盧 倩，劉夢(mèng)佳，張令強(qiáng)，鄒麗萍,

1首都醫(yī)科大學(xué)腦重大疾病研究中心，北京腦重大疾病研究院，北京 100069；2解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 兒內(nèi)科，北京 100853；3軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所，蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850

癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為神經(jīng)元異常放電、反復(fù)癇性發(fā)作，全世界約7 000萬的癲癇患者，雖然抗癲癇藥物不斷發(fā)展，但仍然有近1/3的患者發(fā)作難以控制[1]。癲癇病因復(fù)雜，主要包括結(jié)構(gòu)、基因、感染、代謝、免疫和未知原因等[2]。反復(fù)的癲癇發(fā)作不僅對(duì)患者造成嚴(yán)重的傷害，還給其家庭和社會(huì)帶來負(fù)擔(dān)，因此對(duì)于癲癇發(fā)病機(jī)制的研究顯得尤為重要。細(xì)胞內(nèi)的蛋白翻譯后的修飾過程稱為蛋白泛素化，主要由泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)介導(dǎo)。UPS由泛素分子 (ubiquitin，Ub)、泛素激活酶(Ub-activating enzyme，E1)、泛素結(jié)合酶(Ub-conjugating enzymes，E2)、泛素連接酶(Ub ligases，E3)、去泛素化酶 (deubiquitinases，DUBs)等構(gòu)成[3]。UPS參與多種生命過程，如細(xì)胞周期的調(diào)控和發(fā)育、翻譯調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白的降解等[4]。泛素化過程異?？梢砸鸲喾N疾病，最近有文獻(xiàn)報(bào)道蛋白泛素化異常導(dǎo)致癲癇，如UBE3A(ubiquitin-protein ligase E3a)是一種E3，功能缺失可導(dǎo)致Angelman綜合征[5]；Malin是由EPM2B編碼的E3，Malin功能異?？蓪?dǎo)致Lafora疾病[6]；NEDD4-2(neuronal precursor cell expressed developmentally downregulated 4-2)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)吞及離子通道的溶酶體降解，與神經(jīng)元興奮性及癲癇有關(guān)[7]；NEDL2(NEDD4-like ubiquitin protein ligase-2)突變與神經(jīng)發(fā)育落后、癲癇相關(guān)[8]。NEDL1又稱為HECW1，是含有HECT結(jié)構(gòu)域的E3。NEDL1在腦中特異性高表達(dá)，其次是腎，其氨基酸序列在鼠與人中相似度達(dá)到78%[9]。文獻(xiàn)報(bào)道NEDL1與腫瘤及家族性肌萎縮側(cè)索硬化相關(guān)[9-10]。目前尚無NEDL1與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的報(bào)道，我們通過建立Nedl1基因敲除鼠匹魯卡品癲癇模型，研究NEDL1與癲癇的關(guān)系。

對(duì)象與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇C57BL/6小鼠通過Cre-Loxp系統(tǒng)構(gòu)建Nedl1-/-小鼠。第一只Nedl1-/-小鼠來自軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所，我們將Nedl1-/-小鼠和Nedl1+/+小鼠進(jìn)行合籠，產(chǎn)下F1代為雜合型小鼠，再將雜合型小鼠雜交，得到Nedl1-/-小鼠，我們通過對(duì)小鼠尾部提取的DNA進(jìn)行PCT鑒定基因型[11]。小鼠于SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，濕度40% ～ 70%，室溫20℃～ 25℃。所用的墊料、飼料、飲水均經(jīng)過高壓滅菌處理，實(shí)行自由飲食、飲水，墊料每周更換兩次。選擇8周齡的Nedl1+/+小鼠和Nedl1-/-小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。

