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(1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江大學(xué)-阿爾伯塔大學(xué)分子營養(yǎng)與生物活性肽聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州310058;2.阿爾伯塔大學(xué)農(nóng)業(yè)食品營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,加拿大阿爾伯塔省埃德蒙頓T6G 2P5)

中國是世界上最大的肉牛生產(chǎn)消費(fèi)國之一,二十多年來中國牛肉市場發(fā)展迅速,肉牛數(shù)量穩(wěn)定在1 億頭左右,消費(fèi)量從1996 年的350 萬噸增加到2015 年的730萬噸,增長了111%[1]。牛骨約占牛體積的20%[2],是肉牛產(chǎn)業(yè)中的主要副產(chǎn)物之一。牛骨中蛋白含量為16%～25%,其中膠原蛋白是主要蛋白,占總蛋白的80%～90%[3]。目前大部分牛骨被用于生產(chǎn)骨泥、骨粉、骨油、骨膠,也作為磷酸鈣制劑或動物飼料的原料,產(chǎn)品附加值較低[4-7],而牛骨中的膠原蛋白經(jīng)過酶解、分離純化等手段得到的膠原蛋白肽,具有抗高血壓、保護(hù)骨健康、抗菌、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等生理活性,對于改善人體健康具有重要意義[8]。因此本文圍繞牛骨中膠原蛋白提取方法、膠原蛋白肽制備方法和生理活性展開綜述,為高效利用畜禽骨中的膠原蛋白,生產(chǎn)具有活性的多肽提供研究思路。

1 牛骨膠原蛋白提取工藝

Ⅰ型膠原蛋白是牛骨中的主要蛋白。膠原分子由三條鏈通過氫鍵作用力結(jié)合形成,具有穩(wěn)定的三股螺旋結(jié)構(gòu),含有重復(fù)氨基酸序列Gly-X-Y(其中Gly為甘氨酸,X是脯氨酸,Y是羥脯氨酸)。羥脯氨酸是膠原蛋白的特有氨基酸[9],在檢測中通常可用它來反映膠原蛋白的含量。盡管畜禽骨中含有大量的膠原蛋白,但由于膠原蛋白特殊的分子結(jié)構(gòu)特征,建立穩(wěn)定、高效的骨源膠原蛋白提取方法是長期以來的技術(shù)難題[10]。作為制備膠原蛋白肽的前處理步驟,從牛骨中提取膠原蛋白至關(guān)重要。國內(nèi)外對牛骨中的膠原蛋白提取已經(jīng)進(jìn)行了較為廣泛的研究,常用的提取方法有:酸法、堿法提取、酶法提取、水熱抽提、熱壓浸提等[11],在實(shí)際生產(chǎn)提取過程中,往往結(jié)合多種提取方法,以提高牛骨的膠原蛋白得率[12]。

1.1 酸法、堿法提取

酸法提取主要是利用低濃度的酸制造酸性環(huán)境,破壞分子間的離子鍵和西佛堿(含亞胺或甲亞胺基團(tuán)(-RC=N-)的有機(jī)化合物),打開含醛胺類交聯(lián)鍵,使膠原纖維膨脹和溶解[13]。在低溫條件下,酸法可最大程度上保留膠原蛋白天然三股螺旋結(jié)構(gòu),但其缺點(diǎn)在于部分氨基酸(色氨酸、絲氨酸和酪氨酸)會被部分破壞,產(chǎn)品得率較低,酸溶液也會腐蝕設(shè)備,具有一定的局限性[14]。酸法提取時(shí),最常用的是低濃度醋酸[15],何蘭[12]采用醋酸水解牛骨制備膠原蛋白,確定了最佳工藝條件,先以0.1 mol/L醋酸對脫脂脫鈣后的粗提物透析2 d,后以蒸餾水透析1 d,其得率為2.34%;王曉軍等[16]將牦牛骨脫脂脫鈣后,先用0.5 mol/L醋酸浸提5 d,再以6 g/L的Tris提取液鹽析,其酸溶性膠原蛋白得率為2.24%。

