范小飄,高文文,李欣芮,趙 桉,趙鵬昊,尚佳萃,趙 樂,周 雪,孟祥晨

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,乳品科學(xué)教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱150038)

丙酸桿菌是無芽孢、革蘭氏陽性的兼性厭氧菌,主要存在于干酪、生牛奶及其他乳制品、青貯飼料、土壤中,最近有人在酒曲和窖泥中也分離到了丙酸桿菌[1]。丙酸桿菌作為益生菌的應(yīng)用極其廣泛,如食品發(fā)酵劑、抑制病原微生物、維持腸道菌群平衡、促進其他益生菌增殖、抗炎、提高機體免疫力等益生功能[2-4],因此,研究人員常將丙酸桿菌作為微生態(tài)制劑添加到食品、藥品、飼料等多種領(lǐng)域以發(fā)揮多種益生作用。傳統(tǒng)上,丙酸桿菌被用作瑞士干酪的發(fā)酵劑,特別是費氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii),在瑞士干酪成熟過程中,賦予干酪典型的大孔質(zhì)地和特征性的風(fēng)味[2],費式丙酸桿菌謝氏亞種(P.freudenreichiisubsp.shermanii)JS最初分離自瑞士干酪,幾十年來一直作為芬蘭Jarlsberg干酪的發(fā)酵劑使用,該菌株還與鼠李糖乳桿菌 LC705聯(lián)合用作保護性發(fā)酵劑,用于發(fā)酵食品的生物防腐[5]。除此之外,丙酸桿菌能通過促雙歧桿菌生長來調(diào)節(jié)腸道微生物菌群,并通過產(chǎn)生細菌素來保護機體免受病原微生物的侵染[6]。其與嗜酸乳桿菌、動物雙歧桿菌亞種組合,可用于生產(chǎn)益生菌飲料,感官評價表明上述微生物組合發(fā)酵可以生產(chǎn)風(fēng)味更好的飲料[7]。最新研究表明丙酸桿菌可粘附于腸上皮細胞具有調(diào)節(jié)腸粘膜的重要功能,并且其表面蛋白參與抗炎特性[4]。因此,丙酸桿菌是極具潛力，并對人們有利的益生菌。

丙酸桿菌的主要代謝產(chǎn)物為丙酸,又被稱作甲基乙酸,是一種重要的天然有機弱酸。美國食品藥品監(jiān)督管理局認為丙酸及其鈣、鈉和鉀鹽是一般公認安全(Generally recognized as safe,GRAS)的食品添加劑,廣泛應(yīng)用于抗微生物劑[8]、抗炎劑[9]、食品防腐劑[10]、除草劑[11]和人造香料[12]等。近年來,由于人們對天然食品和綠色添加劑需求的日益增加,通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)丙酸獲得更多關(guān)注。Wang等[13]篩選到的一株費氏丙酸桿菌,以葡萄糖為碳源時,丙酸生成量為0.39 g/g,葉文彬等[14]獲得的一株丙酸桿菌,丙酸初始生成量為1.2 g/L。由此可見,獲得高產(chǎn)丙酸的菌株對生產(chǎn)非常重要。因此,本實驗旨在分離篩選獲得高產(chǎn)丙酸的菌株,并分析其基本生物學(xué)性質(zhì),以期為后續(xù)高產(chǎn)丙酸菌株的育種以及生物防腐菌種的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮生牛乳 黑龍江省哈爾濱市農(nóng)戶家奶牛;金黃色葡萄球菌(S.aureus)ATCC25923 中國藥品生物制品檢定所;丙酸(色譜純) 西亞試劑;細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司;細菌微量生化反應(yīng)管 青島海博;藥敏紙片 上海源葉生物科技有限公司；引物合成 吉林庫美生物科技有限公司;其余試劑 均為分析純。

Opticlean-1300垂直流潔凈工作臺 力康精密科技(上海)有限公司;3K15離心機 美國Sigma公司;光學(xué)顯微鏡 上海光學(xué)儀器廠;Uvmini-1240紫外分光光度計 日本島津公司;HPX-87H色譜柱 美國Bio-Rad公司;Waters2695高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 分離純化培養(yǎng)基參考文獻[15]。

