呂妍 張艷麗 張展鵬 趙亞婧 張藝山 李水秀 張宏

暨南大學附屬第一醫(yī)院皮膚科 暨南大學附屬第一醫(yī)院真菌病研究所，廣州510632

白念珠菌是人類正常菌群，也是致死性真菌感染重要病原體，侵襲性白念珠菌感染即使接受抗真菌藥物治療，病死率仍接近40%［1-2］。是否能夠適應(yīng)宿主微環(huán)境是白念珠菌能否存活并產(chǎn)生致病性的關(guān)鍵。在感染過程中，白念珠菌會遇到宿主各種環(huán)境壓力，如固有免疫細胞（巨噬細胞、樹突細胞或中性粒細胞等）爆發(fā)性產(chǎn)生活性氧［如過氧化氫（H2O2）、羥自由基、超氧化物離子］，專門誘導氧化應(yīng)激反應(yīng)以殺滅入侵的菌體［3］。為此，白念珠菌進化出多種快速適應(yīng)機制以有效應(yīng)對宿主免疫細胞內(nèi)氧化應(yīng)激等反應(yīng)，從而逃逸宿主殺滅。

線粒體復合物V（F1Fo-ATP 合酶）是線粒體氧化磷酸化過程的終端酶和關(guān)鍵酶。研究顯示，F(xiàn)1Fo-ATP 合酶在沙門菌對抗吞噬細胞的殺傷中起促進作用［4］。前期我們已報道F1Fo-ATP 合酶α 亞基編碼基因ATP1 是白念珠菌致病的關(guān)鍵基因，其缺失后白念珠菌對小鼠完全不具致死性［5］。那么，ATP1是否會影響菌體與宿主相互作用而致病呢？宿主吞噬細胞是系統(tǒng)性真菌感染的第一道中心屏障［6-7］，巨噬細胞是最重要的吞噬細胞之一［8］，而且組織中巨噬細胞又是抗真菌的關(guān)鍵效應(yīng)細胞［7］。因此，我們擬以前期發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，探索ATP1促進白念珠菌逃逸巨噬細胞殺傷以及氧化應(yīng)激的機制，為進一步確認ATP1編碼的蛋白Atp1p是否為藥物新靶點提供扎實的基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

（一）菌株、細胞株、實驗動物

白念珠菌親本株SC5314 由普林斯頓大學Amanda M.Gillum教授惠贈；ATP1缺失株由課題組前期首先構(gòu)建［5］，與親本株相比，ATP1缺失株缺少ATP1基因，且毒力因子等表型降低，氧化磷酸化功能受抑制。實驗菌株保存于-80 ℃甘油中，實驗前將受試菌株連續(xù)2 次轉(zhuǎn)種于酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）固體培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)，以保證菌株的活力和純度。小鼠巨噬細胞RAW264.7（ATCC）產(chǎn)自上海蓋寧生物科技有限公司。45 只SPF 級健康純系雌性BALB/c 小鼠（動物質(zhì)量合格證編號44002100017582），5 ～6 周齡，體重18 ～22 g，來自廣東省實驗動物中心，分為3 組，分籠飼養(yǎng)（每籠3 只），所有動物均于暨南大學醫(yī)學院中心實驗室動物室（動物實驗許可證號20180824-06）在20 ℃～24 ℃、光/暗周期12 h/12 h的環(huán)境中飼養(yǎng)。

（二）主要試劑和儀器

酵母提取粉、蛋白胨、瓊脂粉（美國BD 公司），RAW264.7 細胞專用培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司），乳酸脫氫酶（LDH）實驗試劑盒（英國Abcam 公司），2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFHDA，美國Sigma 公司），SYBR primer Ex Taq 擴增體系（日本Takara公司），細胞計數(shù)儀（美國Amersham公司），實時熒光定量PCR 儀（美國Perkin Elmer 公司），多功能酶標儀（美國Thermo Scientific公司），流式細胞儀（美國Becton Dickinson 公司），NanoDrop 2000c分光光度計（美國Thermo Scientific公司）。

二、方法

（一）白念珠菌體內(nèi)和體外細胞活性測定

1.體外細胞活性：收集對數(shù)生長期白念珠菌液，用滅菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次。用YPD液體培養(yǎng)基重懸菌體并調(diào)整至1.0×106細胞/ml，于30 ℃、150 r/min振搖培養(yǎng)。于第1、2、3、4、5天吸取菌液，連續(xù)10倍倍比稀釋5個濃度梯度，吸取各濃度菌液100 μl點樣至YPD固體培養(yǎng)基上，晾干，于30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，計數(shù)菌落數(shù)量［9］。實驗重復3次。

