唐 剛, 李世艷, 張冬青, 鄧曉鴻, 王韋崗

1.蚌埠產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院 (蚌埠 233040) 2鎮(zhèn)江市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心 (鎮(zhèn)江 212132) 3江蘇國測檢測技術(shù)有限公司 (蘇州 215300)

沙門氏菌(Salmonella)是一種常見的食源性致病菌，廣泛分布于自然界，能使人和動物致病，污染食品引發(fā)食物中毒。據(jù)統(tǒng)計，全球每年因食品中沙門氏菌污染引起的感染病例數(shù)以億計[1]。微生物實驗室的檢驗?zāi)芰χ苯雨P(guān)系到檢驗報告的準(zhǔn)確性和可信度。盲樣考核是驗證實驗室微生物檢驗?zāi)芰Φ挠行緩街?，是實驗室微生物檢測質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。中國食品藥品檢定研究院為了驗證全國承擔(dān)國家抽檢任務(wù)的微生物實驗室對沙門氏菌的檢測能力而進行了這次盲樣考核。

本文按照國家標(biāo)準(zhǔn) GB 4789.4—2016[2]對收到的編碼分別為CODEl～CODE10的10組沙門氏菌盲樣考核樣品進行了定性檢測和結(jié)果判定。通過此次盲樣考核，微生物檢測實驗室的檢驗?zāi)芰Φ玫搅擞行炞C，實驗室管理水平和沙門氏菌檢測技術(shù)水平得到了有效的提高。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品來源

由中國食品藥品檢定研究院發(fā)放的盲樣考核樣品10組。編碼分別為CODE1～CODE10，樣品為白色球狀西林瓶裝，包含陰性樣本和陽性樣本；10袋奶粉樣品，每袋質(zhì)量為25 g，編碼分別為CODE1～ CODE10。每個相同編碼的沙門氏菌樣品和奶粉樣品作為1組樣品進行檢測。

1.1.2主要試劑

緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液、亞硫酸鉍(BS)瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、三糖鐵(TSI)瓊脂、沙門氏菌生化鑒定試劑盒、沙門氏菌診斷血清、沙門氏菌陽性菌株CMCC(B)50115等，均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。所有試劑均經(jīng)過驗證[3]并在有效期內(nèi)使用。

1.2 方法

1.2.1檢測依據(jù)

依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn) GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》，對編碼分別為CODE1～CODE10的 10組樣品進行檢測，同時設(shè)陽性對照和空白對照。

1.2.2預(yù)增菌(按照盒內(nèi)附作業(yè)指導(dǎo)書進行)

在生物安全柜內(nèi)無菌操作打開西林瓶，取225 mL滅菌BPW增菌液加入到無菌均質(zhì)袋中，并將西林瓶內(nèi)白色小球加入到BPW增菌液中，充分溶解。然后再將與西林瓶相同編碼的奶粉樣品加入到上述BPW增菌液中，均質(zhì)混勻。另外同時接種沙門氏菌菌株做陽性對照。放入到36 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18 h。

1.2.3增菌

輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1 mL轉(zhuǎn)種于10 mL TTB內(nèi)，于42 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h。同時，另取1 mL轉(zhuǎn)種于10 mL SC內(nèi)，于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.4分離培養(yǎng)

將增菌液分別劃線到BS平板、XLD平板和沙門氏菌顯色平板上培養(yǎng)。

1.2.5生化試驗

按照GB 4789.4—2016中5.4規(guī)定的方法進行生化試驗。

1.2.6血清學(xué)鑒定

按照GB 4789.4—2016中5.5規(guī)定的方法進行血清學(xué)鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 預(yù)增菌

由表1樣品增菌結(jié)果可以看出CODE5的BPW培養(yǎng)液經(jīng)過培養(yǎng)后仍澄清透明，培養(yǎng)前后無明顯區(qū)別，顯示無菌生長，與空白對照的結(jié)果一致，初步判定CODE5為陰性對照。其他各編號的BPW培養(yǎng)液都變渾濁，顯示有菌生長。