2 匹魯卡品癲癇模型的制作 選取8周的Nedl1+/+小鼠和Nedl1-/-小鼠。腹腔注射給藥，首先給予2 mg/kg的甲基東莨菪堿(美國Sigma-Aldrich)、硫酸特布他林，主要用于拮抗匹魯卡品導(dǎo)致的周圍膽堿能受體的興奮作用。30 min后腹腔注射鹽酸匹魯卡品(美國Sigma-Aldrich)，劑量為245 mg/kg(經(jīng)過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)得出藥物劑量)。視頻記錄并觀察小鼠的表現(xiàn)。癲癇的發(fā)作嚴(yán)重程度等級(jí)是按照Racine量表進(jìn)行分級(jí)評(píng)估的。Racine[12]癲癇分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：1級(jí)，面部肌肉抽搐，有眨眼、動(dòng)須、節(jié)律性咀嚼等動(dòng)作；2級(jí)，出現(xiàn)點(diǎn)頭的動(dòng)作；3級(jí)，一側(cè)前肢出現(xiàn)陣攣；4級(jí)，雙側(cè)前肢出現(xiàn)陣攣；5級(jí)，失去平衡摔倒。2 h后給予10%水合氯醛控制癲癇發(fā)作，劑量為2 ml/kg。選擇2 h內(nèi)發(fā)作達(dá)3級(jí)以上并且發(fā)作次數(shù)在3次以上，即達(dá)到癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)[13]的小鼠進(jìn)行下面實(shí)驗(yàn)。

3 組織染色 小鼠麻醉后斷頭取出腦組織冠狀切面，常規(guī)Nissl染色，光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞形態(tài)觀察。將腦組織用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋。將5μm后切片脫石蠟，血清封閉，加入一抗NPY(Abcam，1∶100)，加入熒光二抗(熒光標(biāo)記羊抗兔IgG為1∶100)，加入DAPI溶液避光孵育，封片。

4 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以表示，兩樣本均數(shù)的比較，采用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布，使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Image Pro Plus 6.0分析NPY免疫熒光染色，使用GraphPad Prism 6進(jìn)行圖表制作。

結(jié) 果

1 匹魯卡品癲癇模型制作 選擇Nedl1+/+小鼠(28只)和Nedl1-/-小鼠(17只)進(jìn)行匹魯卡品癲癇模型制作，腹腔給藥后幾分鐘，小鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少，尾巴伸直、點(diǎn)頭、腹部貼地爬行、全身抖動(dòng)，偶爾出現(xiàn)陣攣發(fā)作。通過對(duì)不同基因型的小鼠癲癇模型后2 h發(fā)作情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。癲癇發(fā)作等級(jí)：Nedl1-/-小鼠癲癇發(fā)作等級(jí)顯著低于Nedl1+/+小鼠(3.40±0.36 vs 3.90±0.16)(P=0.000)；2 h內(nèi) 3級(jí)及以上癲癇發(fā)作的次數(shù)：Nedl1-/-小鼠癲癇發(fā)作次數(shù)顯著少于Nedl1+/+小鼠(13.05±7.84 vs 20.00±8.47)(P=0.004)；首次出現(xiàn)3級(jí)以上發(fā)作的時(shí)間：Nedl1-/-小鼠所用時(shí)間明顯長于Nedl1+/+小鼠(42.23±15.48 vs 24.4±17.06)(P=0.016)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。癲癇模型后Nedl1-/-小鼠全部存活，而Nedl1+/+小鼠死亡13只(46.4%)(圖1)。

圖1 視頻統(tǒng)計(jì)不同基因型小鼠癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度[Nedl1-/-組n=17； Nedl1+/+組n=15 (A、B、C)， Nedl1+/+組n=28 (D). aP＜0.05]A：Racine等級(jí)； B：2 h內(nèi)3級(jí)及3級(jí)以上發(fā)作的次數(shù)； C：首次出現(xiàn)3級(jí)及以上癲癇發(fā)作的時(shí)間； D：死亡情況Fig. 1 Video statistics of the severity of seizures in mice (n[Nedl1-/-]=17; A-C: n[Nedl1+/+]=15; D: n[Nedl1+/+]=28. aP＜0.05)A: the grading of seizures using Racine scale; B: the number of seizures at stage 3-5 (Racine scores) in 2 hours; C: the time interval of status epilepticus (SE); D: mortality rate of epileptic model

