張康逸，楊 妍，康志敏*

（河南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，鄭州 450008）

青麥仁是由已經(jīng)長飽滿但未成熟的小麥粒速凍而成，幾乎保留了青麥中全部的天然營養(yǎng)成分，以淀粉為主，并含有阿魏酸、黃酮類化合物等多種抗腫瘤、抗氧化等生物活性成分[1-2]。河南省作為小麥的主產(chǎn)省份，每年向市場提供的商品小麥占全國產(chǎn)量的1/3。全谷物中阿魏酸的含量較高[3]，從青麥仁中提取分離阿魏酸，并研發(fā)具有保健作用的功能性產(chǎn)品，不但能增加青麥仁的經(jīng)濟價值，并且可以使我國種植面積豐富的小麥作物得以充分的開發(fā)和利用。

阿魏酸作為國際公認的天然抗氧化劑，是一種存在于植物細胞壁中的酚酸，具有清除氧自由基、降血脂、抗血小板聚集和血栓形成、抗突變、防癌及增加免疫等生理功能[4-5]，在食品、保健品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域都有廣泛的應用[6-7]。阿魏酸還是天然、安全的自由基淬滅劑和抗氧化劑，幾乎無毒性作用。清除DPPH自由基、羥自由基、ABTS自由基、超氧陰離子的能力及還原能力是評價某種物質(zhì)抗氧化活性的常用指標[8-9]。近年來，國際上常見的抗氧化劑多為人工合成酚類物質(zhì)，如BHT（2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚）、TBHQ（特丁基對苯二酚）和BHA（丁基羥基茴香醚）等，但由于毒性和致癌作用，BHA和BHT已被相關(guān)機構(gòu)限制使用[10]。因此，尋找安全無毒副作用的天然抗氧化劑是目前的研究熱點。

阿魏酸的提取方法主要包括：有機溶劑法、堿法、微波輔助提取法及超聲輔助提取法等[11-12]，其中超聲輔助提取法利用其產(chǎn)生的機械振動、空化效應、熱效應等物理作用粉碎植物細胞壁，能夠增加細胞壁通透性從而縮短提取時間提高效率，已被廣泛應用于許多領(lǐng)域，尤其是醫(yī)藥行業(yè)的中藥提取[13]。由于青麥仁中的阿魏酸主要通過酯鍵與細胞壁多糖和木質(zhì)素交聯(lián)結(jié)合，因此本研究首先采用淀粉酶和蛋白質(zhì)酶對青麥仁中的淀粉和蛋白質(zhì)進行酶解，然后采用超聲輔助堿醇提取青麥仁中的阿魏酸，優(yōu)化提取條件儀器獲得較高產(chǎn)率和純度的阿魏酸，并通過DPPH自由基、羥自由基、ABTS自由基、超氧陰離子及還原能力等五項指標對青麥仁中阿魏酸的抗氧化能力進行評估，進一步了解其抗氧化活性，以期為天然抗氧化劑的研究及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

青麥仁 （河南省農(nóng)科院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所提供），阿魏酸、堿性蛋白酶（20萬 u/g）：上海源葉生物科技有限公司；α-淀粉酶（4萬 u/mL）：江蘇銳陽生物科技有限公司；DPPH （1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS+（3-乙基苯并噻唑磷）：阿拉丁試劑公司。鹽酸、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅、甲基紅、溴甲酚綠、95%乙醇、硼酸等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 實驗儀器

紫外可見分光光度計：上海翱藝儀器有限公司；全自動凱氏定氮儀：海能儀器；自動旋光儀：上海精密科學儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；恒溫水浴鍋：精騏有限公司；常溫低速離心機：安徽嘉文儀器設備有限公司；超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；多功能粉碎機：上海兆申科技有限公司。

1.2 阿魏酸的制備工藝流程

1.2.1 工藝流程

青麥仁→干燥后粉碎→淀粉酶、蛋白酶預處理→滅酶→堿醇法提取→離心、調(diào)pH，定容→靜置1h→分光光度測定

1.2.2 淀粉酶和蛋白酶預處理

準確稱取10 g制備好的青麥仁粉，加入100 mL蒸餾水，加入一定量的α-淀粉酶，放入70℃水浴鍋中反應30 min。待溫度降至50℃，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9，加入一定量的堿性蛋白酶，水解2 h。加熱至100℃滅酶10 min?？焖俳禍睾?000 r/min離心20 min，將用蒸餾水沖洗2次后的沉淀物放入80℃烘箱中，即為去除淀粉和蛋白的粗纖維，待測備用。