堿法提取常用的處理劑為石灰、氫氧化鈉、碳酸鈉等,原理是破壞含羥基和巰基的氨基酸,造成肽鍵水解,產(chǎn)生消旋作用,其工藝步驟簡單,產(chǎn)品分子量小,成本低廉,但其應(yīng)用并不廣泛,其缺點(diǎn)是容易引起膠原蛋白的變性。如果嚴(yán)重水解,會發(fā)生消旋作用而產(chǎn)生有毒物質(zhì),進(jìn)而產(chǎn)生致癌、致畸型、致突變的“三致”后果[17]。因此,單獨(dú)利用堿法提取膠原蛋白的報(bào)道并不多。

選用酸法或堿法提取膠原蛋白時(shí),應(yīng)控制提取溫度,若過高會導(dǎo)致膠原蛋白的生物活性被破壞,影響產(chǎn)品品質(zhì):酸法提取處理后膠原溶解量很少,得率較低,會破壞部分氨基酸;堿法提取水解嚴(yán)重時(shí)會產(chǎn)生有毒性的D型氨基酸消旋混合物[14]。相關(guān)研究集中于用酸法或堿法提取雞骨、魚骨中蛋白質(zhì),但兩種方法因難于實(shí)現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn)而應(yīng)用性受到限制[18]。

1.2 酶法提取

酶法提取是加入特定的蛋白酶以增進(jìn)膠原蛋白非螺旋區(qū)段肽鍵降解,酶法提取能從骨副產(chǎn)物中有效的提取蛋白質(zhì),并且可以通過水解作用改善骨源蛋白質(zhì)的質(zhì)量和其功能特性[19]。蛋白酶主要作用于膠原蛋白螺旋以外的區(qū)域,一般不會引起膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)變化。常用的有胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等。木瓜蛋白酶作用優(yōu)先斷裂與精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)、苯丙氨酸(Phe)連接的肽鍵,終產(chǎn)物以長肽為主[20-21]。胰蛋白酶是一種內(nèi)切酶,對Arg和Lys的肽鍵具有選擇性水解作用,終產(chǎn)物以短肽為主[22]。胃蛋白酶是在N端的3/4處將膠原蛋白切斷,能夠較為完整地保留膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)和生物活性,因此常用于膠原蛋白的提取[23-24]。膠原酶是一種能在中性pH環(huán)境下特異分解天然膠原的酶[25],缺少亞氨基,作用位點(diǎn)在775～776位氨基酸之間,可以使三股螺旋結(jié)構(gòu)較松散[26],細(xì)菌膠原酶可以從從肽鏈兩端逐步水解膠原蛋白[27]。

酶法提取牛骨中的膠原蛋白,酶解時(shí)間短,得到的膠原蛋白水解物純度高、溶解性好、性質(zhì)穩(wěn)定,不破壞膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu),使其保留了一定的生物結(jié)構(gòu),并且較酸法和堿法產(chǎn)生的環(huán)境污染小,因此在膠原的提取中應(yīng)用廣泛。Linder等[28-30]采用了不同的酶解方法,成功提取了小牛骨蛋白,產(chǎn)品乳化能力好,穩(wěn)定性高,富含谷氨酸、甘氨酸、羥脯氨酸和脯氨酸。劉麗莉[31]篩選出一種Bacilluscereus菌株,可高產(chǎn)膠原蛋白酶且能降解骨骼,用其發(fā)酵牛骨,骨膠原蛋白的提取率高達(dá)43%;吳婷[23]利用酸溶結(jié)合胃蛋白酶的提取海北牦牛的牛骨渣膠原蛋白,提取率為3.32%;烏日古莫樂[24]對吉爾利閣蒙古牛骨膠原蛋白的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,胃蛋白酶添加量為4%,最大提取率達(dá)到16.92%;成曉瑜等[32]以膠原蛋白純度只有14.2%的鮮牛棒骨為原料,采用0.3%胃蛋白酶結(jié)合0.05 mol/L鹽酸浸泡的方法,確定了高脂肪和高鈣含量牛骨膠原蛋白的提純工藝,提純后膠原蛋白純度高達(dá)99.0%;王曉軍等[16]以青海牦牛骨為原料,分別采用酸法(冰醋酸)和酶法(胃蛋白酶)提取膠原蛋白,結(jié)果表明兩種方法提取的膠原蛋白在理化性質(zhì)上并無明顯差異,但酶法提取的膠原蛋白得率較高,成品較低。綜上可知,酶法提取膠原蛋白得率較高,應(yīng)用較多。

