羅泰端,林珮璇,張宏婧,陳繼承

(福建農(nóng)林大學食品科學學院,福建福州 350002)

美拉德反應(yīng)又稱為羰氨反應(yīng),指的是含游離氨基的化合物和還原糖或羰基化合物在常溫或加熱時發(fā)生的聚合、縮合等反應(yīng),經(jīng)過復雜的過程,最終生成棕色甚至是棕黑色的大分子物質(zhì)類黑精、還原酮、醛和雜環(huán)化合物,這些物質(zhì)是食品色澤和風味的主要來源[1]。羰氨反應(yīng)是現(xiàn)代食品工業(yè)不可或缺的一部分。吡嗪類化合物是羰氨反應(yīng)的生成物之一,也是重要的風味成分,廣泛存在于天然食品及食品加工過程中。

烷基吡嗪(Alkylpyrazine,APZ)是一種以吡嗪為基礎(chǔ)的具有不同取代方式的化合物,具有非常低的氣味閾值[2],有助于食物形成特殊的風味[3]。不同的APZ具有不同的香氣特征[4],在食品中具有重要的感官特性。同時,藥理學研究表明吡嗪類化合物還具有預(yù)防急性酒精性肝損傷、降血壓、降血脂等功效[5-7]。目前所報道的許多吡嗪類化合物反應(yīng)模型都是在美拉德反應(yīng)體系中建立的,如肽類組分美拉德反應(yīng)體系中吡嗪類化合物的生成,葡萄糖-肌酸酐-氨基酸的美拉德反應(yīng)中可生成十幾種吡嗪產(chǎn)物[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)不同的反應(yīng)底物、溫度等均會影響APZ的形成[11]。

α-羥基羰基化合物(α-hydroxy carbonyl compound,α-HCC)是APZ形成的關(guān)鍵前體物之一,可與銨鹽通過羰氨反應(yīng)經(jīng)strecker降解和Amadori重排產(chǎn)生APZ。α-HCC的主要物質(zhì)有三個:3-羥基丁酮(乙偶姻)、二羥基丙酮和羥基乙醛。其中關(guān)于乙偶姻的研究已有諸多報道,多用于TMP的生成[12-13]。二羥丙酮是最簡單的酮糖,重要的糖代謝中間產(chǎn)物、醫(yī)藥中間體和功能性添加劑[14],可作為抗病毒試劑,也可作用于食物的保鮮[15]。Adams等[16]研究發(fā)現(xiàn),二羥丙酮和2-氧丙醛為底物反應(yīng)可生成豐富的吡嗪類產(chǎn)物。目前關(guān)于美拉德反應(yīng)體系中生成APZ的研究很多,但多集中于單一吡嗪產(chǎn)物。α-HCC的三個主要物質(zhì)中只有乙偶姻的相關(guān)研究較為完善,另兩個物質(zhì)的研究報道則較少。因此本文以二羥丙酮與銨鹽為底物,探究在α-HCC與銨鹽的反應(yīng)體系中,吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、TMP、2-乙基吡嗪、2-乙基-3-甲基吡嗪、2-乙基-5(6)-甲基吡嗪10種烷基吡嗪的生成規(guī)律及影響因素。本文進一步豐富了在羰氨反應(yīng)體系中對新的APZ生成模型的研究,顯示了二羥丙酮與銨鹽反應(yīng)生成的吡嗪產(chǎn)物的多樣性,且該模型耗時短,操作簡單,對溫度的要求低,為APZ的生成提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2-乙基-3-甲基吡嗪、2-乙基-5(6)-甲基吡嗪,二羥丙酮 均購自上海源葉生物科技有限公司;乙酸銨、氯化銨、硫酸銨、過硫酸銨、檸檬酸氫二銨均 分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司;乙腈、甲醇 色譜純,購自德國默克公司。

