致死亡，還有待與成魚的鹽度實驗進(jìn)行進(jìn)一步對比研究。