1.3 水熱抽提和熱壓浸提

水熱抽提、熱壓浸提也用于牛骨中膠原蛋白的提取。水熱抽提能夠分解膠原蛋白分子間和分子內(nèi)的氫鍵和共價(jià)交聯(lián),并水解膠原分子初級結(jié)構(gòu)的部分酰胺鍵[33]。膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞轉(zhuǎn)化為無規(guī)則卷曲狀態(tài),所得到的水熱抽提膠原蛋白具有較高的溶解性,也可稱其為明膠[34]。熱壓浸提技術(shù)在企業(yè)中應(yīng)用較為廣泛,其最大的特點(diǎn)是不引入酸堿鹽等化學(xué)物質(zhì),產(chǎn)品得率高。樊曉盼等[35]利用響應(yīng)面法優(yōu)化出熱壓浸提牛骨蛋白的最佳工藝為料液比1∶4,133 ℃浸提4 h,提取率可達(dá)64.73%。張永秀等[36]以牛脊椎骨為原料,經(jīng)121 ℃、30 min預(yù)處理結(jié)合風(fēng)味蛋白酶水解制備出分子量低且無苦味的低聚肽,產(chǎn)物氮溶出率高達(dá)95%。水熱抽提、熱壓浸提法常常和酶法聯(lián)用以提高提取效率,韋漢昌等[37]利用高壓脈沖電場協(xié)同酶法提取牛骨蛋白,蛋白溶出率可達(dá)65.2%。上述牛骨膠原蛋白的提取方法及優(yōu)缺點(diǎn)和膠原得率如表1所示,在實(shí)際生產(chǎn)中,上述酸法、酶法、水熱浸提法等往往聯(lián)用以提高膠原蛋白提取效率。

表1 牛骨膠原蛋白提取方法及優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 Bovine bone collagen extraction methods and their advantages and disadvantages

2 牛骨膠原蛋白肽制備工藝

2.1 牛骨膠原蛋白肽的酶法制備

生物酶是一種高效、綠色的從蛋白原料中釋放活性肽的方法,蛋白酶法制備活性肽因具有時(shí)間短、生產(chǎn)工藝簡便的優(yōu)勢而備受青睞。白恩俠等[40]用2.5%的鮮胰漿(胰酶)酶解高溫蒸煮后的牛骨溶液,經(jīng)分離除雜后制得含氮量19%,分子量小于7000 Da的骨小肽。Dong等[41]檢驗(yàn)了不同時(shí)間下風(fēng)味酶水解雞骨的效果,發(fā)現(xiàn)8 h水解的產(chǎn)物中小分子肽(400～1000 Da)的比例是1 h水解產(chǎn)物中的74倍。蔡麗華等[42]使用4種常用蛋白酶酶解牛骨,研究其酶解動力學(xué),發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶和胰蛋白酶與牛骨膠原蛋白底物結(jié)合能力更強(qiáng),酶解效果更好。

不同蛋白酶因其專一性具有不同的酶切位點(diǎn),水解同一種蛋白原料獲得的多肽序列也不盡相同。利用多種蛋白酶同時(shí)或者先后作用于蛋白底物,具有協(xié)同增效作用,能夠大大提高酶解效率[43]。酶解牛骨膠原蛋白常用的是胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶等,酶解效果受溫度、蛋白酶配比和添加量影響,文獻(xiàn)中報(bào)道水解度范圍為18.34%～63.6%[44-46]。

