1 深圳蘭度生物材料有限公司 （廣東 深圳 518107）

2 廣東省醫(yī)用高分子植入材料工程技術(shù)研究中心 （廣東 深圳 518107）

內(nèi)容提要：開發(fā)了一種快速準(zhǔn)確檢測脫細(xì)胞基質(zhì)類產(chǎn)品中有機(jī)溶劑殘留的頂空氣相色方法，即先將脫細(xì)胞基質(zhì)類待測樣品在密閉的頂空瓶中用1mol/L硫酸在75℃下完成酸解，然后再用靜態(tài)頂空氣相色譜法檢測其中的有機(jī)溶劑殘留量，并對該檢測方法進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明，正己烷與丙酮分離度良好，正己烷和丙酮分別在0.5～100μg/5mL與5.0～1000μg/5mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.9997和0.9995，定量限分別為0.5μg/5mL與4.0μg/5mL，回收率為93.9%～102.01%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.55%～2.89%。該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，適用于脫細(xì)胞基質(zhì)類醫(yī)療器械產(chǎn)品中有機(jī)溶劑殘留的檢測分析。

近年來，由于脫細(xì)胞基質(zhì)類產(chǎn)品獨(dú)特的生物相容性與生物活性，越來越多的脫細(xì)胞基質(zhì)類產(chǎn)品被廣泛應(yīng)用于臨床各個(gè)科室如皮膚或燒傷科、口腔科、神經(jīng)外科、疝外科、整形美容科等[1]。在脫細(xì)胞產(chǎn)品制備過程中會(huì)使用到酮類如丙酮或烷烴類如正己烷等有機(jī)溶劑[2]。目前為止，國內(nèi)外還沒有關(guān)于脫細(xì)胞基質(zhì)類產(chǎn)品中有機(jī)溶劑殘留量的檢測方法或標(biāo)準(zhǔn)，也鮮有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以一定濃度的硫酸作為介質(zhì)，將脫細(xì)胞基質(zhì)類產(chǎn)品完全酸解后采用頂空氣相色譜法檢測該產(chǎn)品中的有機(jī)溶劑殘留量，該方法準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，能夠?yàn)樵擃惍a(chǎn)品中有機(jī)溶劑殘留量檢測提供參考依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890B氣相色譜儀配FID檢測器、Agilent7697A頂空進(jìn)樣器（美國Agilent公司），SGH-3000高純氫發(fā)生器配SGK-2LB低噪音空氣泵（北京東方精華苑科技有限公司）。

正己烷標(biāo)準(zhǔn)品（GC級(jí)，阿拉?。獦?biāo)準(zhǔn)品（GCS，沃凱），硫酸（AR，國藥），N,N-二甲基甲酰胺（DMF，GC級(jí)，阿拉?。瑢?shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備的超純水。脫細(xì)胞基質(zhì)待測樣品由深圳蘭度生物材料有限公司提供（包括有機(jī)溶劑處理與未用有機(jī)溶劑處理兩種樣品）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別準(zhǔn)確稱取適量的正己烷與丙酮標(biāo)準(zhǔn)品與50mL容量瓶中，用DMF定容至刻度，配制成正己烷質(zhì)量濃度為1000mg/mL，丙酮質(zhì)量濃度為10000mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)液，于4℃冰箱儲(chǔ)存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用DMF分別稀釋2倍、10倍、100倍，配制成三種不用濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。然后取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液加入到含5mL 1mol/L硫酸溶液的20mL頂空瓶中，密封，制備成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 樣品前處理

稱取適量脫細(xì)胞基質(zhì)待測樣品，剪碎后加入到20mL頂空瓶中，加入5mL 1mol/L硫酸溶液，密封，置于75℃烘箱中至樣品完全酸解后，冷卻至室溫，待測。

1.2.3 加樣回收率樣品的制備

稱取適量未用有機(jī)溶劑處理的脫細(xì)胞基質(zhì)待測樣品，剪碎后加入到100mL藍(lán)蓋瓶中，并按照1.3中比例加入適量1mol/L硫酸溶液，置于75℃烘箱中至樣品完全酸解后，冷卻至室溫，作為加樣回收率樣品的空白基底，取5mL空白基底溶液加入到20mL頂空瓶中，并加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，密封，配制成待測的加樣回收率樣品。