2. 體內(nèi)細胞活性：收集對數(shù)生長期白念珠菌液，生理氯化鈉溶液洗滌菌體3 次，并調(diào)整親本株和ATP1 缺 失 株 分 別 至1.0 × 106細 胞/ml 和1.0 ×107細胞/ml。將小鼠隨機分為親本株組、ATP1缺失組和陰性對照組，每組3只，按照分組分別將菌液尾靜脈注射，親本株組和ATP1 缺失組小鼠每只分別接種親本株菌液0.1 ml（1.0×105細胞）和ATP1缺失株菌液0.1 ml（1.0×106細胞），陰性對照組注射生理氯化鈉溶液0.1 ml。分別于感染后第1、2、3、4、5天取出小鼠的腎，稱重并研磨，10 倍系列稀釋后取0.1 ml接種于YPD固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)，48 h后計數(shù)菌落數(shù)量［10］。實驗重復3次。

（二）菌體與巨噬細胞相互作用實驗

1.白念珠菌存活率實驗：將小鼠巨噬細胞RAW264.7 傳代1 d 后收集，調(diào)整細胞為1.0 ×105個/ml 加入96 孔板，每孔100 μl ，置培養(yǎng)箱過夜。向含有巨噬細胞的96孔板中每孔分別加入白念珠菌親本株菌液或ATP1 缺失株菌液100 μl［感染復數(shù)（MOI）5∶1］，置于培養(yǎng)箱37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h，吹打混勻后吸取上述菌液倍比稀釋后接種于YPD 固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h，計算白念珠菌單菌落數(shù)。白念珠菌存活率=含巨噬細胞孔的白念珠菌菌落數(shù)/不含巨噬細胞孔的白念珠菌菌落數(shù)×100%［11］。實驗重復3次。

2.巨噬細胞損傷率實驗：巨噬細胞處理同上，分為實驗組和陽性對照組，實驗組中分別加入白念珠菌親本株菌液或ATP1 缺失株菌液100 μl（MOI 5∶1），置于培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）培養(yǎng)4 h；陽性對照組加入15 μl 裂解液，置于培養(yǎng)箱37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)45 min。處理完成后，將上清液分別轉(zhuǎn)至新的96 孔板中，加入等量細胞裂解液CytoTox96試劑，避光30 min。加終止液，檢測A490 值，計算LDH釋放百分比［11］。實驗重復3次。

（三）H2O2對菌體細胞活性的影響

1.點板實驗：收集對數(shù)生長期白念珠菌菌液，PBS重懸菌體并調(diào)整白念珠菌至1.0×106細胞/ml，連續(xù)10 倍倍比稀釋5 個濃度梯度。吸取各濃度菌液5 μl點樣至含H2O2（6 mmol/l）的YPD固體培養(yǎng)基上，將平板晾干，于30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察菌落生成狀態(tài)并拍照［12］。實驗重復3次。

2.H2O2對菌體的殺死率：收集對數(shù)生長期白念珠菌液，用YPD 液體培養(yǎng)基重懸并調(diào)整新鮮白念珠菌菌體至1.0 × 106細胞/ml，分為實驗組和對照組，將100 ml 實驗組白念珠菌液和68 μl 30%H2O2溶液（終濃度為6 mmol/L）加入250 ml 的玻璃錐形瓶里，對照組僅將白念珠菌液加入玻璃錐形瓶中，于30 ℃、150 r/min 振搖培養(yǎng)6、12、24 h 后吸取菌液，連續(xù)10 倍倍比稀釋5 個濃度梯度，吸取各濃度菌液100 μl 點樣至YPD 固體培養(yǎng)基上，晾干，于30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，計數(shù)菌落數(shù)量，H2O2對菌體的殺死率=（1-含H2O2的白念珠菌菌落數(shù)/不含H2O2的白念珠菌菌落數(shù)）×100%［12］。實驗重復3次。

（四）白念珠菌細胞內(nèi)活性氧水平測定

采用DCFH-DA 染色測定。巨噬細胞處理同上，向含有巨噬細胞的96 孔板中分別加入白念珠菌親本株菌液或ATP1 缺失株菌液100 μl（MOI 5∶1），置于培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）中培養(yǎng)1 h。收集菌體，用PBS洗滌菌體3次。采用流式細胞儀測定熒光值（激發(fā)光：595 nm；發(fā)射光：488 nm）。