相較于利用成熟的商業(yè)化蛋白酶水解骨膠原蛋白,開發(fā)可以天然降解膠原蛋白為膠原多肽的膠原蛋白酶具有較高的研究價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。劉麗莉等[47-48]從骨骼堆積土樣中篩選到對Ⅰ型骨膠原蛋白水解能力強(qiáng)的一株的菌株蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)MBL13,骨膠原蛋白的分子量隨著水解時(shí)間增加而逐漸變小,進(jìn)一步研究從該菌株中鑒定出膠原蛋白酶基因,并成功構(gòu)建大腸桿菌工程菌pET30a-ColM13/BL21,所產(chǎn)重組蛋白酶ColM13可有效酶解Ⅰ型骨膠原蛋白。

2.2 膠原蛋白肽的分離純化方法

將膠原蛋白從牛骨蛋白中釋放出來后,需要進(jìn)一步通過分離純化手段從復(fù)雜的酶解產(chǎn)物中得到純度高、生理功能強(qiáng)的活性肽。由于不同原料獲得的酶解產(chǎn)物成分各異、組成復(fù)雜,分離純化工藝成為解析多肽生理活性的關(guān)鍵[49]。分離純化過程往往耗時(shí)長,并且價(jià)格昂貴,因此常通過聯(lián)合若干分離純化步驟而實(shí)現(xiàn)。目前已較成熟、廣泛使用的分離純化方法如下所述。

2.2.1 膜技術(shù) 膜分離技術(shù)是當(dāng)前活性肽領(lǐng)域十分青睞和成熟的分離技術(shù)之一。其中,超濾(Ultrafiltration,UF)技術(shù)是一種興起于20世紀(jì)60年代的經(jīng)典膜分離手段[50]。超濾技術(shù)以篩分為分離原理,以超濾膜為核心部件,以膜兩側(cè)壓力差為推動力,完成對目標(biāo)組分的分離和濃縮[51]。超濾膜的孔徑一般在1～20 nm之間,在實(shí)際應(yīng)用中常以截留分子量(MWCO)來表征,能有效捕獲或去除相對分子質(zhì)量在 500～500000 Da 的物質(zhì)。超濾技術(shù)具有操作方便、用時(shí)短、能耗低、蛋白回收效率高等優(yōu)點(diǎn),并且可在常溫下進(jìn)行操作,適用于分離熱敏性物質(zhì)。但同時(shí)具有膜易堵塞、分離精度低的缺點(diǎn)。在操作過程中根據(jù)樣品特性調(diào)節(jié)操作參數(shù)是高效、安全、長期運(yùn)行超濾系統(tǒng)的必要條件[52]。

劉正偉等[53]通過超濾及Sephadex G-10層析柱制備出小于10 kDa的牛骨膠原多肽,經(jīng)體外細(xì)胞模型驗(yàn)證其具有抑制破骨細(xì)胞的骨吸收作用,并促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡。劉麗莉[31]優(yōu)化了不同MWCO的超濾膜超濾發(fā)酵骨膠原多肽的工藝參數(shù),獲得骨膠原多肽小于4 kDa的組分超過60%,并以此為原料開發(fā)出了新型補(bǔ)鈣產(chǎn)品膠原多肽螯合鈣。膜分離有利于得到分子量更小的膠原多肽,有利于進(jìn)一步研究其生理活性或開發(fā)出膠原多肽產(chǎn)品。

2.2.2 色譜技術(shù)

2.2.2.1 體積排阻色譜 體積排阻色譜(Size exclusion column,SEC)又稱凝膠色譜,是一種常見的根據(jù)凝膠孔隙的孔徑大小與樣品分子尺寸的相對關(guān)系而對溶質(zhì)樣品進(jìn)行分離色譜手段。常用于多肽分離的凝膠色譜柱包括Sephadex G系列、Bio-Gel P系列、TSK-GEL系列[54-56]。但凝膠色譜峰容量較低,僅能獲得幾個(gè)分子量級的不同組分。但它與反向高效液相色譜具有良好的互補(bǔ)性,常聯(lián)用于探索新型活性肽樣品的分離純化[57]。