葡萄糖培養(yǎng)基:葡萄糖10 g,胰蛋白胨10 g,酵母浸粉10 g,加蒸餾水至1000 mL。固體培養(yǎng)基則添加1.8%～2.0%的瓊脂。調(diào)pH至6.9～7.0,121 ℃滅菌15 min。

甘油培養(yǎng)基:甘油10 g,胰蛋白胨10 g,酵母浸粉10 g,加蒸餾水至1000 mL。調(diào)pH至6.9～7.0,121 ℃滅菌15 min。

1.2.2 產(chǎn)丙酸菌的初篩 參照李燕波等[15]的方法,將新鮮生牛乳用磷酸鹽緩沖液(PBS)梯度稀釋并涂布于固體培養(yǎng)基上初步篩選產(chǎn)丙酸的菌株。

1.2.3 菌株的復(fù)篩 以總細菌數(shù)為1×108CFU/mL的接種量將初篩中獲得的菌株接種于葡萄糖液體培養(yǎng)基中,30 ℃厭氧培養(yǎng)120 h,取1.5 mL發(fā)酵液于EP管中,12000 r/min離心10 min,小心吸取上層發(fā)酵液,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后,采用高效液相色譜分析方法測定發(fā)酵液中丙酸含量。

1.2.4 高效液相色譜 高效液相色譜條件參照Liu等[16]的方法稍作修改:色譜柱:Biorad Aminex HPX-87H 300 mm×7.8 mm;檢測器:紫外檢測器(210 nm);流動相:5 mmol/L稀硫酸溶液;流動相流速:0.5 mL/min;柱溫:50 ℃;進樣量:10 μL。測定丙酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為20.5 min,質(zhì)量濃度(g/L)與峰面積的回歸方程為:y=559847x+29157(式中,x代表質(zhì)量濃度g/L,y代表峰面積),其決定系數(shù)R2=0.9998。

1.2.5 分離株菌種鑒定

1.2.5.1 形態(tài)學(xué)特征 將篩選得到的產(chǎn)丙酸含量最高的菌株B1以總細菌數(shù)為1×108CFU/mL的接種量接種于葡萄糖液體培養(yǎng)基中,于30 ℃厭氧培養(yǎng)60 h,連續(xù)活化兩代后,梯度稀釋涂布于固體培養(yǎng)基中,30 ℃厭氧培養(yǎng)5 d后觀察其菌落形態(tài),并在超凈工作臺中挑取單菌落進行革蘭氏染色后,置于光學(xué)顯微鏡下進行觀察。

1.2.5.2 生理生化及糖發(fā)酵實驗 參照《伯杰細菌鑒定手冊》,對分離株進行硝酸鹽還原試驗、過氧化氫酶試驗、明膠水解試驗、產(chǎn)氣、運動性試驗以及糖發(fā)酵試驗。

1.2.5.3 16S rDNA同源性分析 細菌基因組DNA的提取:按照天根細菌基因組DNA提取試劑盒說明書稍作修改進行基因組DNA的提取;16S rDNA基因片段擴增反應(yīng)的上下游引物、PCR擴增反應(yīng)總體系以及擴增條件參照張秋雪等[17]的方法。

PCR擴增完成后,進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,若擴增產(chǎn)物長度在1500 bp左右且無雜帶,則將其送至測序公司進行雙向測序。將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對后,使用MEGA 7軟件并采用Neighbor-Joining方法將Bootstrap設(shè)置為1000,對分離株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5.4 多位點序列分型(MLST) 本試驗選取了在丙酸桿菌菌株鑒定中常用的7個管家基因[18]:pf169、fumC、pf1637、recA、gtf、rpoB、adk,其上下游引物信息見表1。