1.2.3 淀粉含量的測定

采用旋光測定法檢測[14]。準確稱取2.5 g青麥仁粉于燒杯中，加入50 mL 1%鹽酸溶液，輕搖混勻后將燒杯置于沸水浴中，加熱15 min即刻取出降至室溫。加入1 mL 30%硫酸鋅溶液，震蕩后再加入1mL 15%亞鐵氰化鉀溶液，稀釋定容至100 mL，用旋光儀檢測。按照下列公式（1）計算：

式中：α為測得的旋光度；[α]D20為淀粉的比旋光度；L為旋光管長度,dm；W為樣品重量，g。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量的測定

采用凱氏定氮法檢測[15]。稱取1.5 g青麥仁粉放入消化管中，依次加入凱氏定氮催化片和10 mL濃硫酸，設置不同溫度和時間進行消化。待冷卻至100℃后進行滴定，設置樣品質(zhì)量和空白體積，硼酸15 mL，稀釋液10 mL，堿液40 mL，蒸餾時間5 min，所得結(jié)果即為蛋白質(zhì)含量（質(zhì)量分數(shù)）。

1.3 分光光度法測定阿魏酸

1.3.1 制定阿魏酸標準曲線

精確稱取阿魏酸標準樣品10 mg，用95%乙醇定容至100 mL，再逐個加入蒸餾水配置質(zhì)量濃度分別為 0.001 mg/mL、0.002 mg/mL、0.003 mg/mL、0.004 mg/mL的一系列標樣溶液，使用紫外分光光度計于322 nm處測定吸光值，阿魏酸標準曲線為y=0.1258+64x，R2=0.9923，標準曲線如圖 1。

式中：y為吸光度；x為阿魏酸溶液濃度。

1.3.2 青麥仁中阿魏酸的測定

將上述1.2提取工藝中制備的待測品5 mL稀釋至10 mL，加入9 mL 95%乙醇中，混勻，用紫外分光光度計于322 nm處測定吸光值，進行3次平行測定，利用標準曲線計算阿魏酸的提取量。

1.4 提取工藝的單因素實驗

1.4.1 料液比對阿魏酸提取量的影響

圖1 阿魏酸標準曲線

稱取預處理的青麥仁粉10 g，在堿液質(zhì)量濃度為4 g/100 mL，溫度為60℃，堿醇比為2:1，超聲功率為 240 W 的條件下，選擇 1:10、1:15、1:20、1:25、1:30（w/v）的料液比，提取30 min，測定阿魏酸提取量。

1.4.2 超聲溫度對阿魏酸提取量的影響

稱取預處理的青麥仁粉10g，在堿液濃度為4 g/100 mL，料液比為 1:15（w/v），堿醇比為 2:1(v/v)，超聲功率為 240 W 的條件下， 選取 40、50、60、70、80℃5個不同溫度，提取30 min，測定阿魏酸提取量。

1.4.3 堿醇比對阿魏酸提取量的影響

稱取預處理的青麥仁粉10 g，在堿液濃度為4 g/100 mL，料液比為1:15，溫度為60℃，超聲功率為240 W 的條件下， 選擇 1:1、1:2、2:1、1:3、3:1 (v/v)5個不同的堿醇比，提取30 min，測定阿魏酸提取量。

1.4.4 超聲時間對阿魏酸提取量的影響

稱取預處理的青麥仁粉10 g，在堿液濃度為4g/100 mL，料液比為 1:15（w/v），溫度為 60 ℃，堿醇比為 2:1， 超聲功率為 240 W， 選擇 15、30、45、60、75 min不同超聲時間提取，測定阿魏酸的提取量。

1.4.5 NaOH濃度對阿魏酸提取量的影響

稱取預處理的青麥仁粉10 g，在料液比為1:15（w/v），溫度為 60 ℃，堿醇比為 2:1(v/v)，超聲功率為240 W 的條件下， 選擇 0.5、1、2、4、8 g/100 mL 不同堿液濃度，提取45 min，測定阿魏酸的提取量。

