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(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150090;2.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司研發(fā)中心,內(nèi)蒙古呼和浩特 011500)

嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophiles)是全球公認(rèn)安全的食品級微生物,被歐洲食品安全局(European food safety authority,EFSA)認(rèn)定具有安全資格(Qualified presumption of safety,QPS)[1-2]。嗜熱鏈球菌是最常見的酸奶發(fā)酵劑之一,它在酸奶發(fā)酵前期產(chǎn)酸、產(chǎn)多糖等方面都發(fā)揮著重要的作用,在乳制品生產(chǎn)中,常與保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)混合發(fā)酵生產(chǎn)以提高發(fā)酵乳品的風(fēng)味及乳品品質(zhì)[3-6],被認(rèn)為是僅次于乳酸乳球菌第二重要的工業(yè)化乳酸菌[7]。

嗜熱鏈球菌優(yōu)良的發(fā)酵性能使其作為發(fā)酵劑已經(jīng)在乳制品行業(yè)中得到廣泛的推廣和應(yīng)用。但研究資料顯示,某些嗜熱鏈球菌也表現(xiàn)出一定的益生特性,對宿主有著極為重要的生理功能[8],其產(chǎn)生的胞外多糖具有降膽固醇、改善人體腸道菌群平衡、提高機(jī)體免疫力以及抗腫瘤等益生特性[9-11]。

本研究所采用的嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002,是一株分離自甘南地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中高產(chǎn)胞外多糖的菌株,該菌生長速度快,發(fā)酵風(fēng)味突出,后酸化弱,且具有良好的貯藏穩(wěn)定性[12],是一株具有優(yōu)良發(fā)酵性能的菌株。本文以模擬胃液和膽鹽中菌株耐受性能、膽固醇降解能力和安全性(抗生素、急性經(jīng)口毒性)對MN-ZLW-002進(jìn)行分析,旨在深入挖掘菌株MN-ZLW-002的益生特性和安全性,為開發(fā)益生菌發(fā)酵食品級功能原料提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌種:MN-ZLW-001、MN-ZLW-002、MN-ZLW-005Streptococcusthermophiles,哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)工程學(xué)院;MN-ZLW-003Lactobacillusdelbrueckiisubsp.Bulgaricus哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)工程學(xué)院;BB12Bifidobacteriumanimalissubsp.Lactis,科漢森(北京)貿(mào)易有限公司;實(shí)驗(yàn)動物:清潔級昆明種小鼠20只,體重19～20 g 華阜康生物科技股份有限公司,動物合格證號:SCXK(京)2009-0007;飼料 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心;膽固醇、膽鹽、胃蛋白酶、氯霉素、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、萬古霉素、卡那霉素、青霉素、紅霉素、克林霉素 分析純,Sigma公司(美國);MRS液體培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋;滅菌生理鹽水、抗生素 生工生物工程(上海)股份有限公司。

2000237電熱恒溫培養(yǎng)箱 西班牙J.P.SELECTA公司;G560E漩渦混合器 美國SCIENTIFIC Instruments公司;PB-10 pH計 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;CP21GⅡ高速冷凍離心機(jī) 日立公司;ML51生物顯微鏡 日本Olympus公司;SVE-6A1超凈工作臺 新加坡ESCO公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的活化 將供試菌株的甘油菌液以2%接菌量接入5 mL滅菌MRS液體培養(yǎng)基中(115 ℃,15 min),與厭氧條件下培養(yǎng)18 h進(jìn)行活化,按此方法繼續(xù)活化2代,取活化第3代的菌株進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 菌株活菌計數(shù) 將活化好的菌液進(jìn)行100倍稀釋,用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行菌株的計數(shù),根據(jù)計數(shù)結(jié)果,調(diào)整供試菌株接菌濃度為1×108CFU/mL。

1.2.3 菌株人工胃液耐受性及膽鹽耐受性試驗(yàn) 將活化的菌株接入5 mL pH2.0、pH3.0人工胃液及膽鹽MRS培養(yǎng)基中(接菌濃度為1×108CFU/mL),將接菌的培養(yǎng)基于37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)4 h,分別于培養(yǎng)0 及4 h取樣,進(jìn)行倍比稀釋,選擇適當(dāng)?shù)南♂屘荻冗M(jìn)行活菌計數(shù),并計算4 h存活率。

其中,pH2.0人工胃液:NaCl 0.2%,胃蛋白酶0.35%,蒸餾水溶解后,用1 mol/L HCl調(diào)整pH至2.0,過濾除菌;pH3.0人工胃液:NaCl 0.2%,胃蛋白酶0.35%,蒸餾水溶解后,用1 mol/L HCl調(diào)整pH至3.0,過濾除菌;膽鹽MRS培養(yǎng)基:于MRS液體培養(yǎng)基中加入膽鹽,使終濃度為0.3%,115 ℃滅菌15 min。

1.2.4 菌株膽固醇降解能力試驗(yàn) 采用鄰苯二甲醛法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析[13]。