表1 丙酸桿菌MLST擴增引物Table 1 The MLST primers for Propionibacterium

管家基因的PCR擴增體系與16S rDNA基因的擴增體系相同。其擴增反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,58/59/60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)40次;最后72 ℃末端延伸10 min。其中管家基因pf169退火溫度為59 ℃,管家基因gtf退火溫度為60 ℃,其余管家基因退火溫度都為58 ℃。將7個管家基因的測序結(jié)果順序拼接并進行Blast對比,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,進一步分析分離株間的親緣關(guān)系。

1.2.6 分離株B1在不同培養(yǎng)基中生長及丙酸生成量的測定

1.2.6.1 生長曲線 以總細菌數(shù)為1×108CFU/mL的接種量將活化后的菌株分別接種于葡萄糖液體培養(yǎng)基以及甘油液體培養(yǎng)基中,30 ℃厭氧培養(yǎng)120 h,每間隔12 h取1次發(fā)酵液,紫外分光光度計測其OD600、pH計測其pH,然后以時間為橫坐標(biāo),OD600、pH分別為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.2.6.2 丙酸生成量的測定 以總細菌數(shù)為1×108CFU/mL的接種量將活化后的菌株分別接種于葡萄糖液體培養(yǎng)基以及甘油液體培養(yǎng)基中,30 ℃厭氧培養(yǎng)120 h,每間隔12 h各取發(fā)酵液1.5 mL,將發(fā)酵液離心處理(12000 r/min 10 min),仔細吸取發(fā)酵上清液,經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾后置于棕色進樣瓶中,采用高效液相色譜(HLPC)方法測定丙酸含量。

1.2.6.3 葡萄糖殘留量的測定 以總細菌數(shù)為1×108CFU/mL的接種量將活化后的菌株接種于葡萄糖液體培養(yǎng)基中,30 ℃厭氧培養(yǎng)120 h,每間隔12 h取發(fā)酵液,參照彥繁鶴等[19]的試驗方法測葡萄糖殘留量。測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.8941x-0.0179(式中,x代表質(zhì)量濃度g/L,y代表吸光度值),其決定系數(shù)R2=0.9991。

1.2.6.4 甘油殘留量的測定 以總細菌數(shù)為1×108CFU/mL的接種量將活化后的菌株接種于甘油液體培養(yǎng)基中,30 ℃厭氧培養(yǎng)120 h,每間隔12 h取發(fā)酵液,參照張永生等[20]的試驗方法測定甘油殘留量。測定甘油標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0266x+0.0222(式中,x代表質(zhì)量濃度g/L,y代表吸光度值),其決定系數(shù)R2=0.9997。

1.2.7 分離株B1體外安全性評價

1.2.7.1 溶血性實驗 通過血平板培養(yǎng)法檢測Propionibacteriumfreudenreichiisubsp.shermanii是否具有溶血性。將連續(xù)活化兩代的分離株劃線于含質(zhì)量濃度為5%人血的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基,放置厭氧罐中于30 ℃連續(xù)培養(yǎng)6 d,觀察菌落周圍是否有透明的溶血圈出現(xiàn)(β溶血)或綠色暈圈出現(xiàn)(α溶血)或無反應(yīng)(γ溶血),以此判斷受試菌株是否具有溶血性,同時以金黃色葡萄球菌(S.aureusATCC23957)作為陽性對照菌株。

1.2.7.2 抗生素抗性實驗 本試驗采用藥敏紙片擴散法。將待測菌株以總細菌數(shù)為1×108CFU/mL的接種量接種于葡萄糖液體培養(yǎng)基中,30 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后,在超凈工作臺中吸取0.1 mL菌懸液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上,待培養(yǎng)基表面干燥后,分別鑷取含有不同抗生素的藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面(每個平板貼3張同一藥敏試紙并保持一定間距),30 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后,用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。依據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(NCCLS)的藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。不同抗生素的濃度及判定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criterion of drug susceptibility

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上所有試驗均進行3次重復(fù)。運用Origin 2018對試驗所得數(shù)據(jù)繪圖,運用SPSS 23進行差異性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