2.2 增菌

經(jīng)過兩種培養(yǎng)基增菌后，除CODE5和空白對照仍澄清透明、顯示無菌生長外，其他各管的TTB都變渾濁、變黃；SC都變渾濁、變紅，顯示有菌生長。增菌結(jié)果見表1所示。

表1 樣品增菌結(jié)果

2.3 分離

各樣品在選擇性平板上劃線培養(yǎng)后生長情況見表2所示。CODE5和空白對照培養(yǎng)后顯示無菌落生長。CODE5的分離培養(yǎng)結(jié)果驗證了上述是陰性對照的假設(shè)。其余各樣品在BS平板上均有黑色菌落生成，有的帶金屬光澤、周圍培養(yǎng)基呈黑色。CODE1、3、7在XLD上有黑色菌落生成，在沙門氏菌顯示培養(yǎng)基上有紫紅色和藍綠色2種菌落生成；CODE2、4、6、8、9、10在XLD上有黃色菌落生成，在沙顯培養(yǎng)基上有藍綠色菌落生成；陽性對照在XLD上有黑色菌落生成，在沙顯培養(yǎng)基上有紫紅色菌落生成。比較可見沙顯培養(yǎng)基的分離效果比BS和XLD要好一些。依據(jù)沙顯培養(yǎng)基說明書，紫紅色菌落為沙門氏菌，初步判定CODE1、3、7為沙門氏菌檢出。

表2 細菌在各平板上的生長情況

2.4 生化試驗

對選擇性平板上典型和可疑菌落進行生化鑒定，部分生化鑒定結(jié)果見表3所示。依據(jù)GB 4789.4—2016標(biāo)準(zhǔn)分析，CODE1、3、7的生化鑒定結(jié)果符合沙門氏菌屬特性；CODE2、4、6、8、9、10不符合沙門氏菌屬特性。

表3 沙門氏菌生化鑒定結(jié)果

2.5 血清學(xué)鑒定

將生化試驗結(jié)果符合沙門氏菌屬特性的菌株做血清學(xué)凝集試驗。取單個可疑沙門氏菌純培養(yǎng)菌落接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，于(36±1)℃培養(yǎng)24 h，取純培養(yǎng)物作為玻片凝集用的抗原，生理鹽水作對照，分別進行O抗原和H抗原凝集試驗。結(jié)果CODE1、3、7均凝集，生理鹽水對照不凝集。

綜合以上生化試驗和血清學(xué)鑒定的結(jié)果，得出檢驗結(jié)果為編號CODE1、3、7盲樣為沙門氏菌陽性(檢出)；編號CODE2、4、5、6、8、10盲樣為沙門氏菌陰性(未檢出)。

3 結(jié)論

(1)微生物的培養(yǎng)、分離、鑒定分析，是一項細致嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ?，需要做好實驗室質(zhì)量控制工作。要從考核樣品中分離出特定的目標(biāo)菌，排除干擾菌，應(yīng)盡可能多選擇幾種增菌液、多選擇幾種分離平板、多劃線平板、多挑幾個可疑菌落鑒定分析，防止漏檢。

(2)生化試驗和血清學(xué)鑒定結(jié)果是否可靠依賴于菌落的純培養(yǎng)物，否則容易造成雜菌干擾而嚴(yán)重影響鑒定結(jié)果。傳統(tǒng)的劃線分離這一細節(jié)性工作顯得尤為重要，應(yīng)按照可疑菌落大小形態(tài)等的不同分別進行純化培養(yǎng)和后續(xù)試驗，以達到分離鑒定分析的可靠結(jié)果。

(3)沙門顯色培養(yǎng)基對雜菌的抗干擾能力明顯優(yōu)于BS和XLD選擇性培養(yǎng)基[4]。這是由于沙門顯色培養(yǎng)基利用培養(yǎng)基中的細菌特異性酶的顯色底物與沙門氏菌特有的辛酯酶反應(yīng)，從而通過觀察菌落顏色就可直接對菌落進行初步判定。本文的檢驗結(jié)果與上述一致。沙門氏菌顯色培養(yǎng)基的使用，有助于對可疑菌落的初步判定。傳統(tǒng)生化試驗和血清學(xué)鑒定，可對檢驗結(jié)果進一步驗證。