1.3 頂空-氣相色譜條件

頂空條件：頂空平衡溫度80℃，定量環(huán)溫度100℃，傳輸線溫度105℃，進(jìn)樣時(shí)間0.5min，定量環(huán)1mL。

氣相色譜條件：色譜柱HP-5毛細(xì)管柱（30m×0.32mm×0.25μm），進(jìn)樣口溫度250℃，F(xiàn)ID檢測器溫度260℃，柱溫40℃保持6min，載氣N2，柱流量2mL/min，氫氣流量30mL/mL，空氣流量400mL/min，分流比20:1。

2.結(jié)果與討論

2.1 酸解介質(zhì)的選擇

正己烷不溶于水，在15.5℃的水中的飽和溶解度僅為0.014%，即140μg/mL，5mL水中最多可溶解700μg。參考藥典規(guī)定，產(chǎn)品中正己烷的殘留量應(yīng)低于0.029%（290μg/g），控制待測樣品取樣量完全可以將頂空瓶中的正己烷總量控制在正己烷的溶解范圍下，因此可以直接采用無機(jī)酸溶液進(jìn)行樣品酸解的前處理?？紤]對色譜柱與檢測器的保護(hù)，應(yīng)采用高沸點(diǎn)的，難揮發(fā)的酸進(jìn)行樣品酸水解處理。本研究采用一定濃度的硫酸溶液，在硫酸濃度的選擇上兼顧酸解時(shí)間與測試儀器的損傷風(fēng)險(xiǎn)。本研究嘗試了高于2mol/L硫酸能在75℃溫度下能短時(shí)間內(nèi)（1h）將樣品酸解，但是濃度高對色譜柱與儀器的損害風(fēng)險(xiǎn)越高。而低于0.75mol/L硫酸需要較長時(shí)間（4h以上）才能將樣品酸解，在較高溫度下（75℃）時(shí)間長了頂空瓶的氣密性可能會(huì)受到影響。綜合試驗(yàn)后采用1mol/L硫酸溶在75℃下進(jìn)行樣品酸解處理，一般情況下樣品可以在1h完全酸解。

圖1.混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的GC色譜圖

2.2 色譜柱的選擇

根據(jù)《中國藥典》2015版0861溶劑殘留測定法附表2可知正己烷與丙酮能夠在非極性中分析開，因此本研究采用通用的HP-5毛細(xì)管色譜柱對兩種溶劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見圖1，在本實(shí)驗(yàn)條件下，丙酮保留時(shí)間為1.732min，正己烷保留時(shí)間為2.081min，丙酮與正己烷的峰形尖銳且對稱，二者分離度良好，互不干擾，均具有良好的專屬性。

2.3 定量限于檢測限

根據(jù)藥典中規(guī)定，一般以信噪比大于3:1時(shí)對應(yīng)的進(jìn)樣濃度或進(jìn)樣量為檢測限，以信噪比大于10:1時(shí)對應(yīng)的進(jìn)樣濃度或進(jìn)樣量為定量限。本研究分別測試低濃度的丙酮與正己烷的峰面積，利用安捷倫氣相色譜工作站OpenLAB CDS數(shù)據(jù)處理軟件計(jì)算出不同濃度的丙酮與正己烷對應(yīng)的信噪比，結(jié)果顯示，丙酮濃度為2.0μg/5mL時(shí)對應(yīng)信噪比約為9.0，在此濃度下相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.76%，符合精密度要求，確定丙酮的檢測限為2.0μg/5mL。丙酮濃度為4.0μg/5mL時(shí)對應(yīng)信噪比約為18.3，在此濃度下相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為5.69%，符合精密度要求，確定丙酮的定量限為4.0μg/5mL。正己烷濃度為0.2μg/5mL時(shí)對應(yīng)信噪比約為13，對應(yīng)峰高小于0.5，能夠定性檢測出正己烷，且此濃度下相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為4.91%，符合精密度要求，但正己烷濃度再降低，正己烷的峰高與基線難分辨，因此確定正己烷的檢測限為0.2μg/5mL。正己烷濃度為0.5μg/5mL時(shí)對應(yīng)信噪比約為30，在此濃度下相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.9%，符合精密度要求，確定正己烷的定量限為0.5μg/5mL。

表1.正己烷與丙酮的線性范圍、線性方程與相關(guān)系數(shù)

表2.正己烷與丙酮的回收率與精密度(n=5)

表3.正己烷與丙酮的線性范圍、線性方程與相關(guān)系數(shù)(%)