此外，用YPD 液體培養(yǎng)基調(diào)整白念珠菌至1.0×107細胞/ml，加入H2O2（終濃度為1.6 mmol/L）后，于30 ℃、150 r/min振搖培養(yǎng)6 h。離心收集菌體，用滅菌PBS洗3次，并用PBS調(diào)整至1.0×107細胞/ml。加入DCFH-DA 染色液（終濃度為20 mg/L），37 ℃靜止避光培養(yǎng)20 min。離心收集菌體，用PBS 洗滌菌體3次。采用流式細胞儀測定熒光值（激發(fā)光：595 nm；發(fā)射光：488 nm）［12］。實驗重復3次。

（五）實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測過氧化氫酶1（CAT1）基因、超氧化物歧化酶4（SOD4）基因和超氧化物歧化酶5（SOD5）基因mRNA水平

收集對數(shù)生長期白念珠菌液，用YPD 液體培養(yǎng)基調(diào)整至2.0 × 106細胞/ml，加入H2O2（終濃度為1.6 mmol/L）后，于30 ℃，150 r/min 振搖培養(yǎng)6 h。離心收集菌體，參照文獻［13］提取白念珠菌RNA。用NanoDrop 2000c 分光光度計測RNA 濃度并用Thermo Scientific 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。以2 μl cDNA 為模板，加入SYBR primer Ex Taq 10 μl，正反向引物各0.5 μl，雙蒸水7 μl，RT-qPCR擴增（95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共40 個循環(huán)）。由系統(tǒng)軟件（Bio-Rad）監(jiān)測并計算Ct值，應(yīng)用2-△△Ct法計算基因mRNA表達水平［13］。實驗重復3次。

（六）統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0 和Graphpad Prism 6.0 軟件進行統(tǒng)計分析、繪圖。采用重復測量設(shè)計的方差分析統(tǒng)計白念珠菌體內(nèi)外細胞活性；采用重復測量設(shè)計的方差分析和Student t檢驗分析H2O2對菌體細胞活性的影響；采用Student t檢驗分析菌體與巨噬細胞相互作用；采用雙因素方差分析統(tǒng)計實時熒光定量PCR的結(jié)果。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 ATP1對白念珠菌體外和體內(nèi)細胞活性的影響 1A：在YPD液體培養(yǎng)基中的細胞活性；1B：白念珠菌尾靜脈接種小鼠后腎臟載菌量。CFU：菌落形成單位

結(jié) 果

一、ATP1 缺失后白念珠菌體外和體內(nèi)細胞活性降低

對白念珠菌在體外形成菌落數(shù)進行重復測量設(shè)計方差分析，結(jié)果顯示，時間效應(yīng)有統(tǒng)計學意義（F=1 277.80，P=0.021）；時間與處理交互效應(yīng)也有統(tǒng)計學意義（F=612.81，P=0.030）；菌落數(shù)隨時間呈線性增長（F=138.46，P ＜0.001），親本株組和ATP1 缺失組隨時間變化趨勢不同（F = 90.12，P =0.001）；ATP1缺失組在體外培養(yǎng)第3天菌落數(shù)約是親本株組的10%（F=481.84，P ＜0.001）（圖1A）。

對小鼠每個時間點腎臟組織形成菌落數(shù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，小鼠腎臟組織形成菌落數(shù)隨時間變化（F=538.10，P=0.032）；親本株組和ATP1缺失組比較，腎臟組織形成菌落數(shù)隨時間變化的趨勢不同（F=609.41，P=0.030）；親本株組腎臟組織形成菌落數(shù)隨時間呈線性增加趨勢，但ATP1 缺失組隨時間呈線性減少趨勢（F=11.79，P=0.026）；兩組間腎臟組織形成菌落數(shù)不同，ATP1缺失組顯著低于親本株組（F=78.27，P=0.001）（圖1B）。

二、ATP1 缺失后白念珠菌與巨噬細胞相互作用減弱

存活率實驗結(jié)果顯示，白念珠菌細胞與小鼠巨噬細胞共培養(yǎng)后，ATP1 缺失組菌體存活率為（62.67 ± 3.51）%，親本株組為（82.33 ± 2.52）%，兩組差異有統(tǒng)計學意義（t=7.88，P=0.001）。損傷率實驗顯示，與ATP1 缺失組共培養(yǎng)的巨噬細胞LDH釋放百分比為（27.80±3.54）%，與親本株組共培養(yǎng)的巨噬細胞為（87.78±0.17）%，兩者差異有統(tǒng)計學意義（t=33.89，P ＜0.001）。