參照文獻(xiàn)[13-14]的方法測定膽固醇含量。略作改動,具體操作如下:MN-ZLW-002以2%接種量接入液體MRS-膽固醇培養(yǎng)基(于MRS液體培養(yǎng)基中加入膽鹽及10 g/L膽固醇溶液,使膽鹽終濃度為0.3%,膽固醇終濃度為100 μg/mL,115 ℃滅菌15 min),在37 ℃條件下,厭氧培養(yǎng)18 h,以不接菌的MRS-膽固醇培養(yǎng)基作為對照樣。4 ℃條件下,12000×g,離心10 min,取上清液用于檢測降膽固醇能力。用手動移液器分別吸取1 mL上清液,加入18 mm×180 mm的干凈試管。加入2 mL 95%乙醇,用快速混勻器調(diào)至6檔漩渦混勻20 s。再加入2 mL 50% KOH溶液,用快速混勻器調(diào)至6檔漩渦混勻20 s。塞上試管塞后,60 ℃條件下水浴15 min。冷卻后,加入5 mL正己烷,用快速混勻器調(diào)至6檔漩渦混勻20 s。再加入3 mL蒸餾水,用快速混勻器調(diào)至6檔漩渦混勻20 s。塞上試管塞后,室溫下,放置15 min,使兩相充分分層。用手動移液器吸取1 mL正己烷層溶液,加入15 mm×100 mm的干凈試管,60℃條件下烘干。加入2 mL鄰苯二甲醛溶液,用快速混勻器調(diào)至6檔漩渦混勻20 s,塞上試管塞后,室溫下放置10 min。而后用1 mL移液管吸取1 mL濃硫酸,沿試管內(nèi)壁小心加入其中,立即用快速混勻器調(diào)至6檔漩渦混勻20 s,塞上試管塞后,室溫下放置10 min。以NCFM為參照菌株,相同條件下測定梯度濃度含量的膽固醇溶液的吸光值,繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線計算膽固醇的含量。以未接菌的培養(yǎng)基作為空白對照,菌株的膽固醇降解率計算公式為:

膽固醇降解率(%)=(C-A)/C×100

式中:A為發(fā)酵上清液的膽固醇含量/μg;C為空白對照的膽固醇含量/μg。

1.2.5 菌株MN-ZLW-002的安全性實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 抗藥性的檢測 采用液體最小抑制濃度(MIC)法對菌株MN-ZLW-002的抗藥性進(jìn)行檢測。將過夜活化的菌株稀釋后接種到含有不同濃度抗生素的ISL-lactose[15]培養(yǎng)基中,使培養(yǎng)基中菌株的終濃度為105CFU/mL,然后將其置于37 ℃培養(yǎng)48 h,觀察菌株的生長情況。最小抑制濃度定義為能抑制菌株生長的最低抗生素濃度。

1.2.5.2 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) a.受試物配制方法:稱取15 g MN-ZLW-002菌株受試物,加去離子水至40 mL,混勻使用。b.急性經(jīng)口毒性試驗(yàn):按“一次最大限度試驗(yàn)”要求,選健康成年小鼠20只,體重19～22 g,雌、雄各半,劑量設(shè)計雌性為15 g/kg BW,雄性為15 g/kg BW,按0.2 mL/10 g BW×2次/24 h經(jīng)口灌胃給予受試物。灌胃前動物隔夜禁食,自由飲水。灌胃后連續(xù)觀察4 h,給予正常飲食。以后每天觀察至第14 d,記錄中毒體征及死亡情況,并計算半數(shù)致死量LD50。

logLD50=∑1/2(Xi+Xi+1)·(Pi+1-Pi)

式中:Xi與Xi+1及Pi+1及Pi分別為相鄰兩組的劑量對數(shù)以及動物死亡百分比。

c.結(jié)果判定:按食品安全毒理學(xué)評價程序和方法(GB 15193-2003)中“急性毒性(LD50)劑量分級表”進(jìn)行判定:LD50>15000 mg/kg可判定無毒,5001 mg/kg

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究中各試驗(yàn)均重復(fù)3次,采用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和各曲線的繪制;數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析,結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株對模擬胃液和膽鹽的耐受性

將菌株接種到不同pH的人工胃液中培養(yǎng),測定其對酸度的耐受性,結(jié)果如圖1所示。

圖1 在pH2.0人工胃液中的存活率Fig.1 Survival rate in artificial gastric juice at pH2.0注:不同小寫字母表示差異顯著,P<0.05;圖2、圖3,圖5同。

由圖1可見,在pH2.0人工胃液培養(yǎng)4 h后,MN-ZLW-002的存活率為79.68%±6.04%,顯著高于MN-ZLW-001、MN-ZLW-003及MN-ZLW-005(P<0.05)。分析可能與MN-ZLW-002高產(chǎn)胞外多糖有關(guān),MN-ZLW-002在生長代謝過程中產(chǎn)生的大量胞外多糖依附于菌體細(xì)胞壁形成莢膜,莢膜多糖的凝膠、乳化及持水作用使菌體能夠能好地適應(yīng)酸性環(huán)境[15]。參考菌株BB12存活率為111.74%±8.93%,高于MN-ZLW-002,但差異不顯著(P>0.05)。