高效液相色譜儀 Waters C18色譜柱(4.6×250 mm,5 μm),美國Waters公司;HWS-24型電熱恒溫水浴鍋 吉林省胡瑪環(huán)保涂料有限公司;pH計 瑞士METTLER TOLEDO有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 銨鹽種類對烷基吡嗪的影響 分別將0.77 g乙酸銨、0.53 g氯化銨、1.32 g硫酸銨、2.28 g過硫酸銨、2.26 g檸檬酸氫二銨、0.90 g二羥丙酮溶于10 mL去離子水中,分別吸取銨鹽溶液與二羥丙酮溶液0.75 mL混合置于帶塞試管中,在25 ℃水浴中反應(yīng)1.5 h,用0.22 μm孔徑的濾頭過濾,檢測APZ含量。

1.2.2 反應(yīng)時間對烷基吡嗪的影響

1.2.2.1 不同反應(yīng)時間的影響 分別將0.53 g氯化銨、0.90 g二羥丙酮溶于10 mL去離子水中,分別吸取銨鹽溶液與二羥丙酮溶液0.75 mL于25 ℃室溫下混合,用0.22 μm孔徑的濾頭過濾,檢測24 h內(nèi)(含24 h)APZ含量,每3 h進樣一次。

1.2.2.2 反應(yīng)動力學的建立 零級反應(yīng)是指反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度的零次方成正比(即與反應(yīng)物濃度無關(guān))的化學反應(yīng)。即反應(yīng)級數(shù)為零的化學反應(yīng)。

零級反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物與反應(yīng)時間滿足:[A]t=[A]0-K0t線性關(guān)系

式中,[A]t:反應(yīng)時間為t時的反應(yīng)產(chǎn)物;[A]0:反應(yīng)時間為0時的反應(yīng)產(chǎn)物;-K0:斜率;t:反應(yīng)時間。

1.2.3 反應(yīng)溫度對烷基吡嗪的影響 分別將0.53 g氯化銨、0.90 g二羥丙酮溶于10 mL去離子水中,分別吸取銨鹽溶液與二羥丙酮溶液0.75 mL混合置于帶塞試管中,置于溫度為25、35、45、55、65、75、85、95 ℃的水浴中反應(yīng)1.5 h,用0.22 μm孔徑的濾頭過濾,檢測APZ含量。

1.2.4 反應(yīng)底物濃度與比例對烷基吡嗪的影響 二羥丙酮與氯化銨的濃度比為1∶1,分別配制濃度為0.5、1.3、2.1、2.9、3.3、4.1、4.5、5.3 mol/L的二羥丙酮氯化銨反應(yīng)溶液,在95 ℃水浴中反應(yīng)1.5 h,用0.22 μm孔徑的濾頭過濾,檢測烷基吡嗪含量。固定二羥丙酮濃度為3.7 mol/L,按0.25∶1、0.5∶1、0.75∶1、1∶1、1.25∶1、1.5∶7、1.75∶1、2∶1比例配制氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)溶液。在95 ℃水浴中反應(yīng)1.5 h,用0.22 μm孔徑的濾頭過濾,檢測APZ含量。

1.2.5 反應(yīng)pH對烷基吡嗪的影響 用0.1 mol/L鹽酸溶液與0.1 mol/L氫氧化鈉溶液分別配制pH為3、4、5、6、7、8、9的去離子水溶液10 mL,取0.50 g二羥丙酮溶于1.5 mL不同pH水溶液中,再分別加入0.29 g氯化銨,在95 ℃水浴中反應(yīng)1.5 h,用0.22 μm孔徑的濾頭過濾,檢測APZ含量。

1.2.6 烷基吡嗪含量的測定 參考陳繼承等[17]的方法,略有改進。色譜條件:Waters C18色譜柱(4.6×250 mm,5 μm),進樣體積10 μL,流動相A:乙腈,流動相B:含1%甲酸、1%三氟乙酸(V/V)的水溶液,檢測波長278 nm,柱溫40 ℃,進行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