三、ATP1缺失后白念珠菌對H2O2敏感性增強

點板實驗結(jié)果顯示，在YPD 固體培養(yǎng)基中，ATP1 缺失株與親本株生長無明顯差異；在含H2O2的YPD 固體培養(yǎng)基中，親本株生長與在YPD 中比較無明顯差異，而ATP1 缺失株明顯受抑制（圖2A）。

重復測量設(shè)計的方差分析顯示，白念珠菌細胞活性在H2O2作用下隨時間顯著變化（F = 18.85，P=0.02）；時間與處理交互效應(yīng)無統(tǒng)計學意義（F=7.29，P = 0.07）；白念珠菌細胞活性隨時間呈線性減少趨勢（F=40.60，P=0.003），ATP1缺失株細胞活性隨時間減少趨勢比親本株更明顯（F=12.63，P=0.024）；兩組間細胞活性不同，ATP1 缺失組顯著低于親本株組（F=3 440.65，P ＜0.001）。另外，采用非配對t檢驗分別對每個時間點的細胞活性進行分析，發(fā)現(xiàn)ATP1 缺失組H2O2的殺菌率均明顯高于親本株組，差異有統(tǒng)計學意義（6 h：t=7.100，P=0.002；12 h：t = 10.830，P = 0.001；24 h：t = 16.400，P=0.001）（圖2B）。

四、ATP1缺失株細胞內(nèi)活性氧水平升高

析因設(shè)計的方差分析顯示，與巨噬細胞共培養(yǎng)后白念珠菌細胞內(nèi)活性氧水平高于單獨白念珠菌培養(yǎng)（F1，8=32.44，P ＜0.001）；ATP1 缺失組細胞內(nèi)活性氧水平高于親本株組（F1，8=7.84，P=0.023）；此外，巨噬細胞對白念珠菌細胞內(nèi)活性氧水平的影響與ATP1基因有關(guān)（F1，8=9.23，P=0.016）。

圖2 ATP1 缺失對白念珠菌對H2O2敏感性的影響 2A：白念珠菌在不含或含H2O2的YPD 固體培養(yǎng)基上生長情況 自左向右各孔白念珠菌菌液濃度分別為105、104、103、102、10 個細胞/ml；2B：YPD 液體培養(yǎng)基中H2O2對白念珠菌殺死率隨時間變化情況。兩組間比較，a：P＜0.01；b：P＜0.001

此外，在通過H2O2建立的模擬巨噬細胞內(nèi)氧化應(yīng)激模型中，H2O2組白念珠菌細胞內(nèi)活性氧水平比未用H2O2組高（F1，8=154.5，P ＜0.001）；ATP1 缺失組也比親本株組高（F1，8=85.62，P ＜0.001）。此外，H2O2對白念珠菌細胞內(nèi)活性氧水平的影響與ATP1基因有關(guān)（F1，8=82.02，P ＜0.001）。

五、ATP1 缺失株細胞氧化應(yīng)激和活性氧清除相關(guān)基因的mRNA表達水平降低

見表1。析因設(shè)計的方差分析顯示，H2O2作用于白念珠菌后H2O2酶基因CAT1 mRNA 水平高于未用藥組（F1，8= 114.80，P ＜0.001）；ATP1 缺失組CAT1 mRNA 水平低于親本株（F1，8= 287.10，P ＜0.001）；H2O2對白念珠菌CAT1 mRNA 水平的影響與ATP1 基因有關(guān)（F1，8=41.54，P ＜0.001）。此外，H2O2作用于白念珠菌后超氧化物歧化酶基因SOD4和SOD5 mRNA 水平均高于未用藥組（F1，8=11.00，P = 0.011；F1，8= 1 033.00，P ＜0.001），ATP1 缺失組均低于親本株組（F1，8= 12.80，P = 0.008；F1，8=1 398.00，P ＜0.001），H2O2對白念珠菌SOD4 和SOD5 mRNA 水平的影響與ATP1 基因有關(guān)（F1，8=12.36，P=0.008；F1，8=1 155.00，P ＜0.001）。