圖2 癲癇模型建模后1個(gè)月Nedl1+/+小鼠和Nedl1-/-小鼠海馬Nissl染色結(jié)果(n=3)A ～ D： Nedl1+/+未造模組； E ～ H： Nedl1-/-未造模組； I ～ L： Nedl1+/+癲癇模型后1個(gè)月； M ～ P： Nedl1-/-癲癇模型后1個(gè)月； Q： 癲癇模型后1個(gè)月兩組海馬各個(gè)區(qū)域細(xì)胞計(jì)數(shù)； R ～ S： 未造模和癲癇模型后1個(gè)月在海馬CA1、 DG區(qū)細(xì)胞計(jì)數(shù)Fig. 2 Nissl staining results in hippocampus of Nedl1+/+ mice and Nedl1-/- mice at 1 month after establishing the epileptic model (n=3)A-D: Unmodeled Nedl1+/+ mice; E-H: Unmodeled Nedl1-/- mice; I-L: Nedl1+/+ mice 1 month after the epileptic model; M-P: Nedl1-/- mice 1 month after establishing the epileptic model; Q: cell counts of the hippocampus in the two groups 1 month after the epilepsy model;R-S: cell counts in CA1, DG area of hippocampus between unmodeled and epilepsy model; aP＜0.05

2 癲癇模型后小鼠腦組織Nissl染色比較 選擇未造模及癲癇模型后1個(gè)月的Nedl1+/+小鼠和Nedl1-/-小鼠各組3只，取腦組織進(jìn)行Nissl染色。癲癇模型后1個(gè)月，低倍鏡下觀察(40×)見Nedl1+/+小鼠與Nedl1-/-小鼠海馬區(qū)域整體結(jié)構(gòu)無明顯差異；高倍鏡下觀察(400×)可見Nedl1+/+小鼠CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)細(xì)胞著色增加，細(xì)胞排列紊亂，并且DG區(qū)的細(xì)胞明顯固縮，細(xì)胞形態(tài)改變。癲癇模型后1個(gè)月，Nedl1+/+小鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于Nedl1-/-小鼠(P=0.03)，并且較未造模時(shí)期明顯減少(P=0.01)。癲癇模型后1個(gè)月，Nedl1+/+小鼠及Nedl1-/-小鼠海馬CA3區(qū)、DG區(qū)細(xì)胞計(jì)數(shù)無明顯差異，與未造模時(shí)期相比無明顯變化(P＞0.05)(圖 2)。

3 癲癇模型后小鼠腦組織NPY免疫熒光染色比較癲癇模型后1個(gè)月Nedl1+/+小鼠與Nedl1-/-小鼠(各3只)海馬NPY(表示苔蘚纖維發(fā)芽情況)免疫熒光染色比較，CA3區(qū)雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.36)，但是Nedl1-/-小鼠免疫熒光明顯較Nedl1+/+小鼠弱。在DG區(qū)，Nedl1+/+小鼠免疫熒光染色較Nedl1-/-小鼠明顯增多(P=0.03)，并且在海馬上齒狀回上顆粒層出現(xiàn)NPY免疫熒光，Nedl1+/+小鼠苔蘚纖維發(fā)芽較Nedl1-/-小鼠明顯(圖3)。

圖3 癲癇模型后1個(gè)月海馬NPY免疫熒光染色(n=3)A、 C、 E： Nedl1+/+癲癇模型建模后1個(gè)月； B、 D、 F：Nedl1-/-癲癇模型后1月； G ～ H：兩組海馬CA3區(qū)和DG區(qū)NPY免疫熒光比較Fig. 3 NPY immuno fl uorescence staining results in hippocampus of Nedl1+/+ mice and Nedl1-/- mice at 1 month after establishing the epileptic model (n=3)A, C and E: Nedl1+/+ mice 1 month after establishing the epileptic model; B, D and F: Nedl1-/- mice 1 month after establishing the epileptic model; G-H: NPY immuno fl uorescence in the CA3 and DG of the hippocampus between Nedl1+/+ and Nedl1-/- (aP＜0.05. Arrows on the granular layer of the dentate gyrus NPY immunofluorescence indicates mossy fi ber sprouting conditions)