1.4.6 超聲功率對阿魏酸提取量的影響

稱取預處理的青麥仁粉10 g，在堿液濃度為4g/100 mL，堿醇比為 2:1，料液比為 1:20（w/v），溫度為60 ℃條件下，選擇 360、420、480、540、600 W 不同超聲功率，提取45 min，測定阿魏酸的提取量。

1.5 超聲輔助堿醇提取青麥仁中阿魏酸的正交試驗

在上述單因素實驗結(jié)果的基礎上，選擇對阿魏酸提取量影響較大的四個主要因素：超聲溫度（A）、NaOH 質(zhì)量濃度（B）、堿醇比（C）、超聲功率（D）采用L9（34）進行正交實驗設計，各組實驗重復3次，確定最佳工藝參數(shù)。正交試驗設計見表1。

表1 正交試驗因素水平

1.6 體外抗氧化能力測定

1.6.1 DPPH自由基清除率檢測

參照文獻16的方法，取2 mL（0.1 mol/L）的DPPH溶液分別加入不同濃度的待測提取液入試管中，充分混合后避光反應20 min，于517 nm處測定吸光度Ai；以無水乙醇代替 DPPH，測吸光度Aj；空白組以蒸餾水代替待測液，測吸光度A0。以Vc為陽性對照，各組均重復測3次，按以下公式取平均值計算清除率 I。

1.6.2 羥 除率的檢測

取濃度的待測提取液，依次加入2 mL（6 m亞鐵、2 mL（6 mol/L）H2O2，混勻后靜置10加入2 mL（6 mol/L）水楊酸，混勻后靜置510 nm處測吸光值Ai。以蒸餾水代替水 值Aj，空白對照以2 mL蒸餾水代替青 取液吸光值A0。以Vc為陽性對照，各組 次，按以下公式取平均值計算清除率 E。

1.6.3 ABTS自由基清除率的檢測

將 ABTS（7 mol/L）與 K2S2O8（2.45 mol/L）按 1:1比例混合，密封后避光靜置過夜，用無水乙醇稀釋40～50倍，調(diào)整混合液吸光值734 nm下在0.68～0.72之間。取25 μL待測提取液與2 mL ABTS工作液混合振蕩10 s，室溫靜置5 min后于734 nm下檢測吸光值Ai，以無水乙醇代替待測提取液作為空白對照，測吸光值A0。以Vc為陽性對照，各組均重復測3次，按以下公式取平均值計算清除率W。

1.6.4 超氧陰離子清除率的測定

2 結(jié)果與分析

2.1 α-淀粉酶的用量測定

由圖2可知，隨著淀粉酶添加量的增加，青麥仁粉中的淀粉含量呈下降趨勢，當?shù)矸勖负繛?.04 mL時，青麥仁粉中淀粉的含量 （質(zhì)量分數(shù)）為8.56%；當加酶量超過0.04 mL時，隨著加酶量的增加，淀粉酶的含量變化趨于平緩。

圖2 淀粉酶添加量對酶解效果的影響

2.2 蛋白酶的用量測定

由圖3可知，隨著蛋白酶添加量的增加，青麥仁粉中的蛋白質(zhì)含量逐漸減少。當?shù)鞍酌赣昧繛?.1 g時，青麥仁粉中的蛋白質(zhì)含量 （質(zhì)量分數(shù)）降至10.87%，當?shù)鞍酌柑砑恿砍^0.1 g時，蛋白質(zhì)含量的變化不大。

圖3 蛋白酶添加量對酶解效果的影響

2.3 單因素實驗

2.3.1 料液比對阿魏酸提取量的影響

由圖4可知，當料液比低于1:15（w/v）時，阿魏酸的提取量隨著料液比的增加迅速增高；但當料液比高于1:15（w/v）時，阿魏酸的提取量則逐漸下降。因為阿魏酸在青麥仁中是以酯鍵與細胞壁多糖和木質(zhì)素交聯(lián)的，適量的堿液可破壞酯鍵，加速溶解分離阿魏酸，但堿液量過大易導致其它可溶物析出，造成阿魏酸提取率的降低，不利于后期分離。因此，選擇1:15（w/v）為最佳料液比。

圖4 料液比對阿魏酸提取量的影響

2.3.2 超聲溫度對阿魏酸提取量的影響

由圖5可知，隨著溫度的升高，阿魏酸的提取量逐漸增加，并于80℃時達到最大值，繼續(xù)升高溫度其提取量明顯下降。因為阿魏酸不耐高溫，當溫度高于80℃，一方面由于釋放的阿魏酸會被中和，另一方面體系中的阿魏酸因熱作用使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變或與其他物質(zhì)化合，造成溶液中阿魏酸活性降低[17]。也有可能是溫度過高導致反應液粘度增加，造成阿魏酸提取困難。因此，選擇80℃為最佳超聲提取溫度。