表2 不同銨鹽與二羥丙酮反應(yīng)生成的APZ種類及含量(占吡嗪總量百分比)Table 2 The types and content of APZ produced by different ammonium salts in reactionwith dihydroxyacetone(accounted for the percentage of total pyrazine)

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用Excel 2016和SPSS軟件(SPSS 25.0 for windows,SPSS Inc,Chicago,IL,USA),采用單因素方差分析(ANOVA)進行“Tukey”差異分析。P<0.05具有統(tǒng)計學意義,所有結(jié)果均表示為平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

為了便于結(jié)果的討論,現(xiàn)將文中檢測的10種烷基吡嗪進行大致的歸類。吡嗪環(huán)(Pyr):吡嗪;一甲基吡嗪(MP):2-甲基吡嗪;二甲基吡嗪(DMP):2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪;三甲基吡嗪(TriMP):2,3,5-三甲基吡嗪;四甲基吡嗪(TMP):2,3,5,6-四甲基吡嗪;乙基吡嗪(EP):2-乙基吡嗪;乙基-甲基吡嗪(EP-MP):2-乙基-3-甲基吡嗪、2-乙基-5(6)甲基吡嗪。

2.1 銨鹽對烷基吡嗪的影響

經(jīng)檢測,五種銨鹽底物與二羥丙酮反應(yīng)皆生成了相應(yīng)種類的APZ。由表2可以看出,在五種銨鹽底物中,與二羥丙酮反應(yīng)生成APZ含量由高到低的排序是氯化銨>硫酸銨>檸檬酸氫二銨>乙酸銨>過硫酸銨,氯化銨所對應(yīng)的APZ總含量最高,達到(4.59±0.11) mg/L。氯化銨、檸檬酸氫二銨的反應(yīng)中產(chǎn)生了10種烷基吡嗪,乙酸銨和硫酸銨則包含了8種,過硫酸銨最少,為6種。相比陳詩佳等[18]和趙洪源等[19]通過培育高產(chǎn)乙偶姻菌株以生成四甲基吡嗪的方法,本研究中二羥丙酮與銨鹽的反應(yīng)生成APZ顯示了更多可能性,且操作更加簡單,耗時短。乙酸銨、氯化銨、硫酸銨、過硫酸銨這四種銨鹽的吡嗪產(chǎn)物中,無支鏈的吡嗪環(huán)均是占比最高的,尤其是過硫酸銨,比例高達78.04%。

2.2 反應(yīng)時間對烷基吡嗪的影響

由表3可知,在氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)體系中,在反應(yīng)的初級階段即0～3 h內(nèi),反應(yīng)速率上升較快,APZ生成量快速上升;在3～15 h內(nèi),APZ生成量持續(xù)增大,但增速減緩,在第15 h達到最高,為(6314.53±75.70) μg/L;在15～24 h,隨反應(yīng)時間的延長,APZ生成量呈上下波動的狀態(tài)。在化學反應(yīng)前期,反應(yīng)速率較快,10種APZ生成量都隨著反應(yīng)時間的增大而增大;在反應(yīng)的中后期,由于達到化學平衡以及反應(yīng)底物濃度的降低和逆反應(yīng)的發(fā)生[20]。10種APZ中MP、DMP的含量隨著時間延長而下降;Pyr、EP含量則是增長到最高值后,有所下降并逐漸平穩(wěn)。由圖1可知,TriMP和TMP的生成量與時間基本呈線性關(guān)系,時間動力學擬合方程均為Y=aX+b形式,遵循零級反應(yīng),反應(yīng)速率與反應(yīng)濃度無關(guān),生成量始終隨著反應(yīng)時間的增加而增加。TriMP的時間動力學擬合方程為Y=8.7896X+174.33,斜率為8.7896;TMP的時間動力學擬合方程為Y=4.0722X+1192.6,斜率為4.0722,且判定系數(shù)(coefficient of determination,R2)均在0.85以上,說明該方程擬合程度較好,在Huang等[21-22]的文章中,證實了在氨基酸-葡萄糖體系中,TriMP與TMP的生成遵循零級反應(yīng),此結(jié)果與文中相符。