張順亮等[58-59]利用超濾結(jié)合Sephadex G-25凝膠層析技術(shù)分離出牛骨膠原中性蛋白酶酶解產(chǎn)物中的2個(gè)較強(qiáng)抑菌活性的組分,酶解超濾后小于10 kDa的組分在20 mg/mL濃度下對大腸桿菌抑菌率為93.61%,再經(jīng)過凝膠層析技術(shù)分離后,10 mg/mL的兩個(gè)組分抑菌率分別達(dá)到100%和91.39%,說明進(jìn)一步的分離純化提高了牛骨膠原肽的抑菌活性。

2.2.2.2 反相高效液相色譜 半制備或制備級反相高效液相色譜(Reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)已被廣泛用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模分離蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。樣品溶質(zhì)進(jìn)入色譜柱后,依據(jù)在兩相間分配系數(shù)、吸附能力、親合力、分子大小不同在兩相間進(jìn)行多次的連續(xù)交換分配,進(jìn)而分離成不同峰片段[60]。在RP-HPLC分離過程中,流動相的極性一般比固定相強(qiáng),因此多肽水解物分離后得到的是疏水性不同的多肽組分。

Chen 等[33]通過反相高效液相色譜制備得到具有抗氧化活性的牦牛骨肽,并利用質(zhì)譜鑒定出4條來自膠原蛋白特有肽。同樣的方法也用于豬骨膠原蛋白肽的制備,耿秀芳等[61]利用陽離子交換樹脂層析、Sephadex G-25凝膠過濾和RP-HPLC從豬骨膠原水解物中多步分離純化出一種含9種氨基酸的IC50值為2.6×10-2mmol/L的ACE抑制肽。舒一梅等[62]優(yōu)化了制備型RP-HPLC分離豬骨膠原水解物中ACE抑制肽的條件,獲得了一種IC50值為0.0352 mg/mL的多肽。通過反相高效液相色譜制備骨膠原蛋白肽可以得到具有生理活性的多肽,能提高畜禽骨資源利用率。

2.2.2.3 離子交換色譜 離子交換色譜(Ion exchange chromatography,IEC)基于離子交換樹脂(固定相)與帶電分析物(流動相)之間的庫侖作用力差異進(jìn)行分離,依據(jù)交換的離子種類分為以磺酸基和羧酸基作功能基的陽離子交換色譜和以季銨基作功能基的陰離子交換色譜[63]。控制樣品離子與流動相離子對固定相表面的電荷位置競爭作用是分離關(guān)鍵,可通過改變洗脫液的pH來中和或者轉(zhuǎn)換分析物或固定相的電性,獲得最佳分離條件[64]。

劉小紅等[65]采用超濾結(jié)合UNO-S陽離子交換樹脂層析和Sephadex G-25凝膠過濾層析從豬骨膠原酶解液分離純化出IC50值為0.1953 mg/mL的ACE抑制活性組分。離子交換色譜法純化牛骨膠原蛋白肽未見報(bào)道,但在后續(xù)研究中,可以參考豬骨和其他源膠原蛋白肽的分離制備方法,分離牛骨膠原蛋白肽研究其生理活性。

生物活性肽的分離純化方法多種多樣,還包括如親和色譜法、親水作用色譜法、等電聚焦電泳法等,但在牛骨膠原蛋白多肽的分離純化研究中并未所見[60]。另外,各種分離純化方法各有優(yōu)劣,只有因“材”制宜地選擇不同手段聯(lián)用分離純化,才能有效獲得高純度、高活性的活性肽。