討 論

Nakagawara[14]在神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)NEDD4 E3同源的基因KIAA0322，由于該基因編碼的蛋白有N端的C2區(qū)域、兩個(gè)WW區(qū)域和C端的HECT結(jié)構(gòu)域，因此將這個(gè)新發(fā)現(xiàn)的基因命名為NEDL1。NEDL1在神經(jīng)系統(tǒng)特異性高表達(dá)，目前對(duì)NEDL1研究較少，主要集中在腫瘤方面和肌萎縮側(cè)索硬化癥。我們課題組前期通過對(duì)Nedl1+/+小鼠與Nedl1-/-小鼠腦、腎、心臟、肌肉、肝、脾等組織H&E染色比較，發(fā)現(xiàn)兩組無明顯差異，提示NEDL1并不影響小鼠生存[11]。

本研究中應(yīng)用NEDL1基因敲除小鼠，建立匹魯卡品癲癇模型，文獻(xiàn)中關(guān)于匹魯卡品使用的劑量沒有明確的規(guī)定，單次腹腔給藥劑量從175 mg/kg到400 mg/kg不等，小鼠未達(dá)到SE狀態(tài)或死亡率差異較大，有文獻(xiàn)報(bào)道175 mg/kg的藥物劑量死亡率約25%，而也有文獻(xiàn)報(bào)道400 mg/kg的藥物劑量未達(dá)到SE狀態(tài)或死亡率為70%[15-16]。我們經(jīng)過前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)劑量過大會(huì)導(dǎo)致死亡率較高，因此選擇245 mg/kg的匹魯卡品藥物劑量進(jìn)行試驗(yàn)。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Nedl1+/+小鼠癲癇發(fā)作次數(shù)、發(fā)作等級(jí)及死亡率均較Nedl1-/-小鼠嚴(yán)重，并且發(fā)現(xiàn)癲癇模型后Nedl1+/+小鼠海馬CA1及DG區(qū)神經(jīng)元改變明顯，Nedl1+/+小鼠海馬DG區(qū)苔蘚纖維發(fā)芽明顯。

NPY是由36個(gè)氨基酸組成的肽類，在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的GABA能中間神經(jīng)元中廣泛表達(dá)[17-18]。NPY免疫反應(yīng)性以及相對(duì)應(yīng)的Y2受體在顳葉癲癇患者的海馬表達(dá)增加，在反復(fù)癲癇發(fā)作的嚙齒動(dòng)物腦中表達(dá)也增加[19]。在海馬齒狀回上顆粒層的NPY表達(dá)可以反映苔蘚纖維發(fā)芽[20]。Borges等使用CF1小鼠并建立匹魯卡品癲癇模型，全部CF1小鼠在癲癇31 d時(shí)在海馬上齒狀回上顆粒層出現(xiàn)NPY的表達(dá)，反映苔蘚纖維發(fā)芽情況。我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)癲癇1個(gè)月后Nedl1+/+小鼠NPY免疫熒光較Nedl1-/-小鼠強(qiáng)，并且在Nedl1+/+小鼠齒狀回上顆粒層發(fā)現(xiàn)有NPY熒光染色，說明Nedl1+/+小鼠苔蘚纖維發(fā)芽情況較Nedl1-/-小鼠嚴(yán)重，加重癲癇的發(fā)作。

p53是具有多種功能的蛋白，其可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、DNA修復(fù)及自噬，文獻(xiàn)報(bào)道p53過度表達(dá)可致海馬神經(jīng)元死亡[21-22]。長期顳葉癲癇患者海馬的p53水平升高[23]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)p53缺乏小鼠癲癇模型皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元死亡減輕，p53抑制劑可減輕癲癇后神經(jīng)元死亡[24-25]。NEDL1可增強(qiáng)p53的轉(zhuǎn)錄活性及促凋亡功能，在腫瘤中發(fā)揮重要作用。本研究中Nedl1基因敲除小鼠匹魯卡品模型癲癇發(fā)作及腦組織病理改變程度均較Nedl1+/+小鼠輕，可能為Nedl1基因敲除后，p53表達(dá)減低，因此癲癇發(fā)作時(shí)神經(jīng)元損害減少，癲癇發(fā)作減輕。本研究為控制癲癇發(fā)作提供了新思路，將來仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。