采用高效液相色譜方法檢測了54株分離菌株培養(yǎng)上清中的丙酸含量,部分結(jié)果見表3,大多數(shù)菌株的丙酸含量在1.8～3.2 g/L,只有一株菌(B1)的含量達到7.38 g/L,顯著高于其他分離株(P<0.05),使用該菌株作為后續(xù)試驗菌株。

圖2 基于16S rDNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA gene

表3 部分分離株培養(yǎng)上清中丙酸含量Table 3 Content of propionic acid in theculture supernatant of some isolates

2.2 分離株B1的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征 分離株在固體培養(yǎng)基中30 ℃厭氧培養(yǎng)6 d后,形成直徑1 mm左右、乳黃色菌落,微突起,不透明,邊緣整齊,表面濕潤光滑(圖1A)。菌體革蘭氏染色陽性,多為短桿狀,單在或成對存在,呈“v”字和“y”字形(圖1B)。

圖1 分離株B1菌落(A)及菌體(B)形態(tài)Fig.1 Colony(A)and cell morphology(B)of isolated strain B1

2.2.2 生理生化及糖發(fā)酵試驗 經(jīng)過生理生化及糖發(fā)酵試驗,結(jié)果比對《伯杰氏細菌鑒定手冊》,初步鑒定分離株為費氏丙酸桿菌(表4)。費氏丙酸桿菌有兩個亞種:費氏丙酸桿菌謝氏亞種(P.freudenreichiisubsp.shermanii)和費氏丙酸桿freudenreichiisubsp.freudenreichii),前者可以利用乳糖但不還原硝酸鹽,而后者不能利用乳糖但可以還原硝酸鹽[18],利用這一特性可以區(qū)分兩個亞種,據(jù)此分析,本實驗獲得的為P.freudenreichiisubsp.shermanii。

表4 分離株的生理生化和糖發(fā)酵試驗結(jié)果Table 4 Physiological biochemical and sugar fermentation identification results of isolated strains

2.2.3 16S rDNA序列同源性分析 以分離株B1的DNA為模板,采用通用引物進行PCR擴增,PCR擴增產(chǎn)物片段達1500 bp后送至測序公司進行測序,將測序結(jié)果進行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示分離株B1與費氏丙酸桿菌親緣關(guān)系最近,同源性為100%(圖2)。

2.2.4 多位點序列分型(MLST) 以分離株B1的DNA為模板,對7個管家基因(pf169、fumC、pf1637、recA、gtf、rpoB、adk)進行PCR擴增,獲得7個300～600 bp左右長度的擴增產(chǎn)物(圖3)。將7個管家基因序列依次串聯(lián)起來,得到的片段長度大約為3000 bp,經(jīng)Blast比對后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4),結(jié)果顯示:分離株B1與Propionibacteriumfreudenreichiisubsp.shermaniiPFREUDJS1的同源性達到100%,結(jié)果進一步表明:分離株B1為費氏丙酸桿菌謝氏亞種。

圖4 基于七個等位基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on seven alleles

圖3 等位基因擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis resultsof allele amplification prod注:M:D2000;1～7:管家基因1～7。

2.3 分離株B1的生長及丙酸生成量

2.3.1 B1在含葡萄糖培養(yǎng)基中生長及產(chǎn)酸情況 菌株B1在0～36 h為對數(shù)生長期,36 h后趨于穩(wěn)定期,到達穩(wěn)定期后,菌體量基本不變,其OD最終穩(wěn)定在2.4左右,當(dāng)培養(yǎng)時間在84 h左右時,pH最終穩(wěn)定在4.1左右(圖5A),而丙酸生成量此時達到7.0 g/L左右(圖5B)。培養(yǎng)120 h后，丙酸生成量達到7.38 g/L(圖5B)。

圖5 費氏丙酸桿菌B1在含葡萄糖培養(yǎng)基中的生長(A)和產(chǎn)丙酸(B)情況Fig.5 Growth(A)and propionic acid production(B)ofPropionibacterium freudenreichii B1 in glucose-containing medium