2.3 膠原蛋白肽的鑒定方法

通過膠原蛋白肽的鑒定可以確定膠原蛋白肽的來源、氨基酸序列,可以為進(jìn)一步的機(jī)理研究打下基礎(chǔ)。隨著質(zhì)譜分析技術(shù)的不斷更迭,電噴霧(ESI)、快速原子轟擊(FAB)和基體輔助激光解吸(MALDI)等軟電離方法的誕生,越來越多的研究采用質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)及多肽[66]。由于膠原蛋白特殊的結(jié)構(gòu),可以用鑒定羥脯氨酸等特征氨基酸或特征多肽序列來定性或定量地分析膠原蛋白肽。孫坤等[67]就建立了一種基于特征多肽的膠原定量檢測方法,通過序列比對的方法篩選膠原蛋白特征多肽,利用胰蛋白酶將牛Ⅰ型膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行酶解,采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)對特征多肽進(jìn)行檢測,該方法在含膠原蛋白醫(yī)療器械等生物制品質(zhì)量控制方面具有應(yīng)用前景。

3 牛骨膠原蛋白肽的主要生理活性

膠原蛋白肽可以作為作為特色食品添加劑、功能食品和化妝產(chǎn)品[8]。牛骨的膠原蛋白主要為Ⅰ型膠原蛋白,膠原白肽主要為含Gly-X-Y的重復(fù)結(jié)構(gòu),研究表明當(dāng)膠原蛋白以三肽形式攝入時(shí),水解產(chǎn)物能被人體有效吸收[68]。

3.1 抗高血壓和血管緊張素(ACE)抑制活性

利用化學(xué)/酶水解或微生物發(fā)酵手段可以從肉源物料中提取包括ACE-I,腎素和DPP-IV抑制劑在內(nèi)的有益健康的生物活性肽[69]。牛源膠原蛋白肽被鑒定出具有ACE抑制活性[70-71]。

蔡麗華等[72]通過酶解、超濾等手段制備得到分子量小于5000 Da的牛骨膠原蛋白肽,是一種競爭性抑制劑,可以與ACE結(jié)合從而減少ACE酶催化ACE-Ⅰ轉(zhuǎn)化為導(dǎo)致血壓升高的ACE-Ⅱ,由此可以起到降壓作用。Lafarga等[73]以肉類副產(chǎn)物如牛骨膠原蛋白為原料,通過多肽數(shù)據(jù)庫和計(jì)算機(jī)模擬軟件預(yù)測具有ACE-Ⅰ抑制活性的多肽,并經(jīng)化學(xué)合成后驗(yàn)證其體外活性,發(fā)現(xiàn)脯氨酸含量豐富的膠原蛋白是制備ACE抑制肽的優(yōu)質(zhì)來源,說明牛骨膠原蛋白肽具有促進(jìn)心臟健康作用。

3.2 促進(jìn)骨合成及代謝作用

越來越多的證據(jù)表明膠原蛋白肽對骨質(zhì)疏松癥緩解發(fā)揮積極作用:劉俊麗等[74]研究發(fā)現(xiàn)0.3 mg/mL的牛骨膠原蛋白能顯著促進(jìn)人成骨細(xì)胞的增殖,是一種良好的防治骨質(zhì)疏松的營養(yǎng)補(bǔ)充劑。Ye等[75]制備了一種新型促成骨細(xì)胞增殖的牦牛骨膠原蛋白肽,發(fā)現(xiàn)在0.5 mg/mL的濃度下處理96 h,成骨細(xì)胞增值率高達(dá)175.4%,通過質(zhì)譜鑒定,發(fā)現(xiàn)有28條肽來自Ⅰ型膠原蛋白α1鏈,有31條肽來自Ⅰ型膠原蛋白α2鏈。推測這些肽可能與表面生長因子(EGRF)之間形成了強(qiáng)氫鍵,有效刺激表面生長因子的活性位點(diǎn),從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。

葉孟亮[76]通過去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型發(fā)現(xiàn)分子量小于3 kDa的耗牛骨膠原蛋白肽在100、200、500 mg/kg的劑量下可以讓大鼠骨彈性載荷和斷裂載荷明顯上升,顯著提高大鼠骨小梁數(shù)目、密度、厚度和骨體積分?jǐn)?shù),降低了骨小梁間距;說明耗牛骨膠原蛋白肽能夠明顯改善去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥狀。此外,已有臨床實(shí)驗(yàn)表明,絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女口服補(bǔ)充膠原蛋白肽能夠調(diào)節(jié)骨代謝平衡,通過增強(qiáng)骨合成,降低骨吸收,使身體骨量增加,減少絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女的骨質(zhì)流失[77-78],但對牛骨膠原蛋白肽的防治骨質(zhì)疏松的臨床實(shí)驗(yàn)報(bào)道較少,還需研究者進(jìn)一步探究。