圖1 氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)24 hTriMP、TMP生成量的時間動力學Fig.1 Time kinetics of production of TriMP and TMP in 24 hreaction between ammonium chloride and dihydroxyacetone 注:TriMP:2,3,5-三甲基吡嗪;TMP:四甲基吡嗪。

表3 不同反應(yīng)時間下氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)生成烷基吡嗪含量的變化Table 3 The content of alkyl pyrazine was changed by the reaction ofammonium chloride and dihydroxyacetone at different reaction times

表4 在不同溫度下氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)生成烷基吡嗪含量的變化Table 4 The content of alkyl pyrazine was changed by reaction of ammonium chloride and dihydroxyacetone at different temperature

2.3 反應(yīng)溫度對烷基吡嗪的影響

由表4可知,APZ生成量隨反應(yīng)溫度的升高而升高,APZ生成量在95 ℃處最高,為(3.41×104±148.20) mg/L,與85 ℃時為(1.52×104±145.60) mg/L存在差異性顯著(P<0.05),說明當溫度到達一定數(shù)值時,氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)APZ生成量能夠顯著升高。從10種APZ含量隨反應(yīng)溫度變化的顯著性分析可以看出,相較于另八種APZ,TriMP與TMP在更低的溫度即出現(xiàn)顯著性差異,分別是55與65 ℃。唐樂攀等[23]研究結(jié)果表明:在抗壞血酸-半胱氨酸體系美拉德反應(yīng)中,生成的吡嗪大部分是甲基吡嗪,在反應(yīng)溫度升高時甲基吡嗪含量隨之提升;以糖、氨和氨基酸為底物,探究了反應(yīng)溫度對APZ生成的影響[24],結(jié)果顯示APZ的收率隨著溫度的升高而升高。本文結(jié)果與此相符,且以二羥丙酮與銨鹽作為底物反應(yīng)生成烷基吡嗪,對溫度的要求更低,且生成的APZ的種類更加豐富。

表5 在不同濃度下氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)生成烷基吡嗪含量的變化Table5 The content of alkyl pyrazines was changed by reaction of ammonium chloride and dihydroxyacetone at different concentrations

2.4 反應(yīng)濃度及比例對烷基吡嗪的影響

由表5可知,隨著反應(yīng)底物濃度的升高,除了EP與E-5(6)-MP含量是呈上升趨勢外,其余8種APZ的含量均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。其中,包括Pyr、MP、TriMP、TMP以及2,3-DMP含量均是在反應(yīng)底物濃度3.7 mol/L時最高,2,5-DMP、2,6-DMP與E-3-MP的含量則是在反應(yīng)底物濃度為4.5 mol/L時最高。APZ生成量在反應(yīng)底物濃度為3.7 mol/L時最高,為(6375.56±139.17) mg/L。并且,在底物濃度2.1～3.7 mol/L之間,APZ的生成量呈現(xiàn)顯著上升,并具有顯著差異(P<0.05),最高值比2.1 mol/L處含量增加了339.29%,底物濃度為5.3 mol/L時,與最高值相比APZ生成量下降了30.22%。反應(yīng)底物濃度對APZ的生成起促進作用,之后含量下降猜測也許是因為底物濃度增加水分活度下降不利于反應(yīng)進行的原因[25]。

反應(yīng)底物比例對反應(yīng)生成APZ含量的影響見表6。除了E-5(6)-MP含量,其他APZ含量的趨勢均是先上升后下降。Pyr、TriMP、TMP、2,3-DMP、EP均是在氯化銨與二羥丙酮濃度比例為1∶1時最高;MP在比例為0.75∶1時含量最高;2,6-DMP在比例為1.25∶1時含量最高;2,5-DMP、E-3-MP在比例為1.5∶1時含量最高?？傮wAPZ生成量在底物比例為1∶1時最高?？梢钥闯雎然@與二羥丙酮反應(yīng),二羥丙酮作為碳源,主要是氯化銨轉(zhuǎn)化二羥丙酮生成APZ,當氯化銨比例過低時或過高時,均不利于APZ的生成,由于二羥丙酮的濃度固定為3.7 mol/L,所以當氯化銨比例過高時,APZ生成量降低還有部分原因是因為水分活度下降導致溶解度降低不利于反應(yīng)的進行。