討 論

前期我們發(fā)現(xiàn)，ATP1 缺失后高劑量（1.0×106細胞）白念珠菌對小鼠完全不致死［5］，雖然ATP1缺失株在體外細胞活性比親本株降低大約10 倍，但其對小鼠不致死的機制不能簡單地用ATP1缺失后白念珠菌生長缺陷解釋。為此，我們通過尾靜脈接種中劑量（1.0×105細胞）親本株和10 倍于親本株劑量（1.0×106細胞）的ATP1 缺失株菌體到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)接種親本株的小鼠于18 d 時全部死亡，而接種10 倍于該劑量的ATP1 缺失株菌體小鼠90 d時全部存活，而且一般狀態(tài)、生命體征與接種生理氯化鈉溶液組小鼠無明顯差異［5］。提示ATP1缺失后白念珠菌對小鼠完全不致死不能完全歸因于生長缺陷。為了進一步驗證該結(jié)論，我們進一步觀察中劑量親本株和10 倍于其劑量的ATP1 缺失株菌體在小鼠體內(nèi)的細胞活性。結(jié)果顯示，親本株組腎臟組織形成菌落數(shù)隨時間呈線性增加趨勢，而ATP1缺失組腎臟組織形成菌落數(shù)隨時間呈線性減少趨勢，甚至在接種第3天時檢測不到菌體。提示ATP1缺失后白念珠菌對小鼠完全不致死與其被清除有關(guān)。前期病理檢測結(jié)果顯示，ATP1 缺失株對小鼠組織不產(chǎn)生損害，進一步驗證了該推論。

表1 ATP1對白念珠菌CAT1和SOD4、SOD5基因mRNA水平的影響（±s）

表1 ATP1對白念珠菌CAT1和SOD4、SOD5基因mRNA水平的影響（±s）

注：CAT1，過氧化氫酶1；SOD4，超氧化物歧化酶4；SOD5，超氧化物歧化酶5

組別n 33 CAT1 H2O2（-）1 0.20±0.02 H2O2（+）2.31±0.23 0.53±0.13 SOD4 H2O2（-）1 1.04±0.18 H2O2（+）8.06±3.57 0.84±0.19親本株組ATP1缺失組SOD5 H2O2（-）1 0.67±0.06 H2O2（+）7.40±0.31 0.49±0.11

當病原體侵入機體后，以巨噬細胞為代表的吞噬細胞立即響應(yīng)，識別、吞噬病原體并調(diào)動還原型輔酶Ⅱ氧化酶體和線粒體向吞噬泡內(nèi)釋放大量活性氧以實現(xiàn)對病原體的殺滅和清除。那么，ATP1缺失株是否未能逃逸免疫細胞殺傷而被宿主清除？為了驗證該假設(shè)，我們在體外將菌體與巨噬細胞共培養(yǎng)，進一步檢測菌體細胞活性以及巨噬細胞LDH水平，結(jié)果顯示，ATP1缺失后菌體存活率及其對巨噬細胞損傷均明顯降低。說明ATP1在白念珠菌逃逸巨噬細胞殺傷中起促進作用。

嚴重的氧化應(yīng)激是真菌病原體吞噬過程中的主要免疫防御反應(yīng)［3，14］，那么ATP1是否通過介導氧化應(yīng)激以逃逸巨噬細胞殺傷呢？通過點板實驗和測定白念珠菌在模擬巨噬細胞內(nèi)氧化應(yīng)激模型下細胞活性，我們發(fā)現(xiàn)，ATP1缺失后白念珠菌對H2O2敏感性增強。此外，我們通過化學發(fā)光測定白念珠菌在H2O2作用下細胞內(nèi)活性氧水平，發(fā)現(xiàn)ATP1 缺失后白念珠菌清除活性氧能力顯著降低。上述結(jié)果均提示，ATP1 在白念珠菌中抵抗氧化應(yīng)激和清除活性氧的功能。

活性氧累積增加不能簡單地用ATP1缺失后白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換缺陷解釋。Lopes da Rosa等［15］研究發(fā)現(xiàn)，Rtt109缺失后菌株雖然形態(tài)轉(zhuǎn)換缺陷，但活性氧累積無差異。在感染過程中，免疫細胞爆發(fā)性產(chǎn)生活性氧來殺滅入侵病原體，白念珠菌通過上調(diào)吞噬細胞內(nèi)H2O2酶和活性氧解毒酶——超氧化物歧化酶來對抵抗這種攻擊［3］。我們推測，ATP1缺失后菌體抵抗氧化應(yīng)激和清除活性氧降低的表型極有可能歸因于下調(diào)H2O2酶和超氧化物歧化酶編碼基因。RT-qPCR數(shù)據(jù)驗證了該推測，ATP1缺失后白念珠菌H2O2酶和超氧化物歧化酶基因表達降低。

總之，本研究表明ATP1 缺失后分別通過下調(diào)氧化應(yīng)激和活性氧清除相關(guān)基因表達使白念珠菌抵抗氧化應(yīng)激和清除活性氧能力明顯減弱，從而不能逃逸巨噬細胞監(jiān)督而被宿主清除。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突