分析生長期間葡萄糖的消耗發(fā)現(xiàn),0～72 h葡萄糖消耗速度較快,在第72 h時,葡萄糖消耗了88%,其后的72～120 h葡萄糖消耗放緩,在發(fā)酵120 h結(jié)束時,消耗了98.5%的葡萄糖(圖6)。

圖6 丙酸桿菌B1葡萄糖殘留量Fig.6 Glucose residue of Propionibacterium B1

2.3.2 B1在含甘油培養(yǎng)基中生長及產(chǎn)酸情況 菌株B1在0～36 h為對數(shù)生長期,36 h后穩(wěn)定一段時間,在60 h后又有短暫的生長,72 h后到達穩(wěn)定期后,菌體量基本不變,其OD最終穩(wěn)定在1.5左右,最終pH在4.75左右(圖7A),丙酸生成量最終達到5.45 g/L左右(圖7B)。

圖7 費氏丙酸桿菌B1在含甘油培養(yǎng)基中的生長(A)和產(chǎn)丙酸(B)情況Fig.7 Growth(A)and propionic acid production(B)ofPropionibacterium freudenreichii B1 in glycero-containing medium

分析生長期間甘油的消耗得出(圖8),在0～36 h內(nèi),甘油被迅速消耗。其后甘油消耗緩慢,在發(fā)酵120 h后,甘油殘留量仍在5.9 g/L,僅消耗41%的甘油。說明分離株B1在同等時間及培養(yǎng)條件下利用甘油生長及生成丙酸的能力較弱。

圖8 丙酸桿菌B1甘油殘留量Fig.8 Glycerin residue of Propionibacterium freudenreichii B1

2.4 分離株B1安全性的體外評價

2.4.1 溶血性 陽性對照菌S.aureusATCC25923在血瓊脂平板上菌落較大,凸起,淡黃色不透明,菌落周圍出現(xiàn)明顯的透明溶血圈(圖9B);而費氏丙酸桿菌B1在血瓊脂平板上無反應(yīng)現(xiàn)象,菌落較小,表明該菌株不具有溶血性(圖9A)。

圖9 丙酸桿菌B1(A)和S. aureus ATCC25923(B)在血瓊脂平板上的生長Fig.9 Hemolytic test of Propionibacterium B1(A)and S. aureus ATCC25923(B)

2.4.2 抗生素敏感性 本試驗檢測了費氏丙酸桿菌B1對10種抗生素的敏感性,并將S.aureusATCC25923作為質(zhì)控菌株。結(jié)果表明:該菌對氨芐西林、四環(huán)素、萬古霉素、氯霉素、克林霉素敏感,對卡那霉素、慶大霉素等氨基糖苷類抗生素具有抗性,此外對頭孢呋辛、青霉素也具有抗性(表4),需要進一步評價其抗生素抗性機制及抗性轉(zhuǎn)移風(fēng)險。

表5 丙酸桿菌B1對抗生素的敏感性Table 5 Sensitivity of Propionibacterium B1 to antibiotics

3 討論

從新鮮生牛奶中通過選擇性培養(yǎng)基,分離得到一株產(chǎn)丙酸的費氏丙酸桿菌B1,除分析了其形態(tài)特征、生理生化和糖發(fā)酵特性之外,還采用MLST方法分析了這株菌的系統(tǒng)發(fā)育特點?；贛LST方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹與16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹相比,可以更精確地反映出物種及物種間的進化關(guān)系[21]。Delmasso等[18]將113種不同起源的費氏丙酸桿菌亞種通過MLST分型分為46種序列類型(ST),說明費氏丙酸桿菌的分子多樣性和種群結(jié)構(gòu)。Mekadim等[21]針對11株丙酸桿菌,比較了16S rRNA同源性分析和選取3個管家基因進行的MLST分析,分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)三種基因的可變區(qū)具有更高的分辨力。本實驗選取了7個管家基因,分辨效果更好。