表6 在不同濃度比例下氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)生成烷基吡嗪含量的變化Table 6 The content of alkyl pyrazines was changed by reaction ofammonium chloride and dihydroxyacetone at different Concentration ratio

表7 在不同pH下氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)生成烷基吡嗪含量的變化Table 7 The content of alkyl pyrazines was changed by reaction of ammonium chloride and dihydroxyacetone at different pH

2.5 不同pH對烷基吡嗪的影響

在二羥丙酮-銨鹽體系中,APZ生成量在pH為3時最高,為(5921.33±136.55) mg/L,最低點在pH為9時,為(5417.36±125.95) mg/L,由表7可以看出,pH對10種APZ的影響各不相同,Pyr生成量隨著反應(yīng)pH的增大而減小,其余APZ的生成量皆是隨著pH的增大之后上下浮動。其中Pyr、DMP含量的最高點是在pH為3時;E-3-MP含量的最高點在pH為4時;MP、TriMP的最高點在pH為9時;TMP、EP、E-5(6)-MP含量的最高點在pH為8時?？梢钥闯鲈谄嵝缘沫h(huán)境下能促進Pyr、DMP、E-3-MP的生成;在偏堿性的環(huán)境下能促進MP、TriMP、TMP、EP、E-5(6)-MP的生成。從表7可以看出隨著pH的變化,TriMP、TMP、E-3-MP含量有變化,但是都沒有顯著性差異(P<0.05),說明pH的變化對這三種APZ無顯著影響。在不同的反應(yīng)體系中pH對吡嗪生成的影響各不相同,余自琳等[26]關(guān)于墨魚酶解物的美拉德反應(yīng)研究中,反應(yīng)pH范圍在5～10時,TriMP、2,5-DMP、MP含量隨著pH增大而升高。而在 Huang等[22]的研究中,pH對TMP形成的影響則與本文相反?？梢姺磻?yīng)模型體系的不同,反應(yīng)條件對所生成吡嗪的影響可能呈相反的效果。

3 結(jié)論

在二羥丙酮-銨鹽體系中,氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)生成的APZ種類與含量最高。在24 h內(nèi)的反應(yīng)時間下,APZ生成量在第15 h時最高,為(6314.53±75.70) mg/L,隨著反應(yīng)時間的延長先上升后下降,其中TriMP與TMP的反應(yīng)動力學遵循零級反應(yīng)。溫度對APZ的生成起促進作用,APZ的生成量隨著溫度的升高而升高。氯化銨與二羥丙酮反應(yīng)的最佳濃度為3.7 mol/L,APZ生成量隨著反應(yīng)濃度的升高先上升后下降;反應(yīng)最佳比例為1∶1,在固定二羥丙酮濃度的情況下,隨著氯化銨濃度比例的升高APZ生成量呈現(xiàn)先升后降的趨勢;在pH為3時,二羥丙酮與氯化銨反應(yīng)APZ生成量最高,為(5921.33±136.55) mg/L,隨著pH的增大,APZ生成量下降并上下浮動。由于加熱方法采用水浴,本文只探討了在100 ℃以下的烷基吡嗪生成規(guī)律,在后期的研究中,將更換加熱方法,進行100 ℃以上的研究。本文采用銨鹽與二羥丙酮為底物,展示了此模型體系中APZ產(chǎn)物的豐富性,且對于不同的APZ,反應(yīng)條件的影響也不盡相同,其中的機理還有待進一步的研究。