3.3 改善皮膚及愈合傷口作用

膠原蛋白肽可以添加在營養(yǎng)美容產(chǎn)品中用作為生物活性成分[78],能改善皮膚的基本狀況和皮膚構(gòu)造,可改善皮膚屏障功能,誘導(dǎo)膠原蛋白和透明質(zhì)酸的合成以及促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長和遷移,有助于傷口愈合和修復(fù)紫外線UV對皮膚的傷害。

在Asserin等[79]的臨床試驗(yàn)中,受試者連續(xù)8周每天口服魚源和豬源膠原蛋白肽10 g,檢測到真皮中的膠原蛋白密度增加,而真皮膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)的斷裂顯著降低,皮膚水合作用顯著增加。剖宮產(chǎn)后的大鼠創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)中,以每千克體重口服1.125 g劑量的膠原蛋白肽可以加快膠原蛋白沉積和增加組織血管生成,促進(jìn)傷口收縮,從而改善愈合情況,有期望在治療傷口的臨床實(shí)踐中起到積極作用[80]。Choi等[81]發(fā)現(xiàn)市售的膠原三肽(韓國Amorepacific公司)能有效地可用于皮膚傷口愈合和恢復(fù)部分光熱解處理后的皮膚。Tanaka等[82]發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)按照每天每千克體重口服攝入0.2 g劑量的膠原蛋白肽(提自羅非魚鱗片)可抑制由UV-B輻射產(chǎn)生的皮膚水分減少和表皮增生,以及可溶性Ⅰ型膠原蛋白降低等皮膚問題。

牛骨源膠原蛋白肽對皮膚的影響報(bào)道較少,徐騰等[83]發(fā)現(xiàn)牛骨膠原低聚肽對術(shù)后小鼠傷口愈合有一定作用,其機(jī)理一方面可能是提供了營養(yǎng)支持,使機(jī)體獲得充足的組織修復(fù)的能量,另一方面可能是其抑制了炎癥因子的表達(dá)。在今后的研究中可以嘗試探索牛骨源膠原蛋白肽對皮膚的修復(fù)作用,開發(fā)出優(yōu)質(zhì)的牛骨副產(chǎn)物營養(yǎng)食品。

3.4 抑菌作用

目前,抗菌肽成為對常規(guī)抗生素產(chǎn)生耐藥性的細(xì)菌的新克星,它能迅速殺死廣泛的傳染原并調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫,是保鮮劑研究的一個(gè)新方向[84]。富含脯氨酸的抗菌肽是陽離子宿主防御肽,可以選擇性殺死革蘭氏陰性細(xì)菌,對動物的毒性低,它們的作用方式不涉及細(xì)菌膜的裂解,而是需要滲透到易感細(xì)胞中,然后在細(xì)胞內(nèi)起作用。這些特性使它們作為抗感染的先導(dǎo)化合物,還能作為將不透膜藥物內(nèi)化到細(xì)菌和真核細(xì)胞中的新型潛在細(xì)胞穿透肽。這些特性讓抗菌肽既具有抗感染化合物作用,又能穿透細(xì)胞,將藥物內(nèi)化到細(xì)菌和真核細(xì)胞[85-87]。

牛骨膠原蛋白含有較多的脯氨酸,已有研究表明其具有抑菌作用。張順亮等[59]研究發(fā)現(xiàn),風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶的酶解液對金黃色葡萄球菌有抑菌效果,抑菌圈直徑為6.03和7.97 mm,動物復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶對腸炎沙門氏菌具有抑菌效果,其抑菌圈直徑分別為8.67、9.10、9.03 mm。通過在火雞制品中添加1.5%的骨膠原蛋白肽,菌落數(shù)明顯減少,說明骨膠原蛋白肽具有抑菌作用,可以延長產(chǎn)品貨架期[88]。