碳源種類顯著影響丙酸桿菌的丙酸生成量,Wang等[13]篩選到的一株費氏丙酸桿菌,以葡萄糖為碳源時,丙酸生成量為0.39 g/g,葉文彬[14]獲得的一株酸性丙酸桿菌,在以葡萄糖為碳源時,丙酸初始生成量為1.2 g/L。本試驗獲得的費氏丙酸桿菌,同樣以葡萄糖為碳源時,丙酸產(chǎn)量最高達到7.59 mg/mL,顯著高于現(xiàn)有文獻報道。丙酸桿菌代謝產(chǎn)物中主要抑菌物質(zhì)即為丙酸,鄭麗雪等[22]研究發(fā)現(xiàn)費氏丙酸桿菌在乳酸鈉培養(yǎng)基發(fā)酵時,該菌株代謝產(chǎn)物的抑菌活性結(jié)果要優(yōu)于山梨酸鉀的抑菌活性。因而篩選一株高產(chǎn)丙酸的菌株十分重要。

理論上,培養(yǎng)基中葡萄糖和甘油在重量相同時,甘油發(fā)酵可生成更多的丙酸,通常,1 mol甘油通過EMP途徑產(chǎn)生1 mol丙酸而不產(chǎn)生乙酸,理論上丙酸產(chǎn)量為0.80 g/g;而1 mol葡萄糖通過EMP途徑產(chǎn)生4/3 mol丙酸和2/3 mol乙酸,理論上丙酸產(chǎn)量為0.55 g/g[13]。但由于甘油發(fā)酵會出現(xiàn)氧化還原失衡,導(dǎo)致細胞生長減少和丙酸生成量下降[23],因此,分離株B1在葡萄糖培養(yǎng)基中生長狀況較好,并且產(chǎn)生更多的丙酸。

菌株抗生素抗性具有轉(zhuǎn)移風(fēng)險,因此對于具有應(yīng)用潛力的菌株需要評價其抗生素抗性。Suomalainen等[24]評價了P.freudenreichiissp.shermaniiJS和P.freudenreichiisubsp.freudenreichii131的抗生素抗性,結(jié)果顯示菌株對氨芐青霉素、紅霉素、維吉霉素、四環(huán)素、氯霉素、萬古霉素、甲基鹽霉素、桿菌肽敏感;對鏈霉素、慶大霉素和卡那霉素具有抗性。Monika等[25]也發(fā)現(xiàn)菌株P(guān).jensenii對慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素具有抗性,對其他類抗生素都敏感。Derya等[26]發(fā)現(xiàn)29種丙酸桿菌菌株都對萘啶酸(naldixic acid)有抗性,對慶大霉素、卡那霉素、利福平、多粘菌素耐藥性低,對其它抗生素敏感。上述研究結(jié)果表明:丙酸桿菌對卡那霉素等氨基糖苷類抗生素的抗性是厭氧細菌的共同特征,因為它們?nèi)狈毎亟閷?dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)[27]。本研究的費氏丙酸桿菌B1也具有這一特點,但同時也發(fā)現(xiàn)該菌對頭孢呋辛及青霉素也具有抗性,需要進一步分析耐藥機制以及耐藥性轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。

4 結(jié)論

從生牛奶中分離得到一株費氏丙酸桿菌,生長周期大約為120 h,0～36 h為對數(shù)生長期,36 h后趨于穩(wěn)定期。發(fā)現(xiàn)其對葡萄糖的利用率大于對甘油的利用率,在含葡萄糖的培養(yǎng)基中于30 ℃厭氧培養(yǎng)120 h后丙酸產(chǎn)量達到7.38 g/L。該菌株無溶血性,對卡那霉素等氨基糖苷類抗生素有耐藥性,對青霉素和頭孢呋辛也具有抗性,而對氨芐西林、萬古霉素、氯霉素、克林霉素、四環(huán)素敏感。需進一步評價其耐藥基因的轉(zhuǎn)移風(fēng)險。以上初步研究結(jié)果表明丙酸桿菌B1具有潛在的應(yīng)用價值,但在使用之前應(yīng)更全面地評估該菌株的安全性和益生功能。