圖2 在pH3.0人工胃液中的存活率Fig.2 Survival rate in artificial gastric juice at pH3.0

在pH3.0人工胃液培養(yǎng)4 h后,MN-ZLW-002的存活率最高,為120.24%±6.88%,顯著高于MN-ZLW-001、MN-ZLW-003及MN-ZLW-005(P<0.05),略高于BB12(存活率為106.09%±4.23%)。

由圖3可見,0.3%膽鹽MRS培養(yǎng)4 h后,MN-ZLW-002存活率較低,為5.47%±0.70%,顯著低于其它株菌(P<0.05)。

圖3 菌株在0.3%膽鹽中的存活率Fig.3 Survival rate of tested strains in 0.3% bile salt

耐受性試驗(yàn)結(jié)果顯示,嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002對pH2.0及pH3.0環(huán)境耐受性較好,但對0.3%膽鹽的耐受性較弱。

2.2 膽固醇降解效果測定

2.2.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以膽固醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度OD550 nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4),標(biāo)曲公式為y=2.0107x+0.1468,R2=0.9976,線性關(guān)系良好,可用于膽固醇降解能力的測定。

圖4 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of cholesterol

2.2.2 膽固醇降解能力測定 由圖5可見,動物雙歧桿菌BB12對膽固醇的降解率最高,為81.81%±3%,顯著高于其余4株自有菌株(P<0.05);自有菌株中,MN-ZLW-002對膽固醇的降解率最高,為42.66%±2.11%,但差異不顯著(P>0.05)。

圖5 菌株對膽固醇的降解率Fig.5 The degradation rate of cholesterol of tested strains

表1 MN-ZLW-002對抗生素的MIC檢測結(jié)果Table 1 MIC results of strain MN-ZLW-002

表2 MN-ZLW-002急性毒性觀察情況Table 2 The acute toxicity of MN-ZLW-002

2.3 MN-ZLW-002對抗生素的敏感性(MIC)

MN-ZLW-002具有高產(chǎn)胞外多糖的特性,同時體外益生功能評價試驗(yàn)結(jié)果顯示,四株自有菌株中,MN-ZLW-002具有更好的酸耐受性和膽固醇降解能力,具有作為益生菌開發(fā)的潛質(zhì)。因此,試驗(yàn)選擇MN-ZLW-002進(jìn)行下一步的安全性評價。

利用MIC方法檢測MN-ZLW-002對抗生素的敏感性,結(jié)果如表1所示。根據(jù)EFSA(European Food Safety Authority)的cut-off值可判斷,MN-ZLW-002對氯霉素、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、萬古霉素、卡那霉素、青霉素、紅霉素和克林霉素均敏感。

2.4 小鼠經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)

在14 d的觀察期內(nèi),實(shí)驗(yàn)動物生長正常,未見明顯中毒體征,無死亡,大體解剖未見異常，急性毒性觀察結(jié)果見表2。受試物MN-ZLW-002對小鼠急性經(jīng)口半數(shù)致死量為:雌性LD50大于15 g/kg BW,雄性LD50大于15 g/kg BW。根據(jù)食品安全毒理學(xué)評價程序和方法(GB 15193-2003)中急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)判定,MN-ZLW-002急性經(jīng)口毒性屬無毒。

3 結(jié)論與討論

MN-ZLW-002是從甘南藏族自治州傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中篩選獲得的一株高產(chǎn)胞外多糖的嗜熱鏈球菌,本文對該菌的體外益生功能及安全性能進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,MN-ZLW-002對pH2.0及pH3.0的人工胃液耐受性較好,與對照菌株BB12無顯著差異(P>0.05),但顯著強(qiáng)于其它三株自有菌株(P<0.05)。MN-ZLW-002對0.3%膽鹽耐受性較弱,馴化是提高菌株耐受性能有效的方法[16-20],后續(xù)會對MN-ZLW-002進(jìn)行馴化,以提高其膽鹽耐受力。

目前報道中,各菌株的體外膽固醇降解率各異。Dilmi-Bouras[21]報道的來源于酸奶的幾株嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌也具有降低培養(yǎng)基中總膽固醇的能力。劉麗莉等[22]報道了來源于發(fā)酵果蔬食品中的6 種乳酸菌的體外膽固醇降解率在18.5%～28%之間不等。林斌等[23]從自然發(fā)酵的酸乳中分離得到一株植物乳桿菌HLX37,在培養(yǎng)24 h后,其膽固醇降解率可達(dá)37.33%±2.55%。相比之下,MN-ZLW-002體外降膽固醇能力高于植物乳桿菌HLX37,但弱于BB12,后續(xù)將采用馴化、誘變等手段,以提高M(jìn)N-ZLW-002降解膽固醇能力。

綜上,MN-ZLW-002具有良好的模擬胃液耐受性、較強(qiáng)的膽固醇降解能力,且安全無毒,可作為功能型發(fā)酵食品原料進(jìn)行開發(fā),具有巨大的商業(yè)價值和市場應(yīng)用前景。