3.5 抗氧化活性

近年來人們對抗氧化劑的需求越來越多、要求越來越高,由于化學(xué)合成抗氧化劑對人體具有一定毒副作用,人們更青睞于天然高效安全的抗氧化活性物質(zhì)。多肽的抗氧化活性與他們的氨基酸組成、結(jié)構(gòu)、疏水性、分子量等都有關(guān),膠原蛋白肽氨基酸組成中的甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、蛋氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)含量使其具有螯合和清除自由基的能力[89]。

Ku等[90]發(fā)現(xiàn)牛骨膠原蛋白肽DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除率高達(dá)72.81%,超氧陰離子自由基清除活性高達(dá)(11.88±0.59)SOD U/g,具有較強(qiáng)抗氧化能力。王晨[91]利用酶解得到牛骨膠原蛋白,發(fā)現(xiàn)在80 g/L濃度下,其對超氧陰離子清除率可達(dá)63.86%,對羥基自由基清除率為99.55%,具有較好抗氧化性。目前對于牛骨源膠原蛋白肽的抗氧化活性研究較少,膠原蛋白肽的抗氧化活性研究較多的來自魚源[92-93],在后續(xù)研究中可以深度研究牛骨源膠原蛋白肽抗氧化機(jī)制,以期研發(fā)出優(yōu)質(zhì)牛骨膠原蛋白肽產(chǎn)品。

3.6 免疫活性

食源性生物活性肽提高人體免疫力的功能受到了廣泛關(guān)注,膠原蛋白肽降低免疫導(dǎo)致的慢性病風(fēng)險(xiǎn)、激發(fā)機(jī)體自然免疫的潛力已引起學(xué)術(shù)界和工業(yè)界研究者的極大興趣[94]。Gao等[95]用木瓜蛋白酶水解得到牛骨膠原蛋白肽,發(fā)現(xiàn)口服牛骨膠原蛋白肽可調(diào)節(jié)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制BALB/c小鼠的先天性(NK細(xì)胞活力和細(xì)胞因子濃度)和適應(yīng)性(脾淋巴細(xì)胞增殖和免疫球蛋白濃度)免疫功能,低劑量的牛骨膠原蛋白肽攝入減少了內(nèi)部器官的收縮并增加了白細(xì)胞的濃度;表明膠原蛋白肽是通過增加先天免疫力和適應(yīng)性免疫力來預(yù)防或改善免疫抑制作用,突顯了其作為預(yù)防機(jī)體免疫功能低下的功能性食品的潛在應(yīng)用。

4 結(jié)語與展望

用牛骨來制備膠原蛋白肽是提高牛骨利用率的有效方法。盡管膠原蛋白肽具有多種重生物活性備受關(guān)注,但其在市場化過程中也遇到了一些挑戰(zhàn),例如膠原蛋白的高效提取、儲存過程中的穩(wěn)定性以及臨床實(shí)驗(yàn)不足等。由于牛骨物料的特殊性(膠原蛋白含量豐富的同時(shí)礦物質(zhì)較多,物料堅(jiān)硬),選擇綠色、高效、安全的提取工藝是制備高品質(zhì)肽產(chǎn)品的關(guān)鍵;同時(shí),在食品儲存過程中保持膠原蛋白肽的穩(wěn)定性對于其生理活性至關(guān)重要[96-98]。另一方面,目前已有較多體外細(xì)胞模型及動物模型研究了膠原蛋白肽的生理活性,以及部分營養(yǎng)干預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在攝入膠原蛋白肽的人群血漿或組織中可以檢出膠原蛋白特異性氨基酸羥脯氨酸[99-101];但牛骨源膠原蛋白肽的安全性、生物利用率、及體內(nèi)功效仍有待進(jìn)一步研究。通過加深這些方面的研究,將有助于牛骨高值化利用和膠原蛋白肽的產(chǎn)業(yè)化升級。