2.4 線性范圍

根據(jù)正己烷與丙酮的定量限，并結(jié)合樣品中正己烷與丙酮的殘留限量要求，設(shè)定合適的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測試范圍，并測試各自范圍內(nèi)濃度與峰面積的線性關(guān)系。分別以良好總有機(jī)溶劑的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，對應(yīng)質(zhì)量濃度（x，μg/5mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表1顯示，在0.5～100μg/5mL范圍內(nèi)，正己烷濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程y=39.906x-3.9191，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.9997；在5.0～1000μg/5mL范圍內(nèi)，丙酮濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.9087x+1.7598，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.9995。

2.5 方法回收率與精密度

采用加標(biāo)回收的方法，即通過在待測樣品（本實(shí)驗(yàn)中為未經(jīng)有機(jī)溶劑處理的脫細(xì)胞基質(zhì)樣品）中分別添加不同水平的有機(jī)溶劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定各自濃度下的回收率與精密度。為了檢測更寬濃度范圍的加樣回收率與精密度，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了3個(gè)加標(biāo)水平，分別為1/10限量、限量與2限量，每個(gè)加標(biāo)水平做5個(gè)平行試驗(yàn)，計(jì)算加樣回收率和精密度。表2為空白脫細(xì)胞基質(zhì)樣品中正己烷與丙酮的平均回收率與精密度，由表2可知，在本實(shí)驗(yàn)條件下，兩種有機(jī)溶劑的加樣回收率為93.9%～102.01%，RSD為1.55%～2.89%。不同加樣濃度下的回收率與精密度均滿足方法學(xué)驗(yàn)證要求。

2.6 方法重現(xiàn)性

取深圳蘭度生物材料有限公司制備的可吸收膠原膜產(chǎn)品（批號(hào)20170601）按照本實(shí)驗(yàn)方法分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測與委托北京醫(yī)療器械檢驗(yàn)所進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如表3所示，不同實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果無顯著性差異，產(chǎn)品中正己烷與丙酮?dú)埩袅繚M足藥典規(guī)定要求，其中北京醫(yī)療器械檢驗(yàn)所檢驗(yàn)報(bào)告編號(hào)為W-W-0512-2019。檢測結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)方法具有良好的重現(xiàn)性。

3.結(jié)論

根據(jù)《中國藥典》2015版規(guī)定，丙酮屬于三類有機(jī)溶劑，對人體或環(huán)境的危害小，產(chǎn)品中殘留量應(yīng)控制在0.5%（5000ppm）以下，正己烷屬于二類控制有機(jī)溶劑，該類有機(jī)溶劑具有神經(jīng)毒性與致畸性，產(chǎn)品中殘留量應(yīng)控制在0.029%（290ppm）以下[3]。同時(shí)《中國藥典》2015版第四部0861溶劑殘留測定法中只規(guī)定了藥品中溶劑殘留測定時(shí)樣品的大致前處理方法與檢測方法。藥品一般可通過研磨成粉末后均勻分散或溶解于水或有機(jī)溶劑介質(zhì)中，因此藥品樣品的前處理相對容易，但是對于脫細(xì)胞基質(zhì)類醫(yī)療器械產(chǎn)品，通常很難研磨成粉末，也很難直接溶解于常用有機(jī)溶劑介質(zhì)中，常用樣品前處理方法是浸提[4,5]。但是浸提一方面存在浸提時(shí)間長，拉長檢測周期，另一方面存在浸提不充分而導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低的風(fēng)險(xiǎn)。按充分釋放殘留溶劑的思路，不能將待測樣品均勻分散或溶解，那可以采用溶劑介質(zhì)在一定條件下分解樣品中使樣品中的殘留溶劑全部釋放，然后用頂空氣相色譜法檢測[6,7]。

本文開發(fā)了一種快速準(zhǔn)確檢測脫細(xì)胞基質(zhì)類產(chǎn)品中溶劑殘留的頂空氣相色方法，即先將脫細(xì)胞基質(zhì)類待測樣品在密閉的頂空瓶中用1mol/L硫酸在75℃下完成酸解，然后再用靜態(tài)頂空氣相色譜法檢測其中的溶劑殘留量。該方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，且靈敏度高，滿足脫細(xì)胞基質(zhì)類產(chǎn)品中溶劑殘留的測試要求，可為今后脫細(xì)胞基質(zhì)類醫(yī)療器械產(chǎn)品中有機(jī)溶劑殘留檢測提供參考依據(jù)。