圖5 超聲溫度對阿魏酸提取量的影響

2.3.3 堿醇比對阿魏酸提取量的影響

由圖6可知，當堿醇比低于2:1(v/v)時，未能充分游離釋放出細胞壁中酯鍵交聯(lián)的阿魏酸，故而提取量不高；但堿醇比過高，使得提取時發(fā)生皂化反應并增加提取液粘度，使得阿魏酸未能及時溶解于乙醇中，用乙酸乙酯萃取時易發(fā)生乳化現(xiàn)象，造成阿魏酸提取量降低。因此，選擇2:1(v/v)為最佳堿醇比。

圖6 堿醇比對阿魏酸提取量的影響

2.3.4 超聲時間對阿魏酸提取量的影響

由圖7可知，當提取時間為45 min時得到的阿魏酸提取量最高。但隨著時間的延長，超聲波產(chǎn)生的空化效應作用力減弱，使得青麥仁表面對阿魏酸的吸附力增強，進而降低阿魏酸的提取量；另一方面，因時間延長使得阿魏酸暴露在空氣中被氧化分解，造成阿魏酸的提取量逐漸降低。因此，選擇45 min為最佳提取時間。

圖7 超聲時間對阿魏酸提取量的影響

2.3.5 NaOH堿液濃度對阿魏酸提取量的影響

由圖8可知，當 NaOH堿液濃度為4 g/100 mL時，堿液可破壞交聯(lián)的酯鍵，使阿魏酸釋放游離，得到的阿魏酸提取量為最高值；但隨著 NaOH堿液濃度的逐漸增加，青麥仁中的纖維素發(fā)生水解作用影響阿魏酸的提??；另外，堿液濃度的升高造成提取液粘度也隨之增大、過濾、離心效果均不佳，造成其提取量明顯降低。因此，選擇4 g/100 mL為最佳NaOH堿液濃度。

圖8 堿液濃度對阿魏酸提取量的影響

2.3.6 超聲功率對阿魏酸提取量的影響

由圖9可知，超聲功率在360～480 W之間，隨著超聲功率的增加，阿魏酸提取量逐漸增加；當超聲功率高于480 W時，導致阿魏酸不穩(wěn)定而發(fā)生分解，使得其提取量開始下降。因此，選擇480 W為最佳超聲功率。

圖9 超聲功率對阿魏酸提取量的影響

2.4 阿魏酸提取工藝正交優(yōu)化

由以上單因素實驗結(jié)果作為參考，選取4個影響較大的因素：提取溫度（A）、NaOH 堿液濃度（B）、堿醇比（C）、超聲功率（D）4 個因素，采用四因素三水平L9（34）進行正交實驗設計，每個實驗重復3次，以阿魏酸提取量為指標，確定最佳工藝，結(jié)果見表2所示。

表2 正交試驗設計及結(jié)果

從表2中 R值可以看出，各因素影響顯著程度大小為：A＞B＞D＞C，最佳組合為 A2B2C1D1，即提取溫度80℃、NaOH堿液濃度6 g/100 mL、堿醇比1:2(v/v)、超聲功率480 W。在最優(yōu)組合條件下進行3次平行驗證實驗，阿魏酸提取量為（2.85±0.15）mg/g青麥仁粉。

3 結(jié)論與討論

本實驗采用超聲輔助堿醇法提取青麥仁中的阿魏酸，首先采用淀粉酶和蛋白質(zhì)酶去除青麥仁中的淀粉和阿魏酸時，酶解2.5 g青麥仁需用 α-淀粉酶0.04 mL，可使淀粉含量百分數(shù)降至8.56%；堿性蛋白酶的用量為0.1 g時，蛋白質(zhì)含量百分數(shù)降至10.87%。超聲輔助堿醇最佳提取工藝參數(shù)為提取溫度80℃、NaOH堿液濃度6 g/100 mL、堿醇比1:2、超聲功率480 W的條件下，提取量可達（2.85±0.15）mg/g。此工藝條件可用于以青麥仁為原料制備